一種用于平行測(cè)定尿嘧啶-dna糖基化酶和內(nèi)切酶iv活性的方法及其應(yīng)用和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于平行測(cè)定尿喀晚-DNA糖基化酶和內(nèi) 切酶IV活性的方法及其應(yīng)用和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 尿喀晚-DNA糖基化酶(UDG)和內(nèi)切酶IV化ndoiv)都是U堿基移除修復(fù)(U邸R)酶，它 們?cè)诒３只蚪M的完整性上具有重要作用。UDG和EndoIV能在修復(fù)DNA中的U堿基損傷時(shí)發(fā) 揮協(xié)同功能，具體來(lái)講，UDG移除U堿基損傷并產(chǎn)生無(wú)堿基(AP)位點(diǎn)，隨后化doIV切刻該AP位 點(diǎn)。UBE賄每的活性異常將抑制細(xì)胞對(duì)師咸基損傷的響應(yīng)，運(yùn)將導(dǎo)致各種相關(guān)疾病，包括免疫 缺綜合癥，淋己瘤，和布魯姆綜合癥。研究表明，UBER酶的活性已成為上述疾病的一種有前 途的生物標(biāo)志物，并且對(duì)UBE賄每的活性檢測(cè)方法代表一種候選工具用于臨床診斷及其功能 研究。
[0003] UB邸酶活性的常用檢測(cè)方法，包括凝膠電泳法，電化學(xué)法和比色法，分別受到放射 性危害，復(fù)雜的電極修飾過(guò)程，或有限靈敏度的局限。作為另一種選擇，巧光法因其安全和 靈敏的特點(diǎn)而吸引了人們的廣泛關(guān)注。為得到明顯的巧光信號(hào)，已發(fā)展了許多基于標(biāo)記的 巧光策略用于UBE賄每的活性檢測(cè)，得到了令人滿(mǎn)意的結(jié)果。然而，運(yùn)些基于標(biāo)記的巧光策略 需要將巧光團(tuán)或巧滅團(tuán)共價(jià)捕獲到DNA上，導(dǎo)致傳感系統(tǒng)的生物相容性降低并對(duì)UBE賄每的 活性造成不利影響。為解決運(yùn)個(gè)問(wèn)題，一些免標(biāo)記的巧光策略已被報(bào)道用于UBE賄每的活性 檢測(cè)。含師咸基的DNA探針在UDG引發(fā)下能形成G-四倍體(G4)，運(yùn)種探針已被設(shè)計(jì)用于UDG活 性檢測(cè)，并且當(dāng)G4與金屬?gòu)?fù)合物或N-甲基-日h嘟IX(NMM)綁定時(shí)產(chǎn)生免標(biāo)記的巧光信號(hào)。另 夕hMa課題組提出了一種利用G4-選擇性的金屬?gòu)?fù)合物的免標(biāo)記巧光策略實(shí)現(xiàn)了對(duì)EndoIV 的活性檢測(cè)。盡管上述免標(biāo)巧光策略已實(shí)現(xiàn)了對(duì)UDG或化doIV的活性檢測(cè)，但是需設(shè)計(jì)不同 的傳感探針W實(shí)現(xiàn)對(duì)UDG和EndoIV的活性檢測(cè)，運(yùn)增加了探針設(shè)計(jì)的復(fù)雜性。因此，仍需發(fā) 展一種基于同一探針的新型免標(biāo)巧光策略用于平行檢測(cè)UDG和化doIV的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明發(fā)展了一種基于一個(gè)獨(dú)特發(fā)夾探針的新型免標(biāo)記巧光策 略用于平行測(cè)定UDG和EndoIV的活性（Schemel)。設(shè)計(jì)了一個(gè)含師咸基和封閉的引物序列的 雙功能發(fā)夾探針用于目標(biāo)物的識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。具體講，能發(fā)揮作用的RCA引物序列，應(yīng)是 W單鏈形式存在，能與環(huán)狀模板雜交而引發(fā)RCA反應(yīng);而此處封閉的引物序列，是將引物序 列設(shè)計(jì)在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部和頸部中，運(yùn)樣RCA的引物序列就不是W單鏈形式存在，而是有一 部分存在于發(fā)夾頸部的雙鏈結(jié)構(gòu)中，因此也就不能與環(huán)狀模板雜交而引發(fā)RCA反應(yīng)了，即達(dá) 到了封閉RCA引物序列的效果。本發(fā)明的特別之處還在于，目標(biāo)物的識(shí)別方面，運(yùn)個(gè)發(fā)夾探 針既能用作UDG的識(shí)別探針又能用作EndoIV的前體識(shí)別探針。SchemelA(圖9A)闡述了運(yùn)一 策略用于檢巧化DG活性的原理，其中發(fā)夾探針用作UDG識(shí)別探針。UDG存在時(shí)，其識(shí)別探針中 的u堿基被移除，產(chǎn)生一個(gè)AP位點(diǎn)。然后，產(chǎn)生的AP位點(diǎn)被工具酶化doiv切刻，釋放出含自由 3'末端的引物序列。此處自由3'末端的引物序列是指，由于發(fā)夾頸部被切刻，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破 壞，導(dǎo)致原來(lái)存在于發(fā)夾環(huán)部和頸部的RCA引物序列此時(shí)是W單鏈的形式存在，該單鏈的末 端是由于DNA鏈的切刻而產(chǎn)生的3'-OH。）用于引發(fā)隨后的滾環(huán)放大(RCA)反應(yīng)。將產(chǎn)生的探 針與掛鎖模板和T4DNA連接酶共同解育之后，PM29DNA聚合酶和dNTPs的加入能引發(fā)RCA反 應(yīng)。RCA產(chǎn)物具有大量重復(fù)的富含G的序列，它在單價(jià)陽(yáng)離子存在時(shí)能折疊成G4結(jié)構(gòu)。當(dāng)加入 NMM時(shí)，G4和NMM的強(qiáng)烈相互作用能帶來(lái)免標(biāo)的巧光信號(hào)。相反地，當(dāng)無(wú)目標(biāo)物UDG存在時(shí)，引 物序列仍被封閉在發(fā)夾探針中，因此RCA過(guò)程不能進(jìn)行。另外，當(dāng)發(fā)夾探針用作EndoIV的前 體識(shí)別探針，運(yùn)個(gè)策略又能被進(jìn)一步用于化doIV的活性檢測(cè)。如SchemelB(圖9B)所示，利用 工具酶UDG能移除U堿基而產(chǎn)生AP位點(diǎn)的性質(zhì)，含師咸基的EndoIV的前體識(shí)別探針首先被轉(zhuǎn) 換成含AP位點(diǎn)的EndoIV的成熟識(shí)別探針。當(dāng)存在目標(biāo)物EndoIV時(shí)，它能切刻其成熟識(shí)別探 針中的AP位點(diǎn)，釋放出含自由3'末端的引物序列用于引發(fā)RCA反應(yīng)，該過(guò)程與上述UDG活性 檢測(cè)中的RCA過(guò)程是一樣的。由于RCA的信號(hào)放大能力，UDG和化doIV的檢測(cè)限分別低至 0.0001711/1^、0.111]/1^。相對(duì)于它們相應(yīng)的類(lèi)似物，本策略對(duì)1]06和化(1〇1￥也顯示出更好的 選擇性。因此，本策略能提供一種簡(jiǎn)單的方法用于定量UDG和EndoIV的活性，有潛力用于臨 床診斷和它們的協(xié)同功能研究中。
[000引本發(fā)明一方面提供了一種用于平行測(cè)定尿喀晚-DNA糖基化酶和內(nèi)切酶IV活性的 試劑盒，包括:發(fā)夾探針和掛鎖模板;所述發(fā)夾探針包括環(huán)部、頸部，所述頸部連接于環(huán)部的 兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述頸部具有師咸基序列，所述發(fā)夾探針具有設(shè)計(jì)在發(fā)夾結(jié)構(gòu) 的環(huán)部和頸部的RCA的引物序列;所述掛鎖模板具有與自由3'末端的引物序列特異結(jié)合引 發(fā)滾環(huán)放大反應(yīng)的序列。
[0006] 本發(fā)明中"封閉的序列"，是RCA的引物序列，該序列與后續(xù)環(huán)狀模板的一部分序列 是互補(bǔ)的；其次，3 '-OH端存在于每條DNA鏈的一端，此處當(dāng)發(fā)夾頸部被切刻而破壞發(fā)夾結(jié)構(gòu) 后，原本存在于發(fā)夾環(huán)部和頸部的RCA引物序列此時(shí)W單鏈的形式存在，該單鏈的末端是新 形成的3'-OH端。
[0007] 優(yōu)選的，當(dāng)目標(biāo)物為UDG時(shí)，若UDG存在，所述發(fā)夾探針中的U堿基被移除，產(chǎn)生一個(gè) AP位點(diǎn)，產(chǎn)生的AP位點(diǎn)被工具酶EndoIV切刻，釋放出含自由3'末端的引物序列用于引發(fā)隨 后的滾環(huán)放大反應(yīng)RCA;若UDG不存在時(shí)，3 '末端序列被封閉在所述發(fā)夾探針，RCA過(guò)程不能 進(jìn)行；當(dāng)目標(biāo)物為化doIV時(shí)，若化doIV存在，其RCA過(guò)程與上述UDG活性檢測(cè)中的RCA過(guò)程是 一樣的，若化doIV不存在時(shí)，3'末端被封閉在所述發(fā)夾探針，RCA過(guò)程不能進(jìn)行。
[000引優(yōu)選的，
[0009] 所述發(fā)夾探針的序列：
[0010] GTGGTGAGGAGTGAGGTAGGTGGTATAAACTTAGGATCGTGTGGTTUATACCACCTACCTCACTCCTCACCAC；
[0011] 所述掛鎖模板的序列：
[0012] GATCCTAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAACCACACo [0013]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于平行測(cè)定尿喀晚-DNA糖基化酶和內(nèi)切酶IV 活性的方法，包括如下步驟：
[0014] 1)設(shè)計(jì)發(fā)夾探針和掛鎖模板;所述發(fā)夾探針包括環(huán)部、頸部，所述頸部連接于環(huán)部 的兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述頸部具有師咸基序列，所述發(fā)夾探針具有設(shè)計(jì)在發(fā)夾結(jié) 構(gòu)的環(huán)部和頸部的RCA的引物序列;所述掛鎖模板具有與自由3'末端的引物序列特異結(jié)合 引發(fā)滾環(huán)放大反應(yīng)的序列；
[0015] 2)將步驟1)制備的發(fā)夾探針，待檢測(cè)的UDG和相應(yīng)的EndoIV加入到反應(yīng)緩沖液中， 若UDG存在，所述發(fā)夾探針中的U堿基被移除，產(chǎn)生一個(gè)AP位點(diǎn)，產(chǎn)生的AP位點(diǎn)被工具酶 化doIV切刻，釋放出含自由3'末端的引物序列用于引發(fā)隨后的滾環(huán)放大反應(yīng)RCA，獲得巧光 信號(hào);若UDG不存在時(shí)，3 '末端被封閉在所述發(fā)夾探針，RCA過(guò)程不能進(jìn)行，無(wú)巧光信號(hào)產(chǎn)生；
[0016] 3)對(duì)步驟2)中產(chǎn)生巧光信號(hào)的RCA反應(yīng)產(chǎn)物的巧光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，構(gòu)建巧光強(qiáng)度 與UDG濃度之間的線(xiàn)性曲線(xiàn)，對(duì)某一樣品，可通過(guò)測(cè)定樣品的巧光強(qiáng)度，代入線(xiàn)性曲線(xiàn)，計(jì)算 UDG濃度。
[0017] 4)將步驟1)制備的發(fā)夾探針，待檢測(cè)的化doiv和相應(yīng)的UD