活性尿激酶受體的檢測的制作方法
【專利摘要】活性尿激酶受體的檢測。本發(fā)明公開了利用AUCA或其融合蛋白檢測活性uPAR的方法和AUCA或其融合蛋白在制備用于檢測活性uPAR的試劑盒中的應(yīng)用，以及包含AUCA或其融合蛋白的試劑盒。所述檢測方法包括：1)使捕獲試劑與待測樣品在適合于所述捕獲試劑捕獲待測樣品中活性uPAR的條件下接觸，形成捕獲試劑與活性uPAR的復(fù)合物，所述捕獲試劑包括可特異性捕獲活性uPAR的AUCA或其融合蛋白；2)檢測被捕獲的活性uPAR。本發(fā)明的方法具有較好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，其檢測下限達(dá)15ng/L。
【專利說明】
活性尿激酶受體的檢測
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及對活性尿激酶受體的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 尿激酶受體（urokinase type plasminogen acitivator rec邱tor,uPAR)是一種 細(xì)胞表面受體。該受體由Stoppelli等于1985年發(fā)現(xiàn)，1989年Roldan等克隆了該cDNA，1990 年Behremlt等用親和層析法從人淋己瘤細(xì)胞U937的細(xì)胞膜抽提液中純化出該蛋白。在第五 次國際白細(xì)胞分化抗原會議上，uPAR被命名為分化抗原簇87(cluste;r of differentiation 87,CD87)euPAR是一種高度糖基化的表面膜蛋白，廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞 表面，例如激活的嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、激活的T淋己細(xì)胞、巨隧細(xì)胞，W及多種惡性腫 瘤細(xì)胞表面，但是在絕大多數(shù)正常細(xì)胞表面表達(dá)量較低[1-5]。
[0003] UPAR是一種柔性分子，可與多種配體或受體相互作用。如玻連蛋白 (vitronectin)、尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator， uPA)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 l(low density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1)、整聯(lián)蛋白（integrinKG蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor, GPCR)等。運些不同的相互作用在人體多種生理及病理過程中發(fā)揮著廣泛的重要作用，包括 纖溶酶原的激活、細(xì)胞黏附和遷移、細(xì)胞分化、化學(xué)增活現(xiàn)象、趨化因子受體調(diào)節(jié)、免疫應(yīng) 答、炎癥反應(yīng)等[4,6]。證43由^個富含半脫氨酸、大小為81-87個氨基酸的1^76/證4賠吉構(gòu)域 組成（Dl，D2，D3 )，分子量約為55kDaDuPAR通過其C端的糖基化憐脂酷肌醇 (glycosylphosphatidylinositol，GPI)錯定在細(xì)胞膜表面[4,6]。
[0004] 尿激酶受體存在著多種的形式，包括全長的膜受體、不含穿膜區(qū)的可溶性尿激酶 受體(soluble uPAR，suPAR)、W及各種的降解片段。全長的UPAR膜受體易受憐脂酷酶C的水 解，使UPAR從細(xì)胞膜表面脫落，形成不含糖基化憐脂酷肌醇的可溶性尿激酶受體(soluble uPAR，suPAR)。另夕hPAR也對多種水解酶敏感，能夠被進(jìn)一步水解成Dl和D2-D3片段[3]。
[0005] 我們的前期晶體結(jié)構(gòu)研究表明，UPAR通過它的S個結(jié)構(gòu)域形成一個碗狀結(jié)構(gòu)，而 正是運個碗狀結(jié)構(gòu)能高效結(jié)合它的配體uPA[7]，將UPA富集在細(xì)胞表面，而將纖溶酶原激活 為纖溶酶，進(jìn)而對胞外基質(zhì)進(jìn)行降解，在細(xì)胞遷移在發(fā)揮重要作用。同時我們的結(jié)構(gòu)也證明 uPA與uPAR的結(jié)合可大大提高uPAR與玻連蛋白的結(jié)合[8]，而大量的文獻(xiàn)也證明了uPA與 UPAR的結(jié)合對其與整合素相互作用的重要性[6,7]。運些蛋白與其他蛋白如〇曰乂6〇1111等在 病灶局部黏附、積聚，整合素受體啟動細(xì)胞內(nèi)信號，從而將信號從細(xì)胞外傳入細(xì)胞內(nèi)，激活 細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞分裂及細(xì)胞遷移。運種UPAR被定義為活性UPA即7]。只有有活性 的UPAR可進(jìn)行信號的傳導(dǎo)，而與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而其他UPAR片段沒有活性。目 前尚沒有測定活性UPAR的方法。
[0006] 由于UPAR含量與疾病密切相關(guān)，目前市場上有很多針對UPAR的診斷方法，它們主 要是通過雙抗體夾屯、法來進(jìn)行檢測，一般測定的是血液中有活性和非活性的總量suPAR。如 丹麥ViroGates公司推出的檢測suPAR的酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-1 inked immuno sorbent assay ,ELISA)試劑盒-suPA民nostic愈尼通過了歐洲的CE-IVD(體外診斷試劑)認(rèn)證，用于指 導(dǎo)臨床。運種方法是基于總SUPAR在血液中的濃度增高預(yù)示著病人免疫系統(tǒng)被持續(xù)激活 [3]，總SUPAR在血液中的濃度水平也可作為病情進(jìn)展的評定指標(biāo)W及用于病人風(fēng)險狀態(tài)的 臨床決策[9-11]。另外，SUPAR也可用于重癥監(jiān)護(hù)病房病人病情嚴(yán)重程度的篩選W及病人治 療效果的評價[12，13]。具體的，SUPAR的濃度范圍在0.1-4.化g/L表示受檢者為正常，沒有 感染或炎癥反應(yīng);4-6yg/L表明受檢者可能有感染，或免疫系統(tǒng)非正常激活需要進(jìn)一步檢 查；〉6yg/L表明疾病在快速進(jìn)展中，需要嚴(yán)密監(jiān)測W及跟進(jìn)治療。然而目前類似于 SiiPARnosUc皆運些抗體雙夾屯、法檢測到的都是血液內(nèi)多種形式suPAR的總值，無法直接地 檢測血液中活性uPAR的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種活性UPAR的檢測方法。
[000引本
【發(fā)明內(nèi)容】
如下：使用活性uPAR捕獲試劑(active uPAR capture agent,AUCA)或 含有它的融合蛋白捕獲活性uPAR，從而實現(xiàn)對uPAR的檢測。AUCA為尿激酶N末端片段的截斷 體，通過結(jié)構(gòu)分析保留其與UPAR結(jié)合相關(guān)及保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的片段，其序列如SEQ ID NO: 1 所示。與ATF-樣，它能夠特異性結(jié)合活性UPAR的活性口袋，而對無活性UPAR(如Dl和D2D3) 只有相對很弱的結(jié)合。
[0009] 所述活性UPAR捕獲劑AUCA的氨基酸序列如下所示：
[0010] PSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTY HAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLV犯CMVHDCA(SEQ ID N0.1)。
[001。 本發(fā)明中所使用的術(shù)語"uPA"指尿激酶型纖溶酶原激活物。
[0012]本發(fā)明中所使用的術(shù)語"uPAR"指尿激酶型纖溶酶原激活物受體，也可稱為尿激酶 受體。
[OOU]本發(fā)明中所使用的術(shù)語"suPAR"指尿激酶型纖溶酶原激活物受體(UPAR)的可溶形 式。
[0014] 本發(fā)明中所使用的術(shù)語"AUCA"指能夠特異性捕獲活性UPAR的一段蛋白序列，其氨 基酸順序為沈Q ID NO. 1所定義的。AUCA為active uPAR cap 1:ure agent的縮寫。
[0015] 本發(fā)明中所使用的術(shù)語"活性uPAR"是指結(jié)構(gòu)上含S個完整結(jié)構(gòu)域Dl和D2D3、功能 上能夠結(jié)合天然配體UPA和玻連蛋白的uPAR。本文所述的"活性uPAR"包含全長的UPAR膜受 體、不含穿膜區(qū)的可溶性尿激酶受體(SO1 Ub 1 e uPAR，suPAR)，但不包含suPAR的各種降解片 段。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供活性UPAR的檢測方法，該方法包括：
[0017] 1)使捕獲試劑與待測樣品在適合于所述捕獲試劑捕獲待測樣品中活性UPAR的條 件下接觸，形成捕獲試劑與活性UPAR的復(fù)合物；
[001引2)檢測被捕獲的活性uPAR;
[0019] 其中所述捕獲試劑包含AUCA或含有AUCA的融合蛋白。
[0020] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的檢測方法是非診斷目的的，并且是在體外進(jìn)行的。 在優(yōu)選的實施方案中，含有AUCA的融合蛋白是AUCA-HSA融合蛋白。"適合于所述捕獲試劑捕 獲待測樣品中活性uPAR的條件"包括合適的溫度、反應(yīng)時間和溶液等，W避免蛋白質(zhì)變性， 并使捕獲試劑與活性UPAR特異性結(jié)合。合適的條件取決于選擇的具體檢測系統(tǒng)和/或具體 檢測方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于其所掌握的一般知識能夠選擇適合于不同檢測系統(tǒng)和/或 具體檢測方法的條件。
[0021] 可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的具體檢測系統(tǒng)和/或具體檢測方法對被捕獲的活 性UPAR進(jìn)行檢測。所選擇的具體檢測方法可W是異質(zhì)或同質(zhì)測定法。異質(zhì)測定法是包括一 次或多次清洗步驟的測定法，而在同質(zhì)測定法中，此類清洗步驟不是必需的，僅將檢測試劑 和待檢測樣品混合并測量。所述測定方法包括但不限于基于化ISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法） 的測定法、DELFIA(解離增強銅系元素巧光免疫測定法）、SPA(閃爍鄰近測定法）、 Flashplate測定法、FRET(巧光共振能量轉(zhuǎn)移)測定法、TR-FRET(時間分辨巧光共振能量轉(zhuǎn) 移)測定法、FP (巧光偏振)測定法、ALPHA(放大化學(xué)發(fā)光親合均相檢測）、EFC (酶片段互補） 測定法、雙雜交測定法或共免疫沉淀測定法。
[0022] 在進(jìn)一步的實施方案中，在上述活性UPAR的檢測方法中，步驟2)可W包括使所形 成的復(fù)合物與特異性結(jié)合被捕獲的活性UPAR的試劑結(jié)合，并通過檢測所述特異性結(jié)合被捕 獲的活性UPAR的試劑來檢測被捕獲的活性uPAR。
[0023] 在上述測定過程中，可W通過對反應(yīng)體系中所包含的檢測成分的測定來實現(xiàn)對被 捕獲的活性UPAR進(jìn)行檢測。所述檢測成分包括捕獲試劑(例如捕獲試劑中所含有的AUCA或 其融合蛋白）和/或與被捕獲的活性UPAR特異性結(jié)合的試劑。對檢測成分的測定可W通過使 用可檢測的標(biāo)記成分進(jìn)行標(biāo)記并檢測標(biāo)記成分來進(jìn)行?？蓹z測的標(biāo)記成分根據(jù)具體使用的 測定方法而有所不同。本發(fā)明中，可W W多種方式，例如但不限于用生物素、酶、巧光染料 (如FITC、巧光素、羅丹明、切染料或Alexa fluor)，來標(biāo)記檢測成分，也可W使用放射性標(biāo) 記物(如化、32P、35S、i25I或I4C)及常見的酶標(biāo)記物如辣根過氧化物酶和堿性憐酸酶來進(jìn)行 標(biāo)記。例如，可W將標(biāo)記成分標(biāo)記在與被捕獲的活性uPAR特異性結(jié)合的試劑上，通過檢測標(biāo) 記成分實現(xiàn)對被捕獲的活性UPAR的檢測;也可W將成對的標(biāo)記成分中的一個標(biāo)記在捕獲試 劑上，另一個標(biāo)記在與被捕獲的活性UPAR特異性結(jié)合的試劑上，通過成對的標(biāo)記成分之間 的相互作用的檢測實現(xiàn)對被捕獲的活性UPAR的檢測；還可W將標(biāo)記成分標(biāo)記在捕獲試劑 上，捕獲試劑與活性UPAR的結(jié)合會導(dǎo)致捕獲試劑上的標(biāo)記成分發(fā)生變化，通過檢測標(biāo)記成 分的變化實現(xiàn)對被捕獲的活性UPAR的檢測;運些標(biāo)記成分及其檢測方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的。
[0024] 在一些優(yōu)選的實施方案中，特異性結(jié)合被捕獲的活性UPAR的試劑是結(jié)合于活性 UPAR外側(cè)的單克隆抗體。運類抗體可W通過利用活性UPAR蛋白免疫動物得到多克隆抗體， 而后經(jīng)uPAR-AUCA親合柱捕獲而得。
[0025] 在更優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)合于活性UPAR外側(cè)的單克隆抗體是用UPAR D2D3 (氨基酸88-283)免疫小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆抗UPAR抗體。
[0026] 在更加優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)合于活性UPAR外側(cè)的單克隆抗體是抗體ATN- 658。
[0027] 本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中 包含的單個抗體是相同的，除了少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變之外，單克隆抗體高特異 性地針對單個抗原表位。制備特定抗原的單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域公知的，例如通過雜 交瘤方法獲得。本發(fā)明所述"結(jié)合于活性uPAR外側(cè)的單克隆抗體"是指所針對的抗原表位位 于活性UPAR外側(cè)的單克隆抗體。所述"活性UPAR外側(cè)"是活性UPAR上相對于AUCA所插入的活 性疏水性口袋的內(nèi)側(cè)而言的外側(cè)上的位點。活性UPAR與AUCA結(jié)合情況下，與其外側(cè)位點結(jié) 合的單克隆抗體可W與所形成的復(fù)合物相結(jié)合，從而可W實現(xiàn)對被捕獲的活性UPAR的檢 。鑒定單克隆抗體所針對的抗原表位的方法是本領(lǐng)域公知的，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可W 通過其所熟知的方法確定單克隆抗體是否與活性UPAR外側(cè)相結(jié)合。
[0028] 對該單克隆抗體的測定可W通過使用可檢測的標(biāo)記成分對檢測成分進(jìn)行標(biāo)記并 檢測標(biāo)記成分來進(jìn)行。檢測成分包括捕獲試劑(含有AUCA或含有AUCA的融合蛋白）、結(jié)合于 活性UPAR外側(cè)的單克隆抗體和/或與該單克隆抗體結(jié)合的二抗。例如，可W將標(biāo)記成分標(biāo)記 在單克隆抗體上，通過檢測標(biāo)記成分實現(xiàn)對被捕獲的活性UPAR的檢測；也可W使單克隆抗 體與二抗結(jié)合，將標(biāo)記成分標(biāo)記在二抗上，通過檢測標(biāo)記成分實現(xiàn)對被捕獲的活性UPAR的 檢測;還可W將成對的標(biāo)記成分中的一個標(biāo)記在捕獲試劑上，另一個標(biāo)記在該單克隆抗體 或與該單克隆抗體結(jié)合的二抗上，通過成對的標(biāo)記成分之間的相互作用的檢測實現(xiàn)對被捕 獲的活性UPAR的檢測;還可W將標(biāo)記成分標(biāo)記在捕獲試劑上，捕獲試劑與活性UPAR的結(jié)合 會導(dǎo)致捕獲試劑上的標(biāo)記成分發(fā)生變化，通過檢測標(biāo)記成分的變化實現(xiàn)對被捕獲的活性 UPAR的檢測;運些標(biāo)記成分及其檢測方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？蓹z測的標(biāo)記成分 包括但不限于生物素、酶、巧光染料(如FITC、巧光素、羅丹明、切染料或Alexa f Iuor)、放射 性標(biāo)記物(如3h、32p、35s、i25i或及常見的酶標(biāo)記物如辣根過氧化物酶和堿性憐酸酶。
[0029] 在更加優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的檢測方法的具體步驟如下：
[0030] (1)向多孔板的孔內(nèi)加入IOOyl經(jīng)包被液稀釋的AUCA-HSA蛋白溶液（140iig/ml)進(jìn) 行包被，4 °C過夜，洗涂并干燥；
[0031] (2)向孔中加入10化1封閉液進(jìn)行封閉，室溫80轉(zhuǎn)/分，解育1小時，洗涂并干燥；
[0032] (3)向一些孔中加入不同濃度的活性UPAR標(biāo)準(zhǔn)品10化1，所述不同濃度分別為化g/ L、0.扣g/L、0.25iig/L、0.125iig/L、0.062扣g/L、0.0312扣g/l;向另一些孔中加入 100山的樣 品稀釋液作為空白對照，空白對照中不含有uPAR;向其它孔中加入待檢樣品的用樣品稀釋 液稀釋10倍的稀釋液;室溫80轉(zhuǎn)/分，解育1小時，洗涂并干燥；
[0033] (4)向所有孔內(nèi)加入I(K)山9μg/ml經(jīng)樣品稀釋液稀釋的鼠抗人源UPAR的單克隆抗 體，室溫80轉(zhuǎn)/分，解育1小時，洗涂并干燥，其中所述單克隆抗體是用UPAR D2D3(氨基酸 88-283)免疫小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆抗UPAR抗體；
[0034] (5)向所有孔內(nèi)加入10化1經(jīng)樣品稀釋液500倍稀釋的堿性憐酸酶標(biāo)記的抗鼠 IgG, 室溫80轉(zhuǎn)/分，解育1小時，洗涂并干燥；
[0035] (6)向每孔內(nèi)加入10化1顯色液，接著將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上于405皿讀取吸光度， 共讀取60min，每Imin讀取一次吸光度值；
[0036] (7)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中活性UPAR的濃度。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制備用于檢測樣品 中活性UPAR的試劑中的應(yīng)用。
[0038] 在本發(fā)明中，"待測樣品"包括但不限于來自于受試者的血液、血清、血漿細(xì)胞培養(yǎng) 液、唾液和尿液。
[0039] 本發(fā)明中所使用的術(shù)語"融合蛋白"指包含兩種或更多種不同蛋白質(zhì)的氨基酸序 列的嵌合蛋白。制備融合蛋白的方法是本領(lǐng)域公知的，通常融合蛋白由本領(lǐng)域熟知的體外 重組技術(shù)產(chǎn)生。本發(fā)明的"含有AUCA的融合蛋白"是AUCA與另一種蛋白質(zhì)或多膚或其片段的 嵌合蛋白。所述另一種蛋白質(zhì)或多膚或其片段可W是血清白蛋白，例如人血清白蛋白 化SA)、牛血清白蛋白（BSA)，也可W是卵清蛋白（OVA)。在優(yōu)選的實施方案中，含有AUCA的融 合蛋白是AUCA-服A融合蛋白。
[0040] 本發(fā)明中，可W通過本領(lǐng)域已知的各種方法制備AUCA、或含有AUCA的融合蛋白，例 如可W通過化學(xué)合成或重組方法制備。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的AUCA或含有AUCA的 融合蛋白是重組蛋白。
[0041] 所述AUCA或含有AUCA的融合蛋白可W被固定在固體基質(zhì)上。所述固體基質(zhì)包括但 不限于多孔板(如96孔板）、蛋白質(zhì)忍片底膜(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜等）、磁珠等。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制備用于檢測樣品 中活性UPAR的試劑盒中的應(yīng)用。在優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒包含捕獲試劑，所述捕獲 試劑包括可特異性捕獲活性UPAR的AUCA或含有AUCA的融合蛋白。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供用于檢測活性UPAR的試劑盒，所述試劑盒包含捕獲 試劑，所述捕獲試劑包括可特異性捕獲活性UPAR的AUCA或其融合蛋白。
[0044] 在一些實施方案中，所述捕獲試劑被可檢測的標(biāo)記成分標(biāo)記。捕獲試劑與活性 UPAR的結(jié)合會導(dǎo)致捕獲試劑上的標(biāo)記成分發(fā)生變化，通過檢測捕獲試劑上的標(biāo)記成分的 變化可W實現(xiàn)對被捕獲的活性UPAR的檢測。
[0045] 在另一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于檢測被捕獲的活性UPAR的一種或多 種試劑。在優(yōu)選的實施方案中，所述用于檢測被捕獲的活性UPAR的一種或多種試劑包括結(jié) 合于活性UPAR外側(cè)的單克隆抗體和/或與該單克隆抗體結(jié)合的二抗。在一些實施方案中，所 述單克隆抗體被可檢測的標(biāo)記成分標(biāo)記。在另一些實施方案中，所述單克隆抗體未被可檢 測的標(biāo)記成分標(biāo)記。在一些實施方案中，所述二抗被可檢測的標(biāo)記成分標(biāo)記。在另一些實施 方案中，所述二抗未被可檢測的標(biāo)記成分標(biāo)記。
[0046] 在優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)合于活性UPAR外側(cè)的單克隆抗體是UPAR D2D3(氨基 酸88-283)免疫小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆抗UPAR抗體。
[0047] 在另一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于檢測被捕獲的活性UPAR的一種或多 種試劑，其中所述捕獲試劑被可檢測的成對標(biāo)記成分中的一個成分標(biāo)記，并且用于檢測被 捕獲的活性uPAR的一種或多種試劑被成對標(biāo)記成分中的另一個標(biāo)記。通過檢測成對標(biāo)記成 分之間的相互作用可W實現(xiàn)對被捕獲的活性UPAR的檢測。在優(yōu)選的實施方案中，所述用于 檢測被捕獲的活性UPAR的一種或多種試劑包括結(jié)合于活性UPAR外側(cè)的單克隆抗體和/或與 該單克隆抗體結(jié)合的二抗。
[0048] 在另一些實施方案中，所述試劑盒還包含任何適用于檢測被捕獲試劑捕獲的活性 UPAR的可檢測的標(biāo)記成分。
[0049] W上所述的可檢測的標(biāo)記成分包括但不限于生物素、酶、巧光染料(如FITC、巧光 素、羅丹明、切染料或416義3門11〇')、放射性標(biāo)記物(如化、3申、355、1251或1 4〇^及常見的酶 標(biāo)記物如辣根過氧化物酶和堿性憐酸酶。
[0050] 在一些實施方案中，在本發(fā)明的試劑盒中，捕獲試劑可W被固定在固相基質(zhì)上，例 如被固定在多孔板(如96孔板）、蛋白質(zhì)忍片底膜(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜等）、磁珠上。 試劑盒中還可W包含包被液、封閉液、洗涂液、樣品稀釋液、W及用于檢測標(biāo)記成分的試劑 中的一種或多種。
[0051] 上述試劑盒還可W包括使用說明書。
[0052] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含：酶標(biāo)板;AUCA-HSA蛋白溶液；活性 UPA財示準(zhǔn)品；用人UPAR D2D3 (氨基酸88-283)免疫小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆 抗UPAR抗體;堿性憐酸酶標(biāo)記的抗鼠 IgG;包被液;洗涂液/樣品稀釋液;封閉液和顯色液。
[0053] 在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含:酶標(biāo)板；Iml 1.4mg/ml的AUCA-HSA 蛋白溶液；Iml活性UPAR標(biāo)準(zhǔn)品（Img/ml); IOOiil用UPAR D2D3(氨基酸88-283)免疫小鼠，經(jīng) 雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆抗uPAR抗體(0.9mg/ml); 2扣1 500 X堿性憐酸酶標(biāo)記的抗 鼠 IgG;包被液IOml; 30 X洗涂液/樣品稀釋液20ml;BSA封閉液IOml;PNPP顯色液IOml。
[0054] 本發(fā)明中，包被液優(yōu)選為含40mMNaHC03，10mM化2C03，pH9.6的水溶液。
[0055] 本發(fā)明中，封閉液優(yōu)選為用包被液配制的5%BSA溶液。
[0056] 本發(fā)明中，洗涂液/樣品稀釋液優(yōu)選為含0.5%oTween-20pH7.4的PBS溶液，其中 ?85配方為船(：18邑/1，1((：10.2邑/1，船2冊〇4*12出0 3.58邑/1，1(出口〇4〇.27邑/1。
[0化7]本發(fā)明中，顯色液優(yōu)選含有0.ImM Tris ? HCKpH 9.5),0.ImM 化Cl,5mM MgCl2， 2mg/ml PNPPo
[0058] 使用本發(fā)明的檢測方法和檢測試劑盒，可特異地檢測各種樣本中的活性uPAR。
[0059] 本發(fā)明中所使用的"包含"、"包括"或"含有"可W指"包括但不限于"、"基本由…… 組成"或"主要由……組成"。
[0060] 在本發(fā)明中使用"包含"、"包括"或"含有"的技術(shù)方案還可W是由所列成分組成的 技術(shù)方案。
【附圖說明】
[006。 圖1是實施例1的活性UPAR的ELISA檢巧巧法的設(shè)計原理示意圖。
[0062] 圖2是實施例1中所使用的96孔化ISA檢測板典型示例。
[0063] 圖3是不同濃度活性UPAR標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度隨時間變化的動力學(xué)過程圖。
[0064] 圖4是活性UPAR濃度對應(yīng)酶反應(yīng)速度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0065] 圖5是本發(fā)明活性UPAR的化ISA檢測方法的回收率計算結(jié)果。
【具體實施方式】
[0066] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但提供運些實施例是為了幫助理解 本發(fā)明，本發(fā)明不限于運些實施例。
[0067] W下為實施例中設(shè)及使用的試劑及實驗材料：
[006引 AUCA-HSA:使用與專利201410034942.1類似的方法制備AUCA-HSA融合蛋白，經(jīng) SDS-PAGE電泳驗證純度大于90%。也可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法制備AUCA和 HSA的融合蛋白，例如在己斯德畢赤酵母X-33中表達(dá)并經(jīng)儀-次氮基S乙酸(Ni-NTA)柱純 化。
[0069] 活性UPAR標(biāo)準(zhǔn)品：在S2果蛹胚胎細(xì)胞中表達(dá)的重組suPAR，經(jīng)親合柱結(jié)合離子柱純 化。
[0070] 抗體ATN-658:由Attenuon，LLC(SanDiego，Calif)提供，是uPARD2D3(氨基酸88- 283)免疫小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆抗uPAR抗體。
[0071 ]堿性憐酸酶標(biāo)記二抗（AP-antimouse-IgG):選購于Cell Si即aling Technology 公司，是專用于Western blotting和ElLISA中的酶標(biāo)二抗。
[0072] 96孔酶標(biāo)板:選購于化ermo scientific公司，是透明的Maxiso巧類型酶標(biāo)板。
[0073] 包被液:含40mMNa肥03，10mM化2C03，pH9.6的水溶液。
[0074] 封閉液:用包被液配置的5%BSA溶液，其中BSA選購于生工生物工程有限公司。
[0075] 洗涂液/樣品稀釋液：含0.5%〇Tween-20pH 7.4的PBS溶液，其中PBS配方為化Cl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HP〇4? 12出0 3.58g/L，K出P〇4 0.27g/L。
[0076] 顯色液：0.1mM Tris ?肥 1(抑 9.5)，0.1mM NaCl，5mM MgCl2,2mg/ml PNPP。
[0077] 實施例一:利用AUCA-HSA來檢測人血樣中的活性uPAR
[0078] 本實施例中活性UPAR的化ISA檢測方法的原理如圖1所示。
[0079] 血漿樣品的收集和保存:收集人的全血于含抓TA抗凝劑的真空采血管中，在1200* g離屯、30min。將不同病人的血漿編號并用樣品稀釋液稀釋10倍，分裝于1.5ml離屯、管中，保 存在-80°C待用。
[0080] 具體的操作步驟如下：
[0081 ] 1包被：向酶標(biāo)板的1A-12H所有孔（參見圖2)內(nèi)加入10化1經(jīng)包被液稀釋的AUCA- 服A蛋白溶液(140iig/ml)，用密封膠帶將96孔板密封好W防止液體蒸發(fā)，并于4°C過夜。掲開 密封膠帶，甩干酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體，并用排槍吸取洗涂液，洗涂每孔6次，在最后一次洗涂 后，將酶標(biāo)板在吸水紙上輕輕拍干并保證孔內(nèi)沒有氣泡存留。
[0082] 2封閉：向酶標(biāo)板內(nèi)1A-12H所有孔中加入10化1封閉液，并用密封膠帶將96孔板密 封好W防止液體蒸發(fā)，于室溫80轉(zhuǎn)/分的搖床上解育1小時。掲開密封膠帶，甩干酶標(biāo)板孔內(nèi) 的液體，并用排槍吸取洗涂液洗涂每孔6次，在最后一次洗涂后，將酶標(biāo)板在吸水紙上輕輕 拍干并保證孔內(nèi)沒有氣泡存留。
[0083] 3加樣:分別向酶標(biāo)板1A-1F加入不同濃度的活性UPAR標(biāo)準(zhǔn)品10化1，每一濃度有兩 個復(fù)孔(Al、A2: liig/L;Bl、B2:0.5iig/L;Cl、C2:0.2扣g/l;Dl、D2:0.12扣g/l;El、E2:0.0625y g/レFl、F2:0.03125iig/L)。向Gl、G2分別加入10化l的樣品稀釋液作為空白對照。然后向酶 標(biāo)板內(nèi)其它孔加入待檢測病人的稀釋血清樣品（用樣品稀釋液稀釋10倍），每個血清樣品2 個重復(fù)，然后用密封膠帶將96孔板密封好，并于室溫80轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上解育1小時。掲開密 封膠帶，甩干酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體，并用排槍吸取洗涂液，洗涂每孔6次，在最后一次洗涂后， 將酶標(biāo)板在吸水紙上輕輕拍干并保證孔內(nèi)沒有氣泡存留。
[0084] 4加一抗：向酶標(biāo)板1A-12H所有孔內(nèi)加入10化1 9iig/ml經(jīng)樣品稀釋液稀釋的鼠抗 人源UPAR的ATN-658抗體，并用密封膠帶將96孔板密封好，并于室溫80轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上解 育1小時。掲開密封膠帶，甩干酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體，并用排槍吸取洗涂液，洗涂每孔6次，在最 后一次洗涂后，將酶標(biāo)板在吸水紙上輕輕拍干并保證孔內(nèi)沒有氣泡存留。
[0085] 5加酶標(biāo)二抗：向酶標(biāo)板1A-12H所有孔內(nèi)加入10化1經(jīng)樣品稀釋液500倍稀釋的堿 性憐酸酶標(biāo)記的抗鼠 IgG(antimouse-AP con化gate IgG)，并用密封膠帶將96孔板密封好， 并于室溫80轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上解育1小時。掲開密封膠帶，甩干酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體，并用排槍 吸取洗涂液，洗涂每孔6次，然后在用排槍吸取去離子水洗涂每孔3次。將酶標(biāo)板在吸水紙上 輕輕拍干并保證孔內(nèi)沒有氣泡存留。
[0086] 6加顯色液:然后用排槍向每孔內(nèi)快速加入10化1顯色液，接著將酶標(biāo)板置于酶標(biāo) 儀上于405nm讀取吸光度，共讀取60min，每Imin讀取一次吸光度值。
[0087] 7制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算血液樣品中活性UPAR的濃度。
[008引首先，通過線性回歸分析的方法建立一系列活性UPAR濃度(X軸）與對應(yīng)的酶反應(yīng) 速度-Rate(Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3就是酶標(biāo)儀于405nm讀取不同濃度活性UPAR標(biāo)準(zhǔn)品的吸光 度隨時間變化的動力學(xué)過程，其中橫坐標(biāo)為時間（監(jiān)測60分鐘），縱坐標(biāo)為405nm處的吸光 值，動力學(xué)曲線由上至下對應(yīng)的活性UPAR濃度依次為：liig/L，0.5iig/L，0.2扣g/L，0.12扣g/ L，0.062化g/L，0.0312扣g/L，0yg/L。通過不同活性uPAR濃度對應(yīng)的第60分鐘OD 405nm處 吸光值減去第1分鐘0 D 4 0 5 n m處的吸光值，得到6 0分鐘時間內(nèi)的0 D 4 0 5 n m的變化值X (miIliAbsorbance ,milIiAbs)。用邱余W60分鐘即得到不同活性uPAR濃度對應(yīng)的酶反應(yīng)速 度(milliAbs/min)。圖4即為一系列活性UPAR濃度對酶反應(yīng)速度所做標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過換算將 病人血漿樣本對應(yīng)的酶反應(yīng)速度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可測定對應(yīng)血漿樣品中的活性uPAR含量。
[0089] 實施例二:活性UPAR檢測方法的性能表征
[0090] 本實施例是對本發(fā)明的活性UPAR的化ISA檢測方法的考核，如未作特殊說明，具體 的實驗方法和所用試劑同實施例1所述方法。
[0091] (1)精密度實驗
[0092] 精密度通常用批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV% )來表示，應(yīng)用實施例一的化ISA方法對 于同一個血漿樣品中的活性UPAR含量在同一天同一塊板中重復(fù)測量16次得到相應(yīng)的平均 值(AVE)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，通過公式100%*(SD/AVE)即得到相應(yīng)的批內(nèi)變異系數(shù)（％)，結(jié)果如 表一所示。另外在連續(xù)4天內(nèi)每天重復(fù)測量同一個血漿樣品中的活性UPAR含量，得到相應(yīng)4 天的平均值(AVE'）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD'），通過公式100%*(SD'/AVE'）即得到相應(yīng)的批間變異系 數(shù)（％ )，結(jié)果如表二所示。由表一和表二可看到批內(nèi)變異系數(shù)為8.27%，小于10%，批間變 異系數(shù)為9.52%，小于15%，說明了所建立的ELISA新方法重現(xiàn)性良好。
[0093] 表一批內(nèi)精密度測定結(jié)果： rn〇94i Luuy/j 凹H乂頭避
[0098]回收實驗的回收效果一般用回收率（％ )來表示。將IOiil -系列已知濃度的活性 UPA財示準(zhǔn)樣品分別加入到10化1樣品稀釋液或者稀釋10倍的血漿中，并分別計算出11化1體 系中最終添加的活性UPAR濃度(此濃度記為活性UPAR添加濃度）。然后應(yīng)用本化ISA方法分 別檢測加入活性UPAR的樣品稀釋液和稀釋的血漿中活性UPAR濃度(此濃度記為活性UPAR檢 測濃度））。分別繪制針對樣品稀釋液的活性UPAR添加濃度和活性UPAR檢測濃度W及針對 稀釋血漿的活性UPAR添加濃度和活性UPAR檢測濃度的線性關(guān)系圖，結(jié)果如圖5所示。通過對 比兩曲線的斜率值來計算標(biāo)準(zhǔn)樣品在血漿中的回收率R，其中針對樣品稀釋液的活性uPAR 添加濃度和活性UPAR檢測濃度的線性方程的斜率被認(rèn)為是100%的回收率。因此活性UPAR 在血漿中的回收率R二1.0102/1.0165二99.4%，也表明了此化ISA方法具有較好的準(zhǔn)確度。
[0099] (3)檢測限^及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍
[0100] 為了確認(rèn)本化ISA方法檢測活性UPAR含量的檢測下限，通過測量4組空白對照（加 入樣品為樣品稀釋液，活性UPAR濃度為Otig/L)中相應(yīng)的酶反應(yīng)速度，然后帶入到活性UPAR 濃度和酶反應(yīng)速度的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到相應(yīng)活性UPAR的含量。計算出四組空白對照中活性 UPAR含量的平均值(AVE" ) W及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差(SD")。此方法的檢測下限可通過公式AVE"+3* SD"得到，由此獲得本ELISA方法的活性UPAR含量的檢測下限約為15ng/L。另外通過繪制0- 12如g/L活性UPAR濃度對應(yīng)酶反應(yīng)速度的線性關(guān)系圖，我們發(fā)現(xiàn)本方法的線性范圍為0-如 g/U線性方程中1?2〉〇.99被認(rèn)為線性關(guān)系較好）。
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【主權(quán)項】
1. 活性uPAR的檢測方法，該方法包括： 1) 使捕獲試劑與待測樣品在適合于所述捕獲試劑捕獲待測樣品中活性uPAR的條件下 接觸，形成捕獲試劑與活性uPAR的復(fù)合物； 2) 檢測被捕獲的活性uPAR; 其中所述捕獲試劑包含AUCA或含有AUCA的融合蛋白，優(yōu)選包含AUCA-HSA融合蛋白。2. 權(quán)利要求1的檢測方法，其中步驟2)包括使所形成的復(fù)合物與結(jié)合于活性uPAR外側(cè) 的單克隆抗體結(jié)合，并通過檢測所述單克隆抗體來檢測被捕獲的活性uPAR，優(yōu)選所述結(jié)合 于活性uPAR外側(cè)的單克隆抗體是用uPAR D2D3免疫小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克 隆抗uPAR抗體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的檢測方法，其中具體步驟如下： (1)向多孔板的孔內(nèi)加入1〇〇μ1經(jīng)包被液稀釋的140μg/ml的AUCA-HSA蛋白溶液進(jìn)行包 被，4°C過夜，洗滌并干燥； ⑵向孔中加入?〇〇μ1封閉液進(jìn)行封閉，室溫80轉(zhuǎn)/分，孵育1小時，洗滌并干燥； (3) 向一些孔中加入不同濃度的活性uPAR標(biāo)準(zhǔn)品100μΙ，所述不同濃度分別為lyg/L、 0.5yg/L、0.25yg/L、0.125yg/L、0.0625yg/L、0.03125yg/L;向另一些孔中加入100μΙ的樣品 稀釋液作為空白對照，空白對照中不含uPAR;向其它孔中加入待檢樣品的用樣品稀釋液稀 釋10倍的稀釋液;室溫80轉(zhuǎn)/分，孵育1小時，洗滌并干燥； (4) 向所有孔內(nèi)加入100μΙ 9μg/ml經(jīng)樣品稀釋液稀釋的鼠抗人源uPAR的單克隆抗體， 室溫80轉(zhuǎn)/分，孵育1小時，洗滌并干燥，其中所述單克隆抗體是用uPAR D2D3免疫小鼠，經(jīng)雜 交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆抗uPAR抗體； (5) 向所有孔內(nèi)加入IOOyl經(jīng)樣品稀釋液500倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗鼠 IgG，室溫 80轉(zhuǎn)/分，孵育1小時，洗滌并干燥； (6) 向每孔內(nèi)加入IOOyl顯色液，接著將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上于405nm讀取吸光度，共讀 取60min，每Imin讀取一次吸光度值； (7) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中活性uPAR的濃度。4. 權(quán)利要求1-3任一項的檢測方法，其中待測樣品可以但不僅限于血液、血清、血漿、細(xì) 胞培養(yǎng)液、唾液和尿液。 5 .AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制備用于檢測樣品中活性uPAR的試劑中的應(yīng)用。 6. AUCA或含有AUCA的融合蛋白在制備用于檢測樣品中活性uPAR的試劑盒中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6的應(yīng)用，其中含有AUCA的融合蛋白是AUCA-HSA融合蛋白。8. 用于檢測活性uPAR的試劑盒，所述試劑盒包含捕獲試劑，所述捕獲試劑包含可特異 性捕獲活性uPAR的AUCA或含有AUCA的融合蛋白，優(yōu)選包含AUCA-HSA融合蛋白。9. 權(quán)利要求6的應(yīng)用或權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述試劑盒還包含結(jié)合于活性uPAR外 側(cè)的單克隆抗體和/或與該單克隆抗體結(jié)合的二抗，優(yōu)選所述結(jié)合于活性uPAR外側(cè)的單克 隆抗體是uPAR D2D3免疫小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆抗uPAR抗體。10. 權(quán)利要求6的應(yīng)用或權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述試劑盒包含:酶標(biāo)板;AUCA-HSA 蛋白溶液;活性uPAR標(biāo)準(zhǔn)品；用人uPAR D2D3免疫小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆 抗uPAR抗體;堿性磷酸酶標(biāo)記的抗鼠 IgG;包被液;洗滌液/樣品稀釋液;封閉液和顯色液； 優(yōu)選所述試劑盒包含：酶標(biāo)板；Iml 1.4mg/ml的AUCA-HSA蛋白溶液；Iml活性uPAR標(biāo)準(zhǔn) 品（lmg/ml);100yl 0.9mg/ml的用uPAR D2D3免疫小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)篩選而得到的單克隆 抗uPAR抗體;25μ1 500 X堿性磷酸酶標(biāo)記的抗鼠 IgG;包被液IOml; 30 X洗滌液/樣品稀釋液 20ml ;BSA封閉液IOml，ΡΝΡΡ顯色液IOml。
【文檔編號】G01N33/68GK105954522SQ201610541379
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月11日
【發(fā)明人】黃明東, 周曉雷, 許明明, 袁彩
【申請人】中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所