一種擴(kuò)增高頂鱗皮蚌f型線粒體基因組序列的方法
【專利說明】一種擴(kuò)增高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種擴(kuò)增高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列的 方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 高頂鱗皮鮮（ZepiiZoofe1Sma 為鮮科鱗皮鮮屬的動物，俗名青殼鮮、美 帶蚌、狗腦殼，是中國的特有物種。分布于安徽、浙江、江蘇、江西、湖北、湖南等地，一般生活 于水流較緩、水位較深、無水草的湖泊以及河流的污泥底或泥沙底里。近幾十年來，全球范 圍內(nèi)淡水貝類種群呈明顯衰退趨勢，原因是多方面的，由于極端氣候的影響，河流湖泊水位 急劇下降導(dǎo)致淡水蚌類的棲息地喪失；但人為干擾是造成其多樣性減少和群落結(jié)構(gòu)變化的 主要因素。無序的水利工程建設(shè)、采砂作業(yè)導(dǎo)致淡水蚌類棲息地的喪失、寄主魚類洄游的阻 擋和寄主魚產(chǎn)卵場的破壞；破壞性的捕撈魚類使寄主魚種類數(shù)量銳減，影響了蚌類生活史 的寄生環(huán)節(jié)；因紐扣珠核制造的需要大量捕撈淡水蚌類，破壞了淡水蚌類的種群結(jié)構(gòu)。以 上種種原因?qū)е铝说鲱惖姆N群數(shù)量、種群密度急劇下降，物種多樣性受到嚴(yán)重威脅。本 發(fā)明首次報(bào)道了高頂鱗皮蚌的線粒體基因組，也是首次報(bào)道了一種擴(kuò)增高頂鱗皮蚌線粒體 基因組序列的方法，可以為蚌科的線粒體基因組學(xué)研宄和種質(zhì)資源保護(hù)提供重要的基礎(chǔ)材 料。
[0004] 線粒體基因組DNA是裸露的雙鏈超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀分子，少數(shù)為線狀分子（如 原生動物草履蟲與四膜蟲的mtDNA)，是真核細(xì)胞的第二遺傳信息系統(tǒng)，或稱核外基因及其 表達(dá)體系。相對于核DNA，mtDNA具有分子量小、多態(tài)性高、結(jié)構(gòu)簡單、堿基突變率高、母系遺 傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生理病理、臨床診斷、遺傳變異、分子標(biāo)記、系統(tǒng)進(jìn) 化等多方面的研宄，與線粒體和線粒體基因組相關(guān)的研宄已成為臨床醫(yī)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、基 因組學(xué)、生物信息學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)和前沿。
[0005] 蚌科動物線粒體的遺傳不單單是母系遺傳，還存在線粒體基因組遺傳的一種 特例--雙單親遺傳現(xiàn)象（Doubly-Uniparental Inheritance, DUI)。這種遺傳方 式使后代中雌性mtDN只來自母系（female-transmitted, F type)，與嚴(yán)格的母系遺傳 相似；而雄性的mtDNA來自雙親，在體細(xì)胞中存在F型mtDNA，在精巢中存在父系mtDNA (male-transmitted, M type)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種快速擴(kuò)增高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列的方法。為 了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。
[0007] 本發(fā)明所述方法包括下列步驟： (1)提取蚌的總DNA ;使用購自天根生化科技有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取 試劑盒，提取高頂鱗皮蚌的總DNA ; (2) 利用保守引物分別對coxl、16SrRNA和nadl基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增并測序； (3) 根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)長片段引物進(jìn)行LA-PCR擴(kuò)增并測序； (4) 序列拼接； (5) 基因注釋。
[0008] 所述的長片段引物包括以下三對： FG16S-ND1P1 ：TTGGGGCAATCTTGGAAC FG16S-ND1P2 ：CTGCGAAATCAAATGGAGC FGND1-C01P1 ： TTGCCCCGTTACCGTTAT FGND1-C01P2 ：TTTGTTGGTTGCTGCCCT FGC01-16SP1 ： GCTACATTCCCAGACAACG FGC01-16SP2:TGCCCCAATCAAACCTTAT〇
[0009] 本發(fā)明的有益效果：通過設(shè)計(jì)的特異性長片段引物，通過LA-PCR技術(shù)對高頂鱗皮 蚌F型線粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行測序、拼接和校正，獲得了高頂鱗皮蚌F型線粒體基 因組全序列。本發(fā)明獲得的高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列總長15754bp，可從組成和結(jié) 構(gòu)的角度對高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組進(jìn)行分析，可以豐富蚌科線粒體基因組信息，為 蚌類的系統(tǒng)發(fā)育、種質(zhì)資源保護(hù)、可持續(xù)和合理地利用奠定重要的分子遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0010] 圖1為高頂鱗皮蚌總DNA的瓊脂糖電泳結(jié)果示意圖，圖中M為DL5000 marker, 1、 2為高頂鱗皮蚌總DNA ; 圖2為高頂鱗皮蚌普通PCR擴(kuò)增的瓊脂糖電泳結(jié)果示意圖，圖中M為DL5000 marker，1 為保守引物16SrRNA的擴(kuò)增結(jié)果，2為保守引物NDl的擴(kuò)增結(jié)果，3為保守引物COXl的擴(kuò)增 結(jié)果； 圖3為高頂鱗皮蚌LA-PCR擴(kuò)增的瓊脂糖電泳結(jié)果示意圖，圖中M為DL5000 marker，1 為設(shè)計(jì)引物16S-ND1的擴(kuò)增結(jié)果，2為設(shè)計(jì)引物NDl-COl的擴(kuò)增結(jié)果，3為設(shè)計(jì)引物C01-16S 的擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例， 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā) 明保護(hù)的范圍。
[0012] 一種擴(kuò)增高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列的方法如下： (1)總DNA提?。?使用購自天根生化科技有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒，提取高頂鱗 皮蚌的總DNA。
[0013] (2)普通PCR擴(kuò)增及測序： 對于高頂鱗皮蚌F型線粒體的姻和基因的擴(kuò)增分別采用LC01490/ HC02198、16SarL/16SbrH和Leu-uurF/LoGlyR引物擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海） 股份有限公司測序。
[0014] (3)長片段引物設(shè)計(jì) 把cod、和基因的部分片段的測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行nucleotide blast，確定都為鮮科動物線粒體DNA基因片段且均為正義鏈。利用Primer premier5.0將 前期得到的《^7、7必WP姻和Mi//基因三段序列為模板設(shè)計(jì)三對長PCR引物結(jié)果為： FG16S-ND1P1 ：TTGGGGCAATCTTGGAAC FG16S-ND1P2 ：CTGCGAAATCAAATGGAGC FGND1-C01P1 ： TTGCCCCGTTACCGTTAT FGND1-C01P2 ：TTTGTTGGTTGCTGCCCT FGC01-16SP1 ： GCTACATTCCCAGACAACG FGC01-16SP2:TGCCCCAATCAAACCTTAT (4) LA-PCR擴(kuò)增及測序 使用設(shè)計(jì)的三對長PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測 序。
[0015] (5)序列拼接 把實(shí)驗(yàn)所得的全部序列片段利用DNASTAR7. 1軟件中的SeqMan組件進(jìn)行拼接，組裝成 一條首尾相接的序列，并仔細(xì)檢查，對照測序峰圖人工校正序列中相沖突的位點(diǎn)，校正完后 再利用SeqMan把首尾的重復(fù)序列去除其中一個(gè)，最終得到完整的線粒體DNA全序列。
[0016] (6)基因注釋 高頂鱗皮蚌F型線粒體DNA全序列的注釋參考珠蚌亞科已測物種的線粒體DNA，用在 線工具 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)和 Blast 查找線 粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)基因，利用在線工具ARWEN (http://130. 235. 46. 10/ARWEN)和 MITOS (http: //mtos. biinf. unileizig. de/help. py)查找 22 個(gè) tRNA 基因和 2 個(gè) rRNA 基 因以及控制區(qū)（Control Region，CR)。該序列總長15754bp，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，2 個(gè)rRNA基因，22個(gè)tRNA基因，其中的tRNASer基因和tRNALeu基因均為雙拷貝，以及一個(gè) 長度429bp的控制區(qū)和26個(gè)l~307bp不等的非編碼區(qū)；37個(gè)基因中有11個(gè)在H鏈上編碼， 其余的26個(gè)都在L鏈上編碼；全序列中的堿基含量依次為A (39. 1%)、T (25. 7%)、C (23. 4%)、 G (II. 8%)，具有明顯的A+T偏向性；13個(gè)蛋白質(zhì)基因共有五個(gè)起始密碼子：ATA、ATG、ATT、 GTG、TTG，其中有7個(gè)蛋白質(zhì)基因以ATG為起始密碼子，以及2個(gè)典型的終止密碼子：TAA、 TAG，不含非完整終止密碼子。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種擴(kuò)增高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列的方法，包括以下步驟： 提取蚌的總DNA; 利用保守引物分別對和基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增并測序； 根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)長片段引物進(jìn)行LA-PCR擴(kuò)增并測序； 序列拼接； 基因注釋。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擴(kuò)增高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列的方法，其特征 是，所述的長片段引物包括以下三對： FG16S-ND1P1：TTGGGGCAATCTTGGAAC FG16S-ND1P2：CTGCGAAATCAAATGGAGC FGND1-C01P1：TTGCCCCGTTACCGTTAT FGND1-C01P2：TTTGTTGGTTGCTGCCCT FGC01-16SP1：GCTACATTCCCAGACAACG FGC01-16SP2:TGCCCCAATCAAACCTTATo
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速擴(kuò)增高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列的方法，該方法通過提取總DNA、普通PCR擴(kuò)增及測序、設(shè)計(jì)長片段引物、LA-PCR擴(kuò)增及測序和序列拼接，獲得了高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列，該序列總長15754bp，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，2個(gè)rRNA基因，22個(gè)tRNA基因。本發(fā)明首次公布了獲得高頂鱗皮蚌F型線粒體基因組序列的方法，為蚌科的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)、比較和進(jìn)化基因組學(xué)、譜系基因組學(xué)、種質(zhì)資源保護(hù)、可持續(xù)和合理地利用奠定提供重要的基礎(chǔ)材料。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN104894107
【申請?zhí)枴緾N201510271508
【發(fā)明人】周春花, 丁美煌, 歐陽珊, 吳小平
【申請人】南昌大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月25日