用于環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增的具有與內(nèi)部胞嘧啶結(jié)合的單個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記物的核酸探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于LAMP檢測方法中的新型探針。所述探針包含與探針的內(nèi)部胞嘧啶殘基結(jié)合的單個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記物。所述探針在患者衣原體和淋病感染的檢測中特別有用。
【專利說明】用于環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)増的具有與內(nèi)部胞嘧啶結(jié)合的單個(gè)熒光 團(tuán)標(biāo)記物的核酸探針
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測核酸的探針，使用所述探針的方法和試劑盒。優(yōu)選地，本發(fā)明 的探針用于檢測源自沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis)和/或淋病奈瑟氏菌 (Neisseria gonorrhoeae)的核酸的方法中，并且可以用于衣原體和/或淋病感染的診斷 中。
[0002] 核酸擴(kuò)增是生命科學(xué)領(lǐng)域，包括諸如臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用型領(lǐng)域中最有價(jià)值的工具之 一，其中傳染病、遺傳病癥和遺傳性狀的診斷尤其受益。除了廣泛使用的基于PCR的檢測之 外（Saiki R.K.,Scharf,S.,Faloona,F.,Mullis,K.B.,Horn,G.T.,Erlich,H.A.and Arnheim，N.(1985)Science，230,1350-1354)，已經(jīng)發(fā)明了數(shù)種擴(kuò)增方法。實(shí)例包括核酸序 列依賴性擴(kuò)增(NASBA)、自我持續(xù)序列復(fù)制（3SR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMPhPCR利用雙鏈 DNA產(chǎn)物的熱變性來促進(jìn)下一輪DNA合成。3SR和NASBA通過使用一組轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)排除 了熱變性來擴(kuò)增靶序列。
[0003] 這些方法能夠?qū)泻怂釘U(kuò)增至相似的量級，所有的方法都具有10個(gè)拷貝以下和大 約一小時(shí)之內(nèi)的檢測限。由于靶序列選擇的特異性較差，它們需要用于擴(kuò)增的精密儀器和 用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的精細(xì)方法。盡管擴(kuò)增的簡易性和可獲得的量級，但是在PCR中需要高精 度熱循環(huán)儀阻止了這種強(qiáng)大方法的廣泛應(yīng)用，例如在私人診所中作為常規(guī)的診斷工具。相 比之下，LAMP是能夠在等溫條件下以更高的特異性在一小時(shí)以內(nèi)將少量的DNA拷貝擴(kuò)增至 100個(gè)拷貝以上的方法。
[0004] 與上文提及的其它基于分子探針的技術(shù)一樣，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)測定可用于 檢測樣品中特定微生物的存在。然而，檢測方法是基于直接的目視檢測、濁度或通過非特異 性DNA嵌入染料。直接的目測是終點(diǎn)測量，且不能提供實(shí)時(shí)分析。濁度和非特異性嵌入染料 確實(shí)提供了所發(fā)生的擴(kuò)增的實(shí)時(shí)分析，但是其是非特異性的，即所有擴(kuò)增都被檢測到，無論 其是真正的陽性擴(kuò)增，還是由于錯(cuò)誤引發(fā)、交叉特異性的錯(cuò)誤擴(kuò)增。
[0005] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于等溫核酸擴(kuò)增的探針，其包含與靶核酸序列 的區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸探針序列，其中所述寡核苷酸探針序列僅具有一個(gè)熒光團(tuán)配體，并 且所述配體與內(nèi)部胞嘧啶堿基結(jié)合，以及其中所述寡核苷酸探針序列不具有3 '端終止子。
[0006] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸探針序列是DNA序列，并且靶核酸序列是DNA序列。
[0007] 優(yōu)選地，熒光增加表明樣品中靶核酸的存在。
[0008] 優(yōu)選地，胞嘧啶堿基基本位于寡核苷酸長度的中心。存在與胞嘧啶堿基內(nèi)部標(biāo)記 探針相關(guān)的特別益處。在等溫反應(yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的特異性可以使用熔解曲線分析來驗(yàn) 證。然而，由于在該反應(yīng)中生成大量的產(chǎn)物變體和熔解曲線分析的低分辨率，使用嵌入染料 如V13很難分辨等溫條件下生成的特異性DNA產(chǎn)物和非特異性DNA產(chǎn)物。由于BST聚合酶的鏈 置換活性，常用的探針如TaqMan?探針與LAMP技術(shù)不兼容。本發(fā)明的探針是延長的，并且 在等溫?cái)U(kuò)增過程中并入DNA產(chǎn)物，其允許對生成的產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。在本發(fā)明的探針 中，將熒光團(tuán)綴合到與反義鏈中鳥嘌呤互補(bǔ)的內(nèi)部胞嘧啶。鳥嘌呤影響許多熒光團(tuán)的激發(fā) 態(tài)，導(dǎo)致形成獨(dú)特的熔解曲線標(biāo)簽，并允許分辨等溫條件下生成的特異性產(chǎn)物和非特異性 產(chǎn)物。
[0009]寡核苷酸在其能夠?qū)?biāo)記的寡核苷酸并入擴(kuò)增子的3'端不含ddNTP。因此，探針的 3'端未被"封閉"。
[0010] 熒光團(tuán)可以包括選自以下的任意一種或多種：FAM、J0E、TET、HEX、TAMRA、R0X、 ALEXA和ΑΤΤ0。
[0011] 探針可以包含以下序列：
[0012] 5'Xn C*Xm 3'（SEQ ID N0.1)
[0013] 其中n>l，m>3，X是核苷酸堿基;*是熒光團(tuán)。優(yōu)選地，核苷酸堿基選自A、T、C和G。優(yōu) 選地，η大于1至20或20以下，更優(yōu)選大于1至10或10以下。優(yōu)選地，m大于3至20或20以下，更 優(yōu)選大于3至10或10以下。預(yù)期公開了由前述范圍所采用的η或m構(gòu)成的可能的核苷酸數(shù)目 所覆蓋的探針長度的所有組合。
[0014] 優(yōu)選地，探針可以包含選自以下任一序列的序列：
[0018] 當(dāng)寡核苷酸被并入靶核酸序列，導(dǎo)致擴(kuò)增子-探針復(fù)合物的構(gòu)象改變，從而引起熒 光團(tuán)激發(fā)態(tài)的改變時(shí)，熒光優(yōu)選增加。
[0019] 與熒光團(tuán)配體結(jié)合的胞嘧啶不位于5'或3'端或者5'或3'端附近。更優(yōu)選地，其不 位于5'或3'端的前3個(gè)堿基內(nèi)。優(yōu)選地，與熒光團(tuán)結(jié)合的胞嘧啶位于探針的中間堿基處。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了上文所述的等溫核酸擴(kuò)增探針。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了上文所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增探針。
[0022] 確定核酸混合物中至少一種靶核酸的方法和組合物通常采用探針、雜交試劑和與 形成核酸鏈的任何所需的核苷酸三磷酸相關(guān)的一種或多種磷酸鍵形成酶。
[0023] 這些方法通常包括擴(kuò)增，例如包括使用與RNA聚合酶結(jié)合的啟動(dòng)子、其中僅一條鏈 被切割接著通過用DNA聚合酶延伸被置換的限制性位點(diǎn)、或循環(huán)的雜交試劑，其中產(chǎn)生串聯(lián) 重復(fù)。擴(kuò)增的核酸的檢測可以采用多種形式，但是優(yōu)選通過熒光團(tuán)。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測樣品中靶核酸的方法，其包括：
[0025] a.擴(kuò)增樣品中的靶核酸以提供擴(kuò)增的核酸；
[0026] b.用上文所述的探針探測所述擴(kuò)增的核酸；以及 [0027] c.檢測一種或多種靶核酸的存在。
[0028]靶核酸可以是來自微生物、真菌、酵母、病毒、人、動(dòng)物、植物等的核酸。已知用于 LAMP的靶核酸使得LAMP引物和合適的特異性探針能夠被合成。因此，可以確定樣品中是否 存在所述微生物、真菌、酵母、病毒、人、動(dòng)物或植物。優(yōu)選地，靶核酸來自沙眼衣原體或淋病 奈瑟氏菌。
[0029]優(yōu)選地，熒光增加表明樣品中靶核酸的存在。
[0030] 過程是等溫的，并且允許在一個(gè)容器中以單個(gè)階段或連續(xù)階段擴(kuò)增，其中所有的 試劑都是兼容的。
[0031] 在另一方面，本發(fā)明提供了診斷患者中衣原體和/或淋病的方法，其包括：
[0032]提供來源于患者的樣品；
[0033] 向所述樣品添加一種或多種本發(fā)明的探針；以及
[0034] 檢測來源于沙眼衣原體和/或淋病奈瑟氏菌的核酸的存在，其中探針熒光的增加 表明沙眼衣原體和/或淋病奈瑟氏菌感染的存在。
[0035] 樣品可以通過常規(guī)方法處理，使得探針能夠與樣品中存在的任何靶核苷酸結(jié)合。 這樣的處理可以包括離心并裂解樣品，從而從感染微生物釋放任何靶核酸。
[0036] 在一實(shí)施方案中，在所述方法中使用對來源于沙眼衣原體或淋病奈瑟氏菌的核酸 特異的單一類型的探針，使得樣品中只有沙眼衣原體或只有淋病奈瑟氏菌被檢測到。
[0037] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將至少兩種不同的探針添加至樣品，其中第一探針用第一 熒光標(biāo)記物標(biāo)記，并且其對探測沙眼衣原體核酸是特異的，以及第二探針用不同于第一探 針的熒光標(biāo)記物標(biāo)記，并且其對探測淋病奈瑟氏菌核酸是特異的。在該實(shí)施方案中，同時(shí)檢 測來源于患者的單一樣品中的衣原體和淋病感染是可能的。
[0038] 在本發(fā)明方法的一方面中，來自患者的樣品可以是血液樣品、尿液樣品、血清樣品 或唾液樣品。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了試劑盒，其包含上文所述的探針、含有聚合酶的 LAMP反應(yīng)緩沖液、dNTPS和用于靶標(biāo)的LAMP引物。
[0040] 在一實(shí)施方案中，試劑盒中可以包含陽性對照和陰性對照。試劑可以作為濕(wet) 試劑或以凍干形式存在。
[00411本發(fā)明方法或試劑盒中所用的緩沖液包含濃度為Ι-lOmM的dNTP、濃度為2-20mM的 一種或多種鹽、濃度為l0-l00mM的Tris pH8.8、濃度為10-100mM的海藻糖、量為1U-12U的 BST聚合酶以及0·01%-1%1，2-丙二醇。
[0042] 縮寫 [0043] CT-沙眼衣原體
[0044] GC-淋病奈瑟氏菌
[0045] GlnA7-谷氨酰胺合成酶
[0046] P〇rA7_ 孔蛋白 A7
[0047] LAMP-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
[0048] PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0049] 現(xiàn)在結(jié)合以下實(shí)施例和附圖，僅通過示例的方式來描述本發(fā)明。
[0050] LAMP 反應(yīng)
[0051 ] 利用本
【申請人】開發(fā)的LAMP V6.21反應(yīng)緩沖液，通過LAMP對靶CT和GT DNA進(jìn)行基于 V13的檢測。靶DNA的基于探針的檢測在V6.21p(無 V13)中進(jìn)行。LAMP引物濃度如下:CT roi-0·8μΜ FIP&BIP引物、0·2μΜ F3&B3和0·4μΜ環(huán)引物、GC porA7和GC glnA7-2yM FIP&BIP引 物、0.25μΜ F3&B3和0.5μΜ環(huán)引物。所有探針均以0.625μΜ的終濃度使用。使用ABI7500實(shí)時(shí) PCR儀，在63 °C的恒定溫度下運(yùn)行LAMP反應(yīng)60min。視情況，在SybrGreen/FAM、Joe或Cy3通道 中獲得熒光信號的讀數(shù)。
[0052] 探針序列
[0059] 靶序列
[0060] 實(shí)施例中所用的靶DNA序列是
[0061 ] SEQ ID Νο·8:沙眼衣原體G/SotonGl質(zhì)粒pSotonGl全序列（GenBank:HE603235.1)
[0065] SEQ ID Νο·9:淋病奈瑟氏菌1類外膜蛋白的部分porA基因，隔離物GC3(GenBank: HE681886.1)
[0068] SEQ ID如.10:淋病奈瑟氏菌谷氨酰胺合成酶^1以)基因 411^-14等位基因，部 分cds(GenBank:AF520262·1)
[0070] LAMP反應(yīng)中所用的引物序列如下：
[0071] CT 質(zhì)粒
[0091] 緩沖液
[0092] 本
【申請人】已經(jīng)開發(fā)了與本發(fā)明探針一起使用的緩沖體系，并且在以下實(shí)施例中被 命名為V6.21(或不存在V13染料的V6.21p)。緩沖液成分的濃度為緩沖液復(fù)原之后：
[0093] V6.21
[0094] 4-10mM dNTP、10mM鹽、30mM Tris pH8.8、30mM海藻糖、1-8U Bst聚合酶、染料和 0.05% 丙二醇。
[0095] V6.21p
[0096] 4-10mM dNTP、10mM鹽、30mM Tris pH8.8、30mM海藻糖、1-8U Bst聚合酶和0.05% 丙二醇。
[0097] PCR
[0098] 根據(jù)廠商的說明書，利用ΑΡ??ΜΑ CT/GC多重試劑(multiplex)(Gen-Probe)通過實(shí) 時(shí)PCR進(jìn)行臨床樣品中的CT/GC檢測。
[0099]瓊脂糖凝膠電泳
[0100] 在100V下，于1 %瓊脂糖凝膠ΙχΤΑΕ緩沖液中進(jìn)行DNA電泳。LAMP DNA產(chǎn)物通過透照 器用 GelRed(Invitrogen)激發(fā)。
[0101] V6.21和V6.21p緩沖液由本
【申請人】開發(fā)。LAMP引物獲自Eurofins。焚光團(tuán)標(biāo)記的寡 核苷酸購自集成DNA科技(Integrated DNA technologies) Jris緩沖液、瓊脂糖凝膠和PCR 級水購自S i gma。CT和GC DNA標(biāo)準(zhǔn)品獲自ATCC。
[0102] 附圖
[0103] 圖1是本發(fā)明DNA探針的示意圖。所述探針由具有與確定的熒光團(tuán)綴合的內(nèi)部胞嘧 啶的寡核苷酸組成。所述探針可以與側(cè)翼為Fip和Bip引物的擴(kuò)增子的內(nèi)部區(qū)域互補(bǔ)，或者 其可以是用熒光團(tuán)在內(nèi)部標(biāo)記的修飾的環(huán)F或環(huán)B引物。
[0104] 實(shí)施例1
[0105] 圖2A至圖2F顯示了在含有V13的V6.21緩沖液（圖2A、圖2B和圖2C)或無 V13染料的 V6.21p緩沖液（圖2D、圖2E和圖2F)中，用CT PB1 (圖2A和圖2D)、GC glnA7(圖2B和圖2E)和GC porA7(圖2C和圖2F)引物生成的擴(kuò)增圖譜。SEQ ID N0s.8至10所示的靶序列分別具有與FAM 綴合的CT PB1內(nèi)部探針、與Joe綴合的GC glnA7環(huán)探針以及與Alexa546綴合的GC porA7環(huán) 探針。所有反應(yīng)都使用ABI7500儀在63°C的恒定溫度下進(jìn)行60min。
[0106] 實(shí)施例2
[0107]圖3A和圖3B是在存在與FAM綴合的CT PB1內(nèi)部探針的情況下，用CT PB1引物生成 的LAMP產(chǎn)物的熔解曲線分析。每個(gè)反應(yīng)100pg ATTC CT DNA標(biāo)準(zhǔn)品用作陽性對照。A-標(biāo)準(zhǔn)化 的報(bào)告圖譜，B-衍生的報(bào)告圖譜。基于使用ABI7500儀在FAM通道中的讀數(shù)，生成熔解曲線圖 譜。
[0108] 實(shí)施例3
[0109]圖4A和圖4B在存在與J0E綴合的GC glnA7環(huán)探針的情況下，用GC glnA7引物生成 的LAMP產(chǎn)物的熔解曲線分析。每個(gè)反應(yīng)100pg ATTC GC DNA標(biāo)準(zhǔn)品用作陽性對照。圖4A顯示 了標(biāo)準(zhǔn)化的報(bào)告圖譜，圖4B顯示了衍生的報(bào)告圖譜?；谑褂肁BI7500儀在J0E通道中的讀 數(shù)，生成熔解曲線圖譜。
[0110] 實(shí)施例4
[0111] 圖5A和圖5B在存在與ALEXA546綴合的GC porA7環(huán)探針的情況下，用GC porA7引物 生成的LAMP產(chǎn)物的熔解曲線分析。每個(gè)反應(yīng)100pg ATTC GC DNA標(biāo)準(zhǔn)品用作陽性對照。圖5A 顯示了標(biāo)準(zhǔn)化的報(bào)告圖譜，圖4B顯示了衍生的報(bào)告圖譜?；谑褂肁BI7500儀在Cy3通道中 的讀數(shù)，生成熔解曲線圖譜。
[0112] 實(shí)施例5
[0113] 圖6A至圖6D顯示了在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增中，使用本發(fā)明的探針驗(yàn)證DNA產(chǎn)物特異性 的測試結(jié)果。假陽性的遲擴(kuò)增時(shí)間（在LAMP反應(yīng)中可檢測的最低靶DNA濃度（100fg GC DNA) 之后超過30min)表明，非特異性的擴(kuò)增可能是引物二聚化形成的結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線分析 無法區(qū)分該LAMP反應(yīng)中的特異性產(chǎn)物和非特異性產(chǎn)物，但是非特異性產(chǎn)物可以用本發(fā)明的 探針識(shí)別。GC DNA用GC porA7引物擴(kuò)增，并視情況用V13染料或GC porA7-ALEXA546探針顯 現(xiàn)。
[0114] 實(shí)施例6
[0115] 圖7顯示了在含有V13的V6.21緩沖液或無 V13染料的V6.21p緩沖液中，但是在存在 具有與FAM綴合的內(nèi)部C和3'終止子(3'ddC)的CT PB1末端探針（與環(huán)區(qū)域互補(bǔ)）的情況下， 用CT PB1引物生成的擴(kuò)增圖譜。盡管通過激發(fā)對照反應(yīng)中的V13染料驗(yàn)證了靶DNA的成功擴(kuò) 增，但是具有3'終止子的CT PB1探針并未生成陽性信號。
[0116] 實(shí)施例7
[0117] 圖8A和圖8B顯示了在含有R0X的V6.21p緩沖液中，在存在CT PB1引物和具有與FAM 綴合的內(nèi)部胞嘧啶的CT PB1末端探針（圖8A)，以及通用引物和具有與FAM綴合的3 '末端胞 嘧啶的3'UP探針（圖8B)的情況下，生成的擴(kuò)增圖譜。第一條線代表由R0X生成的信號，第二 條線對應(yīng)于FAM通道中生成的信號。具有內(nèi)部標(biāo)記的C的探針與靶DNA的結(jié)合導(dǎo)致FAM激發(fā)。 具有3 '端C標(biāo)記的探針與靶標(biāo)的結(jié)合不改變FAM激發(fā)態(tài)。
[0118] 實(shí)施例8
[0119] 圖9A至圖9C顯示了在無 V13的V6.21p緩沖液中，在存在具有與FAM綴合的內(nèi)部C的 CT PB1內(nèi)部探針和參照染料(R0X)的情況下，用CT roi引物生成的擴(kuò)增圖譜。圖9A顯示了原 始數(shù)據(jù)，來自FAM通道的讀數(shù)在第一條線中，和來自R0X通道的讀數(shù)在第二條線中。圖9B顯示 了相對于ROX標(biāo)準(zhǔn)化的（FAM通道中生成的）擴(kuò)增圖譜。圖9C顯示了衍生的報(bào)告熔解曲線圖 譜。
[0120] 實(shí)施例9
[0121] 圖10A至圖10C顯示了CT roi-FAM探針特異性的驗(yàn)證。圖10A顯示了在存在CT DNA 和CT引物的情況下，用CT PB1-FAM探針生成的擴(kuò)增圖譜。作為對照，進(jìn)行了兩組反應(yīng)，其中 非特異性基因 --GC glnA7和GC porA7在存在CT PB1-FAM探針的情況下用相應(yīng)的LAMP引 物擴(kuò)增。在V6.2lp緩沖液中，在存在CT PB1探針的情況下，在FAM通道中，僅當(dāng)反應(yīng)中存在CT DNA時(shí)才生成擴(kuò)增圖譜，并且當(dāng)非特異性基因 （GC glnA7和GC porA7)被擴(kuò)增時(shí)，沒有信號生 成。當(dāng)在其中用CT引物擴(kuò)增CT DNA的反應(yīng)中使用非特異性探針時(shí)，也沒有信號生成。圖10C 顯示了在類似的實(shí)驗(yàn)但是在含有嵌入染料V31的V6.21緩沖液中進(jìn)行所獲得的數(shù)據(jù)。圖10C 顯示了在圖10A所述的實(shí)驗(yàn)中生成的DNA產(chǎn)物。
[0122] 實(shí)施例10
[0123] 圖11A和圖11B顯示了CT roi-FAM探針針對ΑΡ??ΜΑ CT測定的驗(yàn)證。證實(shí)為CT陽性 (n = 29)(圖11A)或陰性(n = 21)(圖11B)的50份臨床樣品在具有CT PB1-FAM探針的V6.21p 緩沖液中測試。用CT roi-FAM探針，50份樣品中有24份測試為CT陰性（圖11A)，有26份測試 為CT陽性（圖11B)。Apt imA和CT PB-FAM測試之間具有86 %的一致性。
[0124] 實(shí)施例11
[0125] 圖 12A和圖 12B顯示了在具有CT PB1-FAM+GC porA7-Alexa546探針的CT/GC多重試 劑中生成的擴(kuò)增圖譜。在V6.21p緩沖液中，在存在CT PB1-FAM和GC porA7-Alexa546探針的 情況下，在單獨(dú)的反應(yīng)中或以組合來擴(kuò)增CT和GC DNA。在Cy3(圖12A)和FAM(圖12B)通道中 讀取讀數(shù)。該實(shí)驗(yàn)顯示，用FAM和Alexa546標(biāo)記的探針可以在同時(shí)發(fā)生的反應(yīng)中擴(kuò)增和檢測 兩種DNA靶標(biāo)，并且CT PB1和GC porA7引物和探針之間沒有交叉反應(yīng)性。
[0126] 實(shí)施例12
[0127] 表 1 顯示了CT和GC的V13LAMP，CT/GC Aptima以及CT/GC多重試劑（CT PB1-FAM+GC porA7-Alexa546)之間的比較。從136份臨床樣品提取的DNA，用CT/GC Aptima多重試劑，用 在含有V13的V6.21緩沖液中的CT PB1和GC porA7引物，或在存在CT PB1和GC porA7引物以 及CT PB1-FAM和GC porA7-Alexa546探針的v6.21p緩沖液的多重反應(yīng)中進(jìn)行測試。在對照 實(shí)驗(yàn)中，用GC glnA7-joe探針以單一反應(yīng)對樣品進(jìn)行測試。該表顯示測試之間的一致性得 分。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于等溫核酸擴(kuò)增的探針，其包含與靶核酸序列的區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸探針序列， 其中所述寡核苷酸探針序列僅具有一個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記物，并且該標(biāo)記物與內(nèi)部胞嘧啶堿基結(jié) 合，以及其中所述寡核苷酸探針序列沒有3'端終止子。2. 如權(quán)利要求1所述的探針，其中除了3'端的第1-3位和5'端的第1位之外，所述胞嘧啶 堿基基本上位于寡核苷酸長度的中心。3. 如權(quán)利要求1或2所述的探針，其中所述寡核苷酸探針序列是DNA序列，并且所述靶核 酸序列是DNA序列。4. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的探針，其中所述熒光團(tuán)包括選自以下的任意一種或 多種：FAM、JOE、TET、HEX、TAMRA、ROX、ALEXA 和 ATTO。4. 如權(quán)利要求4所述的探針，其中所述熒光團(tuán)是FAM、Joe或Alexa546。5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的探針，其包含以下序列： 5'Xn OXm 3'（SEQ ID N0.1) 其中n>l，m>3，X是核苷酸堿基，以及*是熒光團(tuán)。6. 如權(quán)利要求5所述的探針，其中所述核苷酸堿基選自A、T、C和G，n大于1至20或20以 下，更優(yōu)選大于1至10或10以下，以及m大于3至20或20以下，優(yōu)選大于3至10或10以下。7. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的探針，其包含以下序列的一個(gè)或多個(gè)： SEQ ID NO.3: TAAGATAAC [ C-FAM ] CCGCACGTG (CT PB I-FAM 內(nèi)部） SEQ ID NO.5: GCGAACATA[C-ALEXA546]CAGCTATGATCAA(GC porA7-joe環(huán)F)或 SEQ ID NO.6: ATGTTCA[C-JOE]CATGGCGGAG(GC glnA7-ALEXA546環(huán)B)。8. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的探針，其中所述靶核酸來自微生物、真菌、酵母或病 毒。9. 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增探針，其如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述。10. 檢測樣品中靶核酸序列的方法，其包括： 擴(kuò)增樣品中的靶核酸以提供擴(kuò)增的核酸； 用權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的探針探測所述擴(kuò)增的核酸；以及 檢測靶核酸的存在，其中探針熒光的增加指示所述樣品中靶核酸的存在。11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述靶核酸來自微生物、真菌、酵母或病毒。12. 如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述祀核酸來自沙眼衣原體（ChIamydia trachomatis)或淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae) 〇13. 診斷患者中衣原體和/或淋病感染的方法，其包括： 提供來源于所述患者的樣品； 將一種或多種權(quán)利要求1至9所述的探針添加至所述樣品；以及 檢測來源于沙眼衣原體和/或淋病奈瑟氏菌的核酸的存在，其中探針熒光的增加指示 沙眼衣原體和/或淋球菌感染的存在。14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中將對來自沙眼衣原體或淋病奈瑟氏菌的核酸特異 的單一類型的探針添加至所述樣品。15. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中將至少兩種不同的探針添加至所述樣品，其中第一 探針用第一熒光標(biāo)記物標(biāo)記，并且其對探測沙眼衣原體核酸是特異的，以及第二探針用不 同于所述第一探針的熒光標(biāo)記物標(biāo)記，并且其對探測淋病奈瑟氏菌核酸是特異的。16. 如權(quán)利要求10至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中在緩沖液體系中提供所述探針，所述 緩沖液體系包含濃度為I-IOmM的dNTP、每一種鹽的濃度為2-20mM的一種或多種鹽、濃度為 IO-IOOmM的Tris pH8.8、濃度為IO-IOOmM的海藻糖、量為1U-12U的BST聚合酶以及0.01%-1 %的1,2-丙二醇。17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述一種或多種鹽選自KCl、（NH4)2S〇4和MgS〇4。18. 用于檢測靶核酸的試劑盒，其包含權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的探針、環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增試劑緩沖液、酶、dNTP以及一種或多種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物。19. 如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其還包含陽性對照和陰性對照。20. 如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述試劑緩沖液包含濃度為I -I OmM的dNTP、濃度 為2-20mM的一種或多種鹽、濃度為IO-IOOmM的Tris pH8.8、濃度為IO-IOOmM的海藻糖、量為 1U-12U的BST聚合酶以及0.01 %-1 %的1，2-丙二醇。21. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述一種或多種鹽選自KCl、（NH4)2S〇4和MgS〇4。
【文檔編號】C12R1/36GK105899674SQ201480057385
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月30日
【發(fā)明人】莫尼卡·伊沃娜·蘇瓦拉, 賽義德·賈韋德, 伊利莎白·安·吉利斯
【申請人】馬斯特集團(tuán)有限公司