本發(fā)明涉及生物檢測試劑及方法，基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光技術(shù)，涉及一種植物檢測方法，具體涉及一種用于檢測玉米特定基因invertase（IVR）的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光引物及其環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光檢測方法。

背景技術(shù)：

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP）是Notomi等于2000年發(fā)明的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4-6條特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等溫條件下（60-65℃）反應(yīng)，在1h內(nèi)即可完成核酸擴增反應(yīng)，目的片段可以擴增10⁹倍。該方法具有特異性強、靈敏度高、擴增效率高、省時、操作簡單等優(yōu)點，在核酸檢測方面具有明顯優(yōu)勢。目前環(huán)介導(dǎo)等溫檢測技術(shù)的產(chǎn)物檢測方法主要有濁度法、染料法、電泳法以及核酸試紙條，但是這些方法都容易引起交叉污染。

invertase（IVR）基因為玉米本身固有基因。利用玉米本身固有的基因invertase（IVR）作為參照指示基因的檢測方法，主要集中在普通的定性及定量PCR方法和標準，尚無關(guān)于檢測玉米特定位點的環(huán)介導(dǎo)等溫檢測技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明建立了一種針對于玉米的檢測方法，本發(fā)明的一個目的是提供了一套環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測玉米用引物；本發(fā)明的第二個目的是建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法；根據(jù)檢測方法實現(xiàn)了本發(fā)明的第三個目的，提供了使用上述檢測用引物的試劑盒；本發(fā)明的試劑盒和檢測方法具有簡便、靈敏、快速、特異性好等特點，提供了一種擴增效率高、準確度高的檢測玉米的方法。

本發(fā)明的第一個目的提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光技術(shù)檢測玉米方法的4條檢測引物，序列分別為：

上游外引物，IVR-F3：CTGGGAGGGAGGGAGGGGCTCTGTACAAGCGTGCA（SEQ ID NO.1）

下游外引物，IVR-B3：

CTGGGAGGGAGGGAGGGCCCGTTTCCTAGCTCATTGT（SEQ ID NO.2）

上游內(nèi)引物，IVR-FIP：

GCGCAAAGTGTTGTGCTTGGACCTGGGAGGGAGGGAGGGTTTCCGTCTACTCGAGCCTA（SEQ ID NO.3）

下游內(nèi)引物，IVR-BIP：

GCGACAGAGATGTATGGCGCCCTGGGAGGGAGGGAGGGACAGTCTCTGACTACGGTGT（SEQ ID NO.4）。

核酶是一種具有類過氧化物酶活性、富含鳥嘌呤的單鏈DNA分子，在特定的條件下能夠折疊成G4重結(jié)構(gòu)，在H₂O₂存在下能夠催化無色底物2,2′-連氮基-雙-（3-乙基并二氫噻唑啉-6-磺酸）二價陰離子（ABTS^2-）氧化成藍綠色物質(zhì)ABTS^-·自由基。當存在單鏈DNA分子的互補鏈時，這種類過氧化物酶的活性降低甚至消失。將折中顯色/消光技術(shù)結(jié)合到環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)上，利用引物顯色，產(chǎn)物消光的手段，來驗證目的片段的存在。

本發(fā)明通過巧妙地設(shè)計引物，使引物既可高效擴增玉米的IVR基因，又可作為具有類過氧化物酶活性的單鏈DNA分子，實現(xiàn)上述功能。

第二方面，本發(fā)明提供了一種擴增效率高、準確度高的檢測玉米的方法，即利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光技術(shù)用前述引物對樣品的DNA進行擴增，通過檢測是否有擴增產(chǎn)物來判斷是否含有IVR基因，從而判斷待測樣品是否有玉米成分，即待測樣品中是否有玉米成分。

本發(fā)明提供的檢測玉米的方法包括以下步驟：

（1）提取待測樣品基因組模板；

（2）顯色反應(yīng)：將hemin工作液與本發(fā)明SEQ ID NO.1-4所述引物混合，添加ABTS顯色液和H₂O₂后得到顯色反應(yīng)混合液，立刻記錄顏色或在419nm處測定吸光值；

（3）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光反應(yīng)：向顯色反應(yīng)混合液中添加樣品基因組模板，在60～65℃進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光反應(yīng)40～60min；

（4）產(chǎn)物檢測：目視判定反應(yīng)顏色，或在419nm處測定吸光值，通過與步驟（2）的結(jié)果比較，判斷是否有擴增產(chǎn)物，當顏色由藍色變?yōu)闇\色或無色或者當OD_419nm值變小，說明有目的產(chǎn)物，待測樣品為玉米陽性。

步驟（2）中，將40～60μM的hemin工作液與1.25μM的上游外引物和下游外引物以及10μM的上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物混合，在35～45℃條件下孵育20～30min，添加30～40mM的ABTS顯色液和50～60mM的H₂O₂后得到顯色反應(yīng)混合液。

其中，步驟（3）是向顯色反應(yīng)混合液中添加1.4～2.0mM dNTP、3～8mM MgSO₄、0.6～0.8M甜菜堿、3.6～10.0U Bst DNA聚合酶大片段、1×Thermopol buffer，2μL樣品基因組模板，再進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光反應(yīng)。

所述hemin工作液由hemin溶于工作液配制，該工作液含有10mMNaH₂PO₄、100mM KCl、2mM MgCl₂以及0.003%Triton X-100。

在該顯色體系條件下進行顯色反應(yīng)，能夠保證引物最大程度的折疊成G4結(jié)構(gòu)，與hemin充分結(jié)合，發(fā)揮出類過氧化物酶的最大活性，保證顯色程度最佳；在該擴增體系條件下進行擴增，能夠保證引物的擴增效率不受影響，在短時間內(nèi)實現(xiàn)快速擴增，保證盡可能多的核酶引物形成雙鏈產(chǎn)物，從而失去類過氧化物酶活性，使得反應(yīng)體系消光。

第三方面，本發(fā)明提供一種檢測玉米的試劑盒，含有序列如SEQ ID NO.1-4所示的引物。

進一步地，本發(fā)明的試劑盒還含有工作液、hemin、ABTS粉劑、DMSO緩沖液、30%H₂O₂，以及1×Thermopol buffer、dNTP、MgSO₄、甜菜堿組成的反應(yīng)液和Bst DNA聚合酶；所述工作液含有10mM NaH₂PO₄、100mM KCl、2mM MgCl₂以及0.003%Triton X-100。

優(yōu)選地，反應(yīng)液是由體積比為5:8:1:10的1×Thermopol buffer、1.4-2.0mM dNTP、3-8mM MgSO₄、0.6-0.8M甜菜堿組成。

在所述試劑盒中，所述引物以引物混合液的形式存在，所述引物混合液中含有1.25μM的上游外引物IVR-F3和下游外引物IVR-B3，含有10μM的上游內(nèi)引物IVR-FIP和下游內(nèi)引物IVR-BIP。

Bst DNA聚合酶凍干在PCR管內(nèi)底部。其中混合液、工作液、ABTS粉劑、DMSO緩沖液、30%H₂O₂可常溫保存，反應(yīng)液需4℃保存，Bst DNAq聚合酶需-20℃保存。

本發(fā)明提供了上述試劑盒在檢測轉(zhuǎn)基因玉米中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、反應(yīng)快速，一般情況下在15～30min即可有大量的擴增產(chǎn)物生產(chǎn)，為了保證檢測的準確度，本發(fā)明選擇反應(yīng)時長為40min，在此時間內(nèi)即可將模板擴增10⁹倍，該方法操作簡便，適于核酸分子的快速檢測。

2、特異性好，該技術(shù)對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計引物，引物具有更高的特異性。

3、靈敏度高，該技術(shù)反應(yīng)速度快，對于痕量目的基因可以達到很好的檢測效果，靈敏度比PCR方法高一到兩個數(shù)量級，該技術(shù)為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)督檢測提供了技術(shù)支持。

4、操作簡單，適于基層使用。本發(fā)明設(shè)計了檢測玉米的試劑盒，操作簡單，不需要專業(yè)人員操作，結(jié)果易于觀察，非常適于基層檢測使用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例5中環(huán)介導(dǎo)等溫消光擴增反應(yīng)電泳結(jié)果；其中，泳道1為陽性擴增，泳道2為陰性擴增，M為D2000maker。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1引物的設(shè)計與確定

通過日本榮巖株式會社環(huán)介導(dǎo)引物在線設(shè)計軟件LAMP primer designing software primerexplorer V4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)針對玉米的IVR基因序列設(shè)計引物，使引物既可擴增玉米的IVR基因，又可作為具有類過氧化物酶活性、富含鳥嘌呤的單鏈DNA分子，使其能夠在特定的條件下折疊成G4重結(jié)構(gòu)，在H₂O₂存在下能夠催化無色底物2,2′-連氮基-雙-（3-乙基并二氫噻唑啉-6-磺酸）二價陰離子（ABTS^2-）氧化成藍綠色物質(zhì)ABTS^-·自由基。當存在單鏈DNA分子的互補鏈時，類過氧化物酶的活性降低甚至消失。將折中顯色/消光技術(shù)結(jié)合到環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)上，利用引物顯色，產(chǎn)物消光的手段，來驗證目的片段的存在。引物由上海英濰捷基有限公司合成，將引物稀釋為10μmol/L。

經(jīng)過反復(fù)篩選研究，排除效果較差的引物組合，本發(fā)明設(shè)計的最佳檢測效果的引物為：

上游外引物，IVR-F3：

CTGGGAGGGAGGGAGGGGCTCTGTACAAGCGTGCA（SEQ ID NO.1）

下游外引物，IVR-B3：

CTGGGAGGGAGGGAGGGCCCGTTTCCTAGCTCATTGT（SEQ ID NO.2）

上游內(nèi)引物，IVR-FIP：

GCGCAAAGTGTTGTGCTTGGACCTGGGAGGGAGGGAGGGTTTCCGTCTACTCGAGCCTA（SEQ ID NO.3）

下游內(nèi)引物，IVR-BIP：

GCGACAGAGATGTATGGCGCCCTGGGAGGGAGGGAGGGACAGTCTCTGACTACGGTGT（SEQ ID NO.4）。

與普通LAMP引物相比，本發(fā)明的內(nèi)側(cè)引物由兩條引物以及DNAzyme序列構(gòu)成，根據(jù)引物設(shè)計原則，添加DNAzyme序列后F1c與F2之間序列邊長，則要求F1c與F2之間原始序列不超過35bp，同理B1與B2c之間原始序列不超過35bp，否則，內(nèi)側(cè)引物則無法折疊成啞鈴狀結(jié)構(gòu)。

實施例2玉米檢測方法的建立

（1）稱取100mg玉米粉，用CTAB方法提取基因組；

（2）選用實施例1篩選的最佳引物進行實驗，引物由上海英濰捷基有限公司合成，將引物稀釋為10μmol/L；

（3）對影響顯色反應(yīng)的因素(hemins、孵育溫度、時間、ABTS、H₂O₂)進行了優(yōu)化，確定最優(yōu)的顯色/消光反應(yīng)體系：50μM hemin工作液，添加1.25μM外引物IVR-F3和IVR-B3，10μM內(nèi)引物IVR-FIP和IVR-BIP，40℃孵育30min，然后添加36mM ABTS顯色液，60mM H₂O₂，立即判定顏色，測定OD₄₁₉；（4）LAMP擴增反應(yīng)體系：向（3）的反應(yīng)液中添加1.6mM dNTP、6mM MgSO₄、0.8M甜菜堿，8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol buffer。擴增反應(yīng)程序：65℃反應(yīng)40min；

（5）結(jié)果分析：擴增后顏色由藍色變淺或無色，或OD₄₁₉值變小，說明含有目的產(chǎn)物。

實施例3環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

為保證顯色體系最佳，本發(fā)明對下述各反應(yīng)因素進行優(yōu)化。

1.顯色時間的優(yōu)化

40μM hemin工作液，添加1.25μM外引物IVR-F3和IVR-B3，10μM內(nèi)引物IVR-FIP和IVR-BIP，35℃孵育30min，然后添加30mM ABTS顯色液，60mM H₂O₂。利用紫外分光光度計測定所得反應(yīng)混合液在0s、30s、1min、2min、5min、10min、30min的OD_419nm值。陰性對照不添加引物，用ddH₂O替代。根據(jù)表1結(jié)果可知，隨著時間的延長，陽性和陰性的顯色都會顯著增加，通過陽性和陰性的比值發(fā)現(xiàn)，測量時間越早越好，本發(fā)明采用顯色后立即測定OD值。

表1不同顯色時間下的顯色結(jié)果

2.孵育溫度和時間的優(yōu)化

陽性反應(yīng)（+）：40μM hemin工作液，添加1.25μM外引物IVR-F3和IVR-B3，10μM內(nèi)引物IVR-FIP和IVR-BIP，35-45℃孵育20-30min，然后添加30mM ABTS顯色液，60mM H₂O₂，利用紫外分光光度計立即測定所得反應(yīng)混合液的OD_419nm值。陰性對照（-）不添加引物，用ddH₂O替代。根據(jù)表2結(jié)果可知，隨著時間的延長，陽性和陰性的顯色都會逐漸增加，通過陽性和陰性的比值發(fā)現(xiàn)，后期結(jié)果差異不大，本發(fā)明采用的孵育條件為40℃，30min。

表2不同孵育溫度及時間下的顯色結(jié)果（OD_419nm值）

3.濃度的優(yōu)化

40-60μM hemin工作液，添加1.25μM外引物IVR-F3和IVR-B3，10μM內(nèi)引物IVR-FIP和IVR-BIP，40℃孵育30min，然后添加30-50mM ABTS顯色液，60mM H₂O₂，利用紫外分光光度計立即測定所得反應(yīng)混合液的OD_419nm值。陰性對照不添加引物，用ddH₂O替代。根據(jù)表3結(jié)果可知，隨著hemin濃度的增加，陽性（+）的顯色都會逐漸增加，這是由于與核酶結(jié)合的量增加了，隨著ABTS濃度的增加，陽性的顯色逐漸增加，但是陰性（-）的顯色也會逐漸增加，這是由于顯色底物本身的顏色增加了，背景值的增加造成陽性和陰性的比值下降，本發(fā)明采用的最有條件為hemin 50μM,ABTS 36mM。

表3不同hemin工作液及ABTS顯色液的顯色結(jié)果（OD_419nm值）

實施例4試劑盒檢測樣品中玉米的特異性及靈敏度

（1）樣品基因組模板制備：稱100mg粉狀樣品，用CTAB方法提取基因組，樣品包含：非轉(zhuǎn)基因玉米，轉(zhuǎn)基因玉米T25，轉(zhuǎn)基因玉米MIR604，轉(zhuǎn)基因玉米Bt176，轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2，轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1和轉(zhuǎn)基因油菜GT73。靈敏度驗證時將非轉(zhuǎn)基因玉米基因組的濃度調(diào)整為10⁵pg/μL，然后將此濃度的基因組10倍倍比稀釋為10⁴，10³，10²，10，1pg/μL，制備成系列剃度濃度的標準DNA模板。

（2）顯色反應(yīng)：配制50μM hemin工作液、36mM ABTS顯色液以及60mM H₂O₂，在含有Bst DNA聚合酶凍干粉的PCR管中配制反應(yīng)體系，添加引物混合物9μL，hemin反應(yīng)液90μL，40℃孵育30min，添加ABTS顯色液29μL以及1μL H₂O₂，立即判定顏色，測定OD₄₁₉。

（3）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光反應(yīng)：上述混合液中，添加反應(yīng)液12μL，DNA模板2μL，65℃水浴鍋中反應(yīng)40min，判定顏色，測定OD₄₁₉。

（4）結(jié)果分析：反應(yīng)前后的OD₄₁₉值見下表，規(guī)定反應(yīng)前OD₄₁₉為A，反應(yīng)后OD₄₁₉為B。顯色反應(yīng)液最初呈藍色，擴增后，含有樣品基因組的反應(yīng)液接近無色，OD₄₁₉降低，陰性對照為不添加基因組模板反應(yīng)液仍然呈藍色，OD₄₁₉維持不變，由此判定含有玉米成分。

表4試劑盒檢測樣品中玉米的特異性及靈敏度

由表4可知，所有玉米都發(fā)生了消光反應(yīng)，非玉米的OD₄₁₉基本保持一致，證明該檢測方法具有較好的特異性。靈敏度試驗中，擴增后陽性O(shè)D_419nm值隨著基因組濃度的增加而降低，陰性對照OD_419nm值與原OD值基本一致，由此判定本方法的最低檢測限為10pg。

實施例5含有本發(fā)明引物的試劑盒檢測樣品中玉米成分

（1）基因組模板的提?。悍Q100mg待測樣品，用CTAB方法提取基因組。

（2）顯色反應(yīng)：配制50μM hemin工作液、40mM ABTS顯色液以及60mM H₂O₂，在含有Bst DNA聚合酶凍干粉的PCR管中配制反應(yīng)體系，添加引物混合物9μL，hemin反應(yīng)液90μL，40℃孵育30min，添加ABTS顯色液29μL以及1μL H₂O₂，立即判定顏色，測定OD_419nm。

（3）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光反應(yīng)：上述混合液中，添加反應(yīng)液12μL，DNA模板2μL，65℃水浴鍋中反應(yīng)40min，判定顏色，測定OD₄₁₉。

（4）結(jié)果分析：步驟（2）中顯色反應(yīng)液呈藍色，OD₄₁₉為0.73425，擴增后反應(yīng)液接近無色，OD₄₁₉為0.15634，陰性對照反應(yīng)液呈藍色，OD₄₁₉為0.73462，擴增后反應(yīng)液維持藍色，OD₄₁₉為0.0.71556，差異不大。經(jīng)過上述環(huán)介導(dǎo)等溫消光擴增，得到的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，表現(xiàn)出典型的LAMP階梯狀產(chǎn)物條帶。該結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒可直接用于玉米成分的檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農(nóng)業(yè)大學

<120> 基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增消光技術(shù)的玉米檢測方法

<130> KHP161116357.3

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgggaggga gggaggggct ctgtacaagc gtgca 35

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgggaggga gggagggccc gtttcctagc tcattgt 37

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgcaaagtg ttgtgcttgg acctgggagg gagggagggt ttccgtctac tcgagccta 59

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgacagaga tgtatggcgc cctgggaggg agggagggac agtctctgac tacggtgt 58