主要組織相容性復(fù)合體單核苷酸多態(tài)性的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的中心區(qū)域的γ基因組區(qū)塊中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的鑒定，其可用于匹配移植供體與受體及確定疾病易感性。
【專利說明】
主要組織相容性復(fù)合體單核苷酸多態(tài)性
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的中心區(qū)域的γ基因組區(qū)塊中的單核苷 酸多態(tài)性(SNP)的鑒定，其可用于匹配移植供體與受體及確定疾病易感性。
【背景技術(shù)】
[0002] 主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是在6號染色體的短臂上的大約4Mb的基因密集區(qū) 域。MHC包含很多免疫應(yīng)答基因，包括編碼人類白細胞抗原(HLA)的基因。MHC也包含很多參 與免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的基因，并且與多種自身免疫和炎性疾病相關(guān)。
[0003 ] MHC通常作為完整區(qū)塊得到遺傳;然而，據(jù)顯示在MHC的特定區(qū)域會以約1 /100次減 數(shù)分裂的頻率發(fā)生重組。在這些重組熱點之間，是長度至多幾百kb的DNA基因組區(qū)塊。因此， 在一個群體中，許多無關(guān)個體(unrelated individuals)具有保守單倍型(haplotype)，或 具有來自保守單倍型的重組區(qū)塊。所述保守單倍型指"擴展單倍型"或"祖先單倍型"。
[0004] 在MHC中有4個主要的基因組區(qū)塊。這些基因組區(qū)塊的精確界限是未知的，并且在 主要基因組區(qū)塊之間可能存在更小的基因組區(qū)塊。主要區(qū)塊為區(qū)塊，其包括HLA_A;i3區(qū) 塊，其包括HLA-B和HLA-C; γ區(qū)塊，其包括Bf、C2和C4基因；及δ區(qū)塊，其包括HLA-DRB及DQB1 基因。HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1及HLA-DPB1基因目前用于匹配移植供體和 受體。因在δ區(qū)塊和HLA-DTOl的基因之間觀察到高重組率，HLA-DPB1可能是在δ區(qū)塊的著絲 粒側(cè)的單獨區(qū)塊中。然而，HLA-DPB1經(jīng)常針對移植匹配而分型。據(jù)顯示，HLA匹配對于干細胞 移植后的結(jié)果改善至關(guān)重要。此外，Petersdorf等（2007)的研究顯示，如果HLA匹配的供體 和受體是單倍型匹配的，那么移植無關(guān)干細胞后的結(jié)果與HLA匹配但單倍型不匹配的供體/ 受體對相比會有所改善。在該研究中，來自供體和受體的基因組DNA被提取并且雜交到微陣 列上，該微陣列包含被配置成檢測HLA等位基因間的物理連鎖的寡核苷酸探針。所述方法不 適于常規(guī)HLA分型，且迄今為止未有用于評估或改善單倍型匹配可能性的常規(guī)測試的描述。
[0005] 在分子生物學(xué)的某些方面，單倍型被描述為存在于2個核苷酸多態(tài)性之間的物理 連鎖。當(dāng)提及HLA和MHC時，術(shù)語單倍型用于描述整個MHC，其跨度至少在HLA-A到HLA-DQB1的 范圍內(nèi)。所述區(qū)域跨度為大約4Mb并且通常完整遺傳。
[0006] 某些單倍型在歷時最多數(shù)千代后仍保持完整，并且除了在無關(guān)個體間的少量SNP 外，其在序列上保持同一。不同的祖先單倍型包含HLA等位基因的獨特組合，并且在整個MHC 的許多區(qū)域具有獨特的序列內(nèi)容。與HLA匹配但單倍型不匹配的個體相比，單倍型/HLA匹配 的個體具有減少的移植物抗宿主病(GVHD)，這可能是因為單倍型匹配個體共享完整的或部 分祖先單倍型并且因此也共享許多獨特序列。
[0007] 最佳的干細胞供體是同卵雙胞胎，其次是HLA單倍同一性兄弟姐妹。鑒定HLA單倍 同一性兄弟姐妹的相對低的可能性經(jīng)常導(dǎo)致需要鑒定適合的無關(guān)的HLA匹配的供體，其可 以通過供體登記來獲得。然而，就算是HLA匹配的，成功結(jié)果的可能性通常仍低于單倍同一 性兄弟姐妹。認為結(jié)果差距的一個原因可能是單倍同一性兄弟姐妹在MHC內(nèi)的其它基因或 序列上匹配，這可能有助于移植結(jié)果。
[0008] GVHD是同種異基因組織移植后常見的并發(fā)癥。其通常與干細胞或骨髓移植有關(guān)， 但該術(shù)語也適用于其它形式的組織移植。組織（移植物）中的免疫細胞（白細胞）識別受體 (宿主)為"外來的"。該疾病的急性或暴發(fā)性形式(aGVHD)通常在移植后100天內(nèi)觀察到，并 且由于關(guān)聯(lián)的發(fā)病率和死亡率，其是移植的主要挑戰(zhàn)。急性移植物抗宿主病以選擇性破壞 肝、皮膚(皮疹）、粘膜和胃腸道為特征。較新的研究表明移植物抗宿主病的其它靶器官包括 免疫系統(tǒng)(造血系統(tǒng)，例如，骨髓和胸腺）自身和特發(fā)性肺炎形式的肺。
[0009] 急性GVHD憑借受累器官的數(shù)量和程度來分期和分級(Ο-IVhIV級GVHD患者通常具 有不良預(yù)后。如果GVHD是嚴(yán)重的并且要求包含類固醇和其它試劑的強烈免疫抑制來控制， 則患者可能由于免疫抑制而發(fā)展嚴(yán)重的感染并且可能死于感染。
[0010] 因此，仍然需要鑒定受體的移植供體的測試方法，以使受體發(fā)展aGVHD、特別是IV 期(威脅生命)aGVHD的風(fēng)險減少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的發(fā)明人描述了在MHC的γ區(qū)塊編碼或非編碼部分中鑒定獨特的DNA序列 核苷酸或單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其位于MHC的HLA-B/C區(qū)塊(δ區(qū)塊)和HLA-DRB/DQB區(qū)塊(δ 區(qū)塊)之間。多種鑒定出的SNP對多種祖先單倍型是通用的，而其他鑒定出的SNP對祖先單倍 型是特異性的。當(dāng)一起使用時，這些SNP提供了 γ區(qū)塊SNP譜(GBSP)。發(fā)明人示出：大部分無 關(guān)、隨機個體并且因此不可能為HLA匹配的個體，具有獨特的或不匹配的GBSP，而具有相同 GBSP的個體可能是HLA匹配的。因此，所述SNP或GBSP可用于為需要移植的受體鑒定移植供 體。通過同時在潛在的移植供體和受體中匹配MHC γ區(qū)塊的SNP或GBSP，移植受體因 HLA不匹 配供體而發(fā)展GVHD的風(fēng)險降低。另外，當(dāng)在無關(guān)的潛在移植供體和受體中匹配MHC SNP或 GBSP且存在單個HLA型不匹配時，5年后生存的機會大大提高。
[0012] 因此，本發(fā)明的第一方面提供一種為需要移植的受體鑒定移植供體的方法，所述 方法包括：
[0013] a)確定在需要移植的所述受體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基 因的存在；
[0014] b)確定在一個或多個潛在移植供體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等 位基因的存在;及
[0015] c)基于同時在所述移植供體和需要移植的所述受體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單 核苷酸多態(tài)性等位基因的存在，鑒定移植供體。
[0016] 在一個實施方式中，所述方法包括:基于同時在移植供體和需要移植的受體的MHC γ區(qū)塊中至少24個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在，鑒定移植供體。
[0017] 在一個實施方式中，所述單核苷酸多態(tài)性在C4基因中。
[0018] 在一個特定實施方式中，所述單核苷酸多態(tài)性等位基因選自C2321、T9763、C9796、 T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、 G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、 C16954、T17316、T19588和A20170。
[0019]第二方面，本發(fā)明提供一種降低移植受體發(fā)展移植物抗宿主病的可能性的方法， 所述方法包括：
[0020] a)確定在需要移植的受體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的 存在；
[0021] b)確定在一個或多個潛在移植供體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等 位基因的存在；
[0022] 其中，同時在移植受體和一個或多個潛在移植供體的MHC γ區(qū)塊中所述一個或多 個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在或不存在表明所述移植受體在從所述移植供體移植了 移植物后發(fā)展移植物抗宿主病的可能性降低。
[0023] 在一個實施方式中，移植物抗宿主病是嚴(yán)重的移植物抗宿主病。
[0024] 第三方面，本發(fā)明提供一種延長移植受體存活時間的方法，所述方法包括：
[0025] a)確定在需要移植的受體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的 存在；
[0026] b)確定在一個或多個潛在移植供體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等 位基因的存在；
[0027] 其中，同時在移植受體和一個或多個潛在移植供體的MHC γ區(qū)塊中所述一個或多 個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在或不存在表明所述移植受體在從所述移植供體移植了 組織或器官后將經(jīng)歷延長的存活時間。
[0028] 在一個實施方式中，在9/10HLA等位基因處匹配并且對于每個MHCy區(qū)塊單核苷酸 多態(tài)性等位基因都匹配的供體和受體表明所述移植受體在從所述移植供體移植了組織或 器官后將經(jīng)歷延長的存活時間。
[0029]技術(shù)人員會理解，確定一個或多個單核苷酸多態(tài)性的存在或缺失可包括分析來自 所述供體和/或受體的一個或多個核酸樣品，或可包括從例如病理實驗室或基因檢測實驗 室等另一個實體獲得預(yù)定信息(例如核酸序列信息或來自核酸分析的讀出結(jié)果）。
[0030] 因此，在一個實施方式中，確定在需要移植的受體和/或潛在供體的MHCy區(qū)塊中 一個或多個單個多核苷酸多態(tài)性等位基因的存在的步驟包括:獲得預(yù)定的MHCy區(qū)塊單核 苷酸多態(tài)性等位基因信息和/或MHCγ區(qū)塊單倍型信息。
[0031] 在另一個實施方式中，確定在潛在移植供體的受體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單 核苷酸多態(tài)性等位基因的存在的步驟包括:分析來自所述受體和/或來自潛在供體的核酸 樣品以確定所述一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在。
[0032]可以使用本領(lǐng)域任何已知適合的方法來確定一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基 因的存在或不存在。例如，在一個實施方式中，分析核酸樣品包括進行選自PCR-SSP測定、等 位基因特異性探針雜交、等位基因特異性引物延伸、等位基因特異性擴增、核酸測序、5'核 酸酶消化、分子信標(biāo)測定、寡核苷酸連接測定、大小分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性梯度凝 膠電泳和直接核苷酸測序的一種或多種技術(shù)。
[0033]在一個實施方式中，所述方法包括從潛在移植供體和/或受體中獲得生物樣品并 且從所述生物樣品中分離出核酸。在另一個實施方式中，所述核酸樣品從獲自潛在移植供 體和/或受體的生物樣品中分離。所述生物樣品可以是任意適合的細胞或組織，基因組DNA 可從其中提取，例如，所述生物樣品可能是淋巴細胞、全血、頰粘膜拭子、活檢或冷凍組織。 [0034]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，針對MHCy區(qū)塊中的多重單核苷酸多態(tài)性匹配潛在移植供 體和受體進一步降低了供體發(fā)展急性移植物抗宿主病的風(fēng)險。因此，在一個實施方式中，所 述方法包括:確定同時在潛在移植供體和受體的MHC γ區(qū)塊中2個以上單核苷酸多態(tài)性等位 基因的存在。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法包括:確定同時在潛在移植供體和受體的 MHCy區(qū)塊中至少25個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在。
[0035] 在一個實施方式中，MHCy區(qū)塊中的一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因存在于 C4基因中，其中所述C4基因是C4A基因或C4B基因?；蛘撸粋€或多個單核苷酸多態(tài)性等位基 因在C4A基因和C4B基因中均存在。
[0036] 在一個特定的實施方式中，一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因選自C2321、 T9763、C9796、T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、 A12568、A12837、G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、 1'14952、615108、(：16954、1'17316、1'19588和/或厶20170中的一個或多個。
[0037] 在另一個實施方式中，所述方法包括確定C2321、T9763、C9796、T9819、T9881、 T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、A12877、 A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、 T19588和A20170中至少24個的存在。
[0038] 技術(shù)人員會理解本發(fā)明的方法可與在非MHCy區(qū)塊的基因或區(qū)域中檢測一個或多 個等位基因結(jié)合使用，和/或與檢測HLA單倍型結(jié)合使用。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明 的方法進一步包括:在受體和潛在移植供體中檢測一個或多個其它等位基因的存在或確定 一個或多個其它單倍型。
[0039] 在一個實施方式中，所述方法包括確定一個或多個其它HLA等位基因和/或HLA單 倍型。在一個特定的實施方式中，所述方法包括確定HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB 和/或HLA-DPB基因的一個或多個等位基因或單倍型。
[0040] 因此，本發(fā)明的方法可包括基于以下i)或i i)來選擇移植供體：
[0041 ] i)在潛在移植供體和受體的MHC γ區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的 存在，或
[0042] ii)在潛在移植供體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在 和一個或多個其它HLA等位基因和/或HLA單倍型的存在。
[0043] 第四方面，本發(fā)明提供一種將同種異基因移植物移植到受體中的方法，所述方法 包括：
[0044] i)根據(jù)本發(fā)明的方法選擇移植供體，
[0045] i i)從所述移植供體中移出供體移植物，及
[0046] iii)將所述移植物移植到受體中。
[0047] 在一個實施方式中，所述移植物是同種異基因干細胞移植。
[0048]在一個特定的實施方式中，所述干細胞移植是造血干細胞移植。
[0049] 第五方面，本發(fā)明提供一種用于匹配移植供體和受體的試劑盒，所述試劑盒包含：
[0050] a)用于檢測MHCy區(qū)塊中的一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的核酸試劑;和
[0051] b)用于檢測所述一個或多個單個多核苷酸多態(tài)性等位基因的說明書。
[0052] 在一個實施方式中，用于檢測一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的核酸試劑可 以是一個或多個寡核苷酸探針，例如對MHCy區(qū)塊中的一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基 因有特異性的寡核苷酸探針。在一個特定實施方式中，所述寡核苷酸探針對C4基因中一個 或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因具有特異性。
[0053]在另一個實施方式中，所述寡核苷酸探針帶有可檢測標(biāo)記。
[0054] 在一個實施方式中，所述寡核苷酸探針對選自C2321、T9763、C9796、T9819、T9881、 T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、A12877、 A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、 T19588和/或A20170的一個或多個單個多核苷酸等位基因具有特異性。
[0055] 在另一個實施方式中，所述試劑盒包含對C2321、T9763、C9796、T9819、T9881、 T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、A12877、 A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、 T19588和A20170中的每個都具有特異性的寡核苷酸探針。
[0056]在另一個實施方式中，所述試劑盒包含用于擴增MHCy區(qū)塊中的一個或多個單核 苷酸多態(tài)性等位基因的寡核苷酸引物。所述寡核苷酸引物可以是例如等位基因特異性PCR 擴增引物。
[0057]在一個實施方式中，所述寡核苷酸引物用于擴增C4基因中的一個或多個單核苷酸 多態(tài)性等位基因。
[0058]在一個實施方式中，包含寡核苷酸引物的試劑盒進一步包含DNA聚合酶。
[0059] 在一個實施方式中，所述試劑盒適合用于進行一個或多個PCR-SSP測定。
[0060] 在另一個實施方式中，所述試劑盒包含多孔板。
[0061 ]在另一個實施方式中，所述試劑盒包含陰性擴增對照。
[0062] 在一個實施方式中，所述試劑盒包含用于擴增選自C2321、T9763、C9796、T9819、 T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、 A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、 T17316、T19588和/或A20170的一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的寡核苷酸引物。 [0063] 在另一個實施方式中，所述試劑盒包含用于擴增C2321、T9763、C9796、T9819、 T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、 A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、 T17316、T19588和A20170中的每個的寡核苷酸引物。
[0064] 在一個特定的實施方式中，所述試劑盒包含一個或多個寡核苷酸引物，其包含選 自SEQ ID No:3至50的任一個或多個的序列。
[0065] 本發(fā)明進一步提供一種用于匹配移植供體和受體的核苷酸陣列，所述核苷酸陣列 包含對MHCy區(qū)塊中的一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因有特異性的探針。
[0066] 在一個實施方式中，所述探針對C4基因中的一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因 有特異性。
[0067]在另一個實施方式中，所述試劑盒包含對至少24個單核苷酸多態(tài)性等位基因有特 異性的探針。
[0068]在一個特定的實施方式中，所述試劑盒包含對C4基因中的至少24個單核苷酸多態(tài) 性等位基因有特異性的探針。在一個實施方式中，所述試劑盒包含對C2321、T9763、C9796、 T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、 G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、 C16954、T17316、T19588和A20170中的每一個有特異性的探針。
[0069] 第六方面，本發(fā)明提供一種進行一個或多個PCR-SSP測定以檢測MHC γ區(qū)塊中的單 核苷酸多態(tài)性的方法，所述方法包括：
[0070] i)將基因組DNA與DNA聚合酶混合以形成DNA-聚合酶混合物，
[0071] ii)將該DNA-聚合酶混合物與用于擴增來自MHCy區(qū)塊的單核苷酸多態(tài)性等位基 因的寡核苷酸引物合并，以形成反應(yīng)混合物，
[0072] iii)使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷熱循環(huán)以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，及
[0073] iv)分析擴增產(chǎn)物以檢測單核苷酸多態(tài)性。
[0074] 在一個特定的實施方式中，所述擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。
[0075] 在一個實施方式中，所述基因組DNA是高分子量人類基因組DNA。
[0076] 在另一個實施方式中，所述基因組DNA的濃度為約20ngAU至約lOOng/μΙ。
[0077]在一個實施方式中，所述方法包括從生物樣品提取基因組DNA。
[0078]在一個特定實施方式中，所述方法包括從酸-檸檬酸鹽-葡萄糖溶液(A⑶)或EDTA 抗凝全血中提取基因組DNA。
[0079] 在另一個實施方式中，所述基因組DNA的光密度(0D)比的測量值為0D26Q/28()> 1.8。
[0080]單核苷酸多態(tài)性等位基因可以位于MHCy區(qū)塊的任意位置。在一個實施方式中，所 述單核苷酸多態(tài)性等位基因在C4基因中。
[0081] 在一個實施方式中，所述單個核苷酸等位基因多態(tài)性選自C2321、T9763、C9796、 T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、 G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、 C16954、T17316、T19588和/或A20170。
[0082] 在另一個實施方式中，所述方法包括檢測至少24個單核苷酸多態(tài)性等位基因。
[0083] 第七方面，本發(fā)明提供一種為需要移植的受體鑒定移植供體的方法，所述方法包 括:執(zhí)行本發(fā)明的進行一個或多個PCR-SSP測定的方法以鑒定移植受體和/或潛在移植供體 的MHC γ區(qū)塊中的單核苷酸多態(tài)性。
[0084] 在本發(fā)明的第一、第三、第四或第七方面的一個實施方式中，所述供體和受體在9/ 10HLA等位基因處匹配且針對每個MHC γ區(qū)塊單核苷酸多態(tài)性等位基因都匹配。
[0085] 第八方面，本發(fā)明提供一種降低移植受體發(fā)展移植物抗宿主病的可能性的方法， 所述方法包括:執(zhí)行本發(fā)明的進行一個或多個PCR-SSP測定的方法以鑒定移植受體和/或潛 在移植供體的MHC γ區(qū)塊中的單核苷酸多態(tài)性。
[0086] 第九方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的試劑盒或本發(fā)明的核苷酸陣列在鑒定移植受體 和/或潛在移植供體的MHC γ區(qū)塊的單核苷酸多態(tài)性中的應(yīng)用。
[0087] 在第一到第五及第七到第九方面的一個實施方式中，需要移植的受體或移植受體 需要造血干細胞移植或接受造血干細胞移植。
[0088] 可明顯看出本發(fā)明一個方面的優(yōu)選特征或特點可應(yīng)用于本發(fā)明的許多其它方面。 [0089]整個說明書中的詞語"包括"或其變化形式應(yīng)被理解為意味著包含所描述的要素、 整體或步驟或要素、整體或步驟的組，但不排除任何其它要素、整體或步驟或要素、整體或 步驟的組。
[0090]下文通過下面的非限制性實施例并參考附圖對本發(fā)明進行描述。
【附圖說明】
[0091] 圖1.該圖顯示6號染色體上MHCy區(qū)塊區(qū)域的位置。
[0092] 圖2 . PCR-SSP測試的凝膠圖像，該測試用于檢測補體C4基因中的8.1祖先單倍型 (AH)特異性SNP對。樣品1具有8.1AH的α、β和δ區(qū)塊標(biāo)志物，并且對于γ區(qū)塊SNP標(biāo)志物測試 為陽性。樣品2、3和4不具有任何8.1ΑΗ標(biāo)志物并且對于γ區(qū)塊SNP標(biāo)志物的SSP測試為陰性。 樣品的HLA分型：
[0093] 1:HLA-A*01:01;24:02; B*08:01; DRB1*03:01， DQB1*02:01
[0094] 2:HLA-A*02:01， B*46:01， DRB1*08:01 DQB1*06
[0095] 3:HLA-A*30:02;68:01， B*42:01， DRB1*03:02 DQB1*04
[0096] 4:HLA-A*24:02， B*52:01, DRB1*15:01， DQB1*06:02
[0097] 圖3.與參照序列相比，在不同測試樣品中鑒定的SNP的表。黑塊中的序列是通過γ 型測定檢測到的SNP。白塊中的以黑字表示的序列差異是與參照相比的序列差異，但并非γ 型測定的唯一靶標(biāo)。#7 γ型測定要求2XSNP的存在，其需要彼此連鎖存在。具有白色短線 (-)的黑塊表明相對于參照的缺失。所述樣品根據(jù)它們的祖先單倍型來標(biāo)記，且顯示出了樣 品的C4同種異型。
[0098] 圖4· γ型不匹配導(dǎo)致嚴(yán)重aGVHD的風(fēng)險增加。γ型匹配(Μ)和不匹配(ΜΜ)的患者 (X)及患者是否被診斷為具有急性GVHD和急性GVHD等級。
[0099] 圖5. γ型匹配導(dǎo)致長時間生存的機會增加。
[0100] 圖6.針對無關(guān)的供體和患者中的γ型匹配(Α)和不匹配(Β)個體的γ型PCR SSP分 析。箭頭指示不匹配的SNP等位基因。
[0101] 圖7.回顧性研究的結(jié)果，其顯示出在GT匹配和GT不匹配的無關(guān)患者供體對中在存 活、III/IV級aGvHD及cGvHD方面的差異。
[0102] 序列表注釋
[0103] SEQ ID N0:1-C4A同型特異性氨基酸殘基。
[0104] SEQ ID N0:2-C4B同型特異性氨基酸殘基。
[0105] SEQ ID N0:3至50-寡核苷酸引物。
【具體實施方式】
[0106] 一般技術(shù)與定義
[0107] 除非另外特別限定，本文使用的所有技術(shù)與科學(xué)術(shù)語應(yīng)該與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 通常理解的具有相同含義(例如，在分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)）。
[0108] 除非另外指出，本發(fā)明使用的分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序。這些技術(shù)在以下來源的文獻中有所描述和解釋：例如J，Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley和Sons(1984)，J·Sambrook和 Russell. ,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbour Laboratory Press(2001),R.Scopes,Protein Purification-Principals and Practice, 第三版，Springer(1994)，T.A.Brown(編），Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1和2卷，IRL Press(1991)，D ·Μ·Glover和B ·D · Hames(編），DNA Cloning: A Practical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)，及F.M.Ausubel等（編），Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and ffiley-Interscience ( 1988,包括直至目前的所有更新），Ed Harlow和David Lane(編）Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory，（1988)，及J.E.Coligan等（編） Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(包括直至目前的所有更新）。
[0109]術(shù)語"核酸"或"核酸序列"或"核酸分子"指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸及它們的聚合物。術(shù)語核酸與基因、互補DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、寡核苷酸 及多核苷酸可互換使用。
[0110] "分離的核酸分子"指總體已從其在天然狀態(tài)下（如果其以任何形式存在于自然 中）所結(jié)合或連接的核苷酸序列中分離出的核酸分子。優(yōu)選地，所述分離的核酸至少60%脫 離、更優(yōu)選至少75%脫離、更優(yōu)選至少90%脫離其通常所結(jié)合的其他組分。所述核酸可以使 用任何適合的已知技術(shù)從生物樣品中分離。例如，總基因組DNA可以使用本領(lǐng)域已知的方法 和/或商業(yè)可得的試劑盒來從細胞中提取，例如，通過使用QIAGEN提供的QIAamp DNA血液 Mini試劑盒或DNeasy Blood&Tissue試劑盒，或通過使用諸如酸/氯仿提取和乙醇沉淀等方 法。
[0111] 本發(fā)明的術(shù)語"探針"指單鏈寡核苷酸，其被設(shè)計為與包含C4基因單核苷酸多態(tài)性 的核酸特異性地雜交。本發(fā)明的探針可為約5-150個核苷酸長。在一個實施方式中，探針可 以用于使用靶標(biāo)捕獲技術(shù)的高通量(下一代)測序中。因此，在一個實施方式中，探針可適合 于靶標(biāo)捕獲并且長度為約60-120個核苷酸。
[0112] 作為另一選擇，探針可以為約10-25個核苷酸。在某些實施方式中，探針長度為10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。用于本發(fā)明的核苷酸可以 是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸及修飾的核苷酸(例如肌苷)或包含基本不改變其雜交特性 的經(jīng)修飾的基團的核苷酸。
[0113] "生物樣品"可以是例如淋巴細胞、全血、頰粘膜拭子、活檢樣本或冷凍組織或包含 基因組DNA的任何其它樣品。盡管對于分子基因分型而言可以使用幾乎任何組織來源，但最 常使用的是例如來自外周血的淋巴細胞。也可以使用通過非侵入性方法獲得的樣品，例如 通過基于臉頰拭子或唾液的DNA收集。從這些來源提取DNA的多種適合的方法是本領(lǐng)域已知 的。這些方法的范圍從有機溶劑提取到二氧化硅包覆的珠及陽離子交換柱的吸附。DNA自動 提取系統(tǒng)也是商業(yè)可得的且可提供高質(zhì)量、高純度的DNA。
[0114] 如本文使用的，術(shù)語"移植"（transplant)指將獲自一個個體(供體)的組織或細胞 移植或引入到另一個個體(受體)的身體中或身體上。從供體移除并移植到受體的細胞或組 織指"移植物(graft)"。通常移植的組織的實例為骨髓、造血干細胞、器官(例如肝臟、心臟、 皮膚、膀胱、肺、腎、角膜、胰腺、胰島、腦組織、骨和腸）。在一個實施方式中，移植是造血干細 胞移植。
[0115] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，術(shù)語"單倍型"指在染色體上位置靠近或位于相鄰基因 座的一起遺傳的等位基因組合，或是在染色體對的單個染色體上的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)聯(lián)的一組單 核苷酸多態(tài)性。
[0116] MHCy 區(qū)塊
[0117] 本文使用的術(shù)語"MHCy區(qū)塊"指位于6號染色體的短臂上的主要組織相容性復(fù)合 體(MHC)的HLA-B/C區(qū)塊(δ區(qū)塊)和HLA-DRB/DQB區(qū)塊(δ區(qū)塊)之間的基因組區(qū)域（圖1)。位于 MHCy 區(qū)塊中的基因包括但不限于TNXB(OMM 600985)、CYP21A2(0M頂 613815)、C4A(0MIM 120810)、STK19(OMIM 604977)、C4B(0MM 120820)、DOM3Z(OMIM 605996)、SKIVL2(OMIM 600478)、RDBP(0MIM 154040)、CFB(0MIM 138470)、C2(0MIM 613927)及EHMT2(OMIM 604599)〇
[0118] 人類補體C4基因座在MHC的III類區(qū)域中并顯示出基因復(fù)雜性。補體C4基因顯示出 作為單模塊、雙模塊、三模塊或四模塊RCCX盒的一部分的區(qū)段性復(fù)制(Fernando等，2010)。 因此，理論上，兩到八個拷貝的C4基因可能出現(xiàn)在二倍體人類基因組中；每個6號染色體包 含一到四個拷貝的單個C4基因。C4基因以兩種形式之一存在：C4A(酸性）（0ΜΙΜ索引： 120810)或C4B(堿性）（0M頂索引：120820)，其各自本身是多態(tài)性的。如本文使用的，術(shù)語"C4 基因"指可能是C4A或C4B基因形式的多核苷酸序列。
[0119] 在核苷酸水平，C4A和C4B在41個外顯子上享有99 %的序列同源性。每個同種型由 外顯子26中的5個核苷酸變化來定義，其導(dǎo)致從1120至1125的4個同種型特異性氨基酸殘 基：C4A的PCPVLD(SEQ ID N0:1)和C4B的LSPVIH(SEQ ID Ν0:2)<Χ4Α和C4B蛋白在化學(xué)反應(yīng) 性上不同。C4A優(yōu)先結(jié)合氨基，與蛋白（例如免疫復(fù)合物)形成酰胺鍵。與C4A相比，C4B在某些 免疫測定中顯示出更大的溶血活性并且對羥基具有更高的親和力。C4基因也可在大小上變 化，以長(C4L)和短(C4S)形式存在。長(21kb)或短（14.6kb)形式的C4基因由插入到內(nèi)含子9 中的6.4kb的人類內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(HERV-K(C4))插入序列的存在或不存在來確定。
[0120] 本文描述的本發(fā)明的方法涉及通過匹配一個或多個潛在移植供體的MHCy區(qū)塊中 的單核苷酸多態(tài)性等位基因與需要移植的受體的MHCy區(qū)塊中的一個或多個單核苷酸多態(tài) 性等位基因來確定患者發(fā)展aGVHD的可能性和/或移植患者的存活時間。因此，本發(fā)明的方 法可在多種應(yīng)用中使用。例如，本發(fā)明的方法可用于為移植受體鑒定候選供體，其中，與具 有更少的與受體匹配的核苷酸多態(tài)性等位基因的移植供體相比，來自供體的移植物在受體 中將不太可能導(dǎo)致aGVHD，特別是嚴(yán)重的aGHVD。
[0121] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在移植供體和受體的MHCy區(qū)塊中匹配一個單核苷酸多態(tài) 性等位基因降低了受體發(fā)展嚴(yán)重的急性移植物抗宿主病的風(fēng)險。因此，在一個實施方式中， 所述方法包括確定同時在潛在移植供體和受體中一種單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在。本 發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在潛在移植供體和受體的MHCy區(qū)塊中匹配額外的單核苷酸多態(tài)性 等位基因進一步降低了供體發(fā)展急性移植物抗宿主病的風(fēng)險，特別是嚴(yán)重的急性移植物抗 宿主病的風(fēng)險，因此，在一個實施方式中，所述方法包括:確定同時在潛在移植供體和受體 的MHCy 區(qū)塊中2個以上（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多）單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在。在一個特定實 施方式中，所述方法包括確定同時在潛在移植供體和受體中24或25個單核苷酸多態(tài)性等位 基因的存在。
[0122] 在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括:在選自TNXB、CYP21A2、C4A、STK19、C4B、 D0M3Z(0MIM 605996)、SKIVL2、RDBP、CFB、C2和EHMT2的至少一個MHCy 區(qū)炔基因的編碼或非 編碼區(qū)中確定一個或多個SNP等位基因的存在。
[0123] 在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括：在選自C2321、T9763、C9796、T9819、 T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、 A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、 T17316、T19588和A20170的C4基因中確定一個或多個SNP等位基因的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員 將會理解這些SNP等位基因的位置是相對于C4基因起始密碼子的第一個堿基。
[0124] 在一個特定的實施方式中，本發(fā)明的方法包括：確定選自C2321、T9763、C9796、 T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、 G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、 C16954、T17316、T19588和A20170SNP等位基因的至少24個SNP等位基因中每一個的存在。在 另一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括:在C4基因中檢測一個或多個其他SNP。
[0125] 另外，確定移植候選者發(fā)展aGVHD的可能性可影響確定移植是否確實是治療他們 的病情最適合的形式。在某些情況下，可能有替代形式的治療，其提供給患者更好的預(yù)后。 同時，aGVHD可能性的預(yù)測將指示治療方案的必要性，或者指示可能比推薦方案更具侵襲性 (aggressive)的治療方案。這種侵襲性療法通常具有不期望的副作用，因此優(yōu)選不使用，除 非預(yù)后表明需要。例如，用中和性抗TNF-α單克隆抗體治療患者可導(dǎo)致aGVHD的改善，但是可 增加感染風(fēng)險。也可使用多種侵襲性抗炎療法。
[0126] 單核苷酸多態(tài)性(SNP)
[0127] 所有生物體的基因組在其持續(xù)進化過程中都經(jīng)歷自發(fā)突變，產(chǎn)生祖先遺傳序列的 變異形式。多種形式的遺傳序列的并存導(dǎo)致了遺傳多態(tài)性，這包括單核苷酸多態(tài)性，也被稱 為"SNP" ANP也可出現(xiàn)在沒有明顯功能的基因組區(qū)域中，但SNP可以在基因組中與變異序列 遺傳連鎖。因此，SNP可以與基因組的變異序列密切相關(guān)，這取決于遺傳連鎖的接近程度。
[0128] SNP是DNA中的單堿基位置，在此位置不同的等位基因或替代性核苷酸在群體中出 現(xiàn)。例如，來自不同個體的兩個經(jīng)測序的DNA片段，AAGCgTA與AAGCJTA，具有單核苷酸差異。 在這種情況下，稱之為存在兩個等位基因。最常見的SNP僅具有兩個等位基因。
[0129] 單核苷酸多態(tài)性可以落入基因的編碼序列、基因的非編碼區(qū)或基因間區(qū)域(基因 之間的區(qū)域）。由于遺傳密碼的簡并性，編碼序列中的SNP不一定會改變所產(chǎn)生的蛋白的氨 基酸序列。
[0130] 編碼區(qū)的SNP有兩種類型：同義SNP和非同義SNP。同義SNP不影響蛋白序列，而非同 義SNP改變蛋白的氨基酸序列。不在蛋白編碼區(qū)的SNP仍可以影響基因剪接、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、 信使RNA降解或非編碼RNA序列。受這種類型的SNP影響的基因表達的稱為eSNP(表達SNP)， 且可以在基因的上游或下游。
[0131]在定義SNP的位置、SNP等位基因或核苷酸序列時，提及核酸分子一條鏈上特定位 點處的腺嘌呤、胸腺嘧啶(尿嘧啶）、胞嘧啶或鳥嘌呤也限定了所述核酸分子的互補鏈上的 相應(yīng)位置處的胸腺嘧啶（尿嘧啶）、腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶（分別對應(yīng)）。因此，可以參考任 一條鏈來指定特定的SNP位置、SNP等位基因或核苷酸序列。SNP的位置也可通過參考基因的 起始密碼子(也稱"開始"密碼子)的第一個堿基來確定。
[0132] 單核苷酸多態(tài)性的檢測
[0133] 可以使用本領(lǐng)域中已知的允許定性和/或定量評價樣品中的單核苷酸多態(tài)性等位 基因的任何適合技術(shù)。另外，可通過參考標(biāo)準(zhǔn)對照或?qū)φ諛悠穪磉M行比較。
[0134] 可用于檢測單核苷酸多態(tài)性的方法包括PCR、LCR(配體鏈反應(yīng))和雜交技術(shù)。"聚合 酶鏈反應(yīng)"（PCR)是一種反應(yīng)，其中復(fù)制的拷貝從靶多核苷酸產(chǎn)生，其中使用由"正向"和"反 向"引物組成的"引物對"或"引物組"以及聚合催化劑，例如DNA聚合酶和常見的熱穩(wěn)定聚合 酶。用于PCR的方法是本領(lǐng)域已知的，且在例如"PCR"（編者MJ.McPherson和S.G Moller (2000)BI0S Scientific Publishers Ltd，0xford)中有所教導(dǎo)。可以對從生物樣品中分離 出的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行PCR。
[0135] 引物通常是寡核苷酸，通常為約20個核苷酸長，最小約15個核苷酸長，其能夠以序 列特異性形式與靶序列雜交，并且在PCR過程中延伸。較長的核酸分子，例如至少50或100或 更多核苷酸長度的核酸分子，也可以用作引物。擴增子或PCR產(chǎn)物或PCR片段或擴增產(chǎn)物為 包含所述引物和新合成的靶序列拷貝的延伸產(chǎn)物。多重PCR體系包含多個引物組，其引起多 于一個擴增子的同時產(chǎn)生。引物也可以包含附加的序列和/或經(jīng)修飾或標(biāo)記的核苷酸，以便 于捕獲或檢測擴增子。DNA熱變性、引物與其互補序列的復(fù)性(anneal)、以及復(fù)性引物在聚 合酶下延伸的重復(fù)循環(huán)產(chǎn)生了靶序列的指數(shù)擴增。術(shù)語靶或靶序列或模板指被擴增的核酸 序列。
[0136] 另一種核酸擴增技術(shù)是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。首先，使用逆轉(zhuǎn)錄酶從 RNA模板產(chǎn)生互補DNA(cDNA)，然后對得到的cDNA進行PCR。
[0137] 另一種擴增方法為EP 0 320 308中公開的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。在LCR中，準(zhǔn)備 兩個互補探針對，在靶序列的存在下，每對將結(jié)合到靶的相對互補鏈上以使它們緊鄰。在連 接酶的存在下，這兩個探針對將連接形成單個單元。通過溫度循環(huán)(如在PCR中），結(jié)合的連 接單元從靶上脫離，然后充當(dāng)"靶序列"來連接過量的探針對。美國專利4,883,750描述了一 種類似于LCR的使探針對結(jié)合至靶序列的方法。
[0138] 用于擴增核酸分子的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括等溫擴增方法 和基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)。本發(fā)明的方法中可使用任何適合的擴增核酸構(gòu)建體或其片段或者 分離的或外源核酸分子或其片段的方法。
[0139] 等位基因特異性PCR(例如ASA、ARMS、SSP)在基因分型中是有用的技術(shù)，因為其允 許以順式定位(cis-located)方法檢測多態(tài)性。所述方法作為快速和相對容易的基因分型 方法已廣泛用于多種應(yīng)用中，特別是在HLA基因分型領(lǐng)域和其他復(fù)雜的基因分型應(yīng)用(例如 ΑΒ0基因分型）中。
[0140] 本發(fā)明的基因分型方法、試劑盒和組合物可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多種引物或正向/反 向引物對。特別而言，這樣的引物用于擴增C4基因中的一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基 因基因座。
[0141] 雜交技術(shù)涉及檢測兩個或多個核酸分子的雜交，其中檢測是以多種方式實現(xiàn)的， 包括標(biāo)記核酸分子和觀察由這種標(biāo)記生成的信號。雜交技術(shù)可以包括任何下列技術(shù)： Northern和Southern印記、循環(huán)探針反應(yīng)、分枝DNA、Invader測定和雜交捕獲。雜交技術(shù)也 可以用來鑒定存在于樣品中的特定核酸序列，其通過使用已知的核酸序列的陣列來探測樣 品。陣列技術(shù)可以使用已知的單鏈核酸，其中每個獨特的短鏈被連接在特定的已知位置，然 后添加樣品核酸，使存在于樣品中的序列雜交于固定的鏈。然后通過在雜交前對所要檢測 的樣品的片段加標(biāo)記(例如末端加標(biāo)記)來檢測這種雜交。另外，可以使用熒光原位雜交技 術(shù)來確定雜交。
[0142] 本發(fā)明的方法中可以使用的常見的基因分型方法包括但不限于:TaqMan測定、分 子信標(biāo)測定、核酸陣列、等位基因特異性引物延伸、等位基因特異性PCR、陣列引物延伸、均 相引物延伸測定、帶質(zhì)譜法檢測的引物延伸、焦磷酸測序、基因陣列上分列的多重引物延 伸、滾環(huán)擴增連接、均相連接、寡核苷酸連接測定(OLA)、基因陣列上分列的多重連接反應(yīng)、 限制性片段長度多態(tài)性、單堿基延伸標(biāo)簽測定及Invader測定。這些方法可以結(jié)合檢測機制 使用，例如發(fā)光或化學(xué)發(fā)光檢測、熒光檢測、時間分辨熒光檢測、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、熒光偏 振、質(zhì)譜法及電檢測。
[0143] 檢測多態(tài)性的其它方法包括但不限于：使用防裂解劑的保護來檢測RNA/RNA或 RNA/DNA中的錯配堿基的方法，比較核酸分子的電泳迀移率，和使用變性梯度凝膠電泳在包 含梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中測定多態(tài)性片段的移動。特定位置的序列變化也可以通 過核酸酶保護測定來評價，例如RNase和SI保護或化學(xué)裂解方法。
[0144] 在一個實施方式中，檢測一個或多個SNP或單倍體分型使用TaqMan測定來進行，其 也被稱為5 '核酸酶測定。TaqMan測定檢測PCR過程中特定擴增產(chǎn)物的積累。TaqMan測定使用 帶熒光報告染料和猝滅染料標(biāo)記的寡核苷酸探針。報告染料被合適波長的照射所激發(fā)，其 通過稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的過程將能量轉(zhuǎn)移到同一探針內(nèi)的猝滅染料。當(dāng)連接到 探針時，激發(fā)的報告染料不發(fā)射信號。在完整探針中猝滅染料與報告染料的接近使報告劑 保持降低的熒光。報告染料和猝滅染料可分別在5'末端和3'末端，或者反之。或者，報告染 料可在5 '末端或3 '末端，而猝滅染料連接到內(nèi)部核苷酸，或反之。
[0145] PCR中，DNA聚合酶的5'核酸酶活性切割探針，因此分離報告染料和猝滅染料，引起 報告劑熒光的增加。PCR產(chǎn)物的累積通過監(jiān)測報告染料的熒光增加來直接檢測。僅當(dāng)探針雜 交到在PCR中擴增的包含靶SNP的模板上時，DNA聚合酶才會在報告染料和猝滅染料之間切 割探針，且探針被設(shè)計成僅當(dāng)特定SNP等位基因存在時才會雜交至靶SNP位點。
[0146] 優(yōu)選的TaqMan引物和探針序列可使用本文描述的SNP和相關(guān)核酸序列信息容易地 確定?？梢允褂枚鄠€計算機程序，例如Primer Express (Appl ied Biosystems，F(xiàn)oster City，Calif.)，以快速得到最優(yōu)的引物/探針組。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些 用于檢測SNP等位基因的引物和探針在本發(fā)明的方法中是有用的，且可容易地納入試劑盒 形式中。
[0147] 在寡核苷酸連接測定(0LA)中，一個探針雜交至革E核酸的區(qū)段，其3'最末端與所述 核酸位點對齊。第二探針雜交到靶核酸分子的鄰接區(qū)段，直接位于第一探針的3'側(cè)。這兩個 并置的探針與靶核酸分子雜交，并且如果第一探針的3'末端核苷酸與所述核酸位點之間存 在完美互補，則這兩個探針在連接劑(例如連接酶)的存在下連接。如果存在錯配，則不會出 現(xiàn)有效連接。反應(yīng)后，連接的探針與靶核酸分子分離，并作為核酸序列存在的指標(biāo)被檢測 到。0LA還可用于使用通用陣列的核酸檢測，其中可將地址編碼(zipcode)序列引入一個雜 交探針中，獲得的產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物雜交至通用地址編碼陣列?；蛘?，可以在將地址編碼并入 0LA探針的情況下使用0LA，擴增的PCR產(chǎn)物通過電泳或通用地址編碼陣列讀出來確定。
[0148] 作為另一選擇，對于多重SNP檢測可以使用SNPlex方法和軟件，其在0LA后使用 PCR，其中將地址編碼并入了0LA探針中，且擴增的PCR產(chǎn)物與ZipChute試劑雜交，并且由該 ZipChute的電泳讀出結(jié)果來確定SNP的身份。在某些實施方式中，0LA在PCR(或其他核酸擴 增方法)前進行。在另一些實施方式中，PCR(或其他核酸擴增方法)在0LA前進行。
[0149] 確定SNP和SNP單倍型的另一種方法是基于質(zhì)譜法。質(zhì)譜法利用了 DNA的四種核苷 酸各自的獨特質(zhì)量。通過測量具有可選擇的核苷酸等位基因的核酸的質(zhì)量差，可以通過質(zhì) 譜法對核酸進行明確的基因分型。MALDI-TOF(基質(zhì)輔助型激光解吸電離-飛行時間）質(zhì)譜技 術(shù)優(yōu)選用于分子量的高度精確確定，例如用于SNP?；谫|(zhì)譜法已經(jīng)開發(fā)了許多基因型分析 方法。優(yōu)選的基于質(zhì)譜法的核酸基因分型方法包括引物延伸測定，它也可與其它方法結(jié)合 使用，例如傳統(tǒng)的基于凝膠的形式和微陣列。
[0150]通常，引物延伸測定包括設(shè)計引物并使引物從靶核酸位置上游(5'）與模板PCR擴 增產(chǎn)物復(fù)性。將三磷酸雙脫氧核苷酸(ddNTP)和/或三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)的混合物添加 到包含模板的反應(yīng)混合物中。例如，在某些實施方式中，其為包含SNP的核酸分子，通常其已 通過例如PCR被擴增。可進一步添加引物和DNA聚合酶。引物的延伸終止于模板中與混合物 中的一種ddNTP互補的核苷酸出現(xiàn)的第一個位置。引物可以與該核酸位置緊鄰（即，引物的 3'末端的核苷酸與相鄰于靶SNP位點的核苷酸雜交），或者與該核酸位置相差兩個以上核苷 酸。如果引物與靶核苷酸位置相差幾個核苷酸，唯一限制是引物的3'末端和該核酸位置之 間的模板序列不能包含與所要檢測的核苷酸相同類型的核苷酸，否則這將導(dǎo)致延伸引物的 過早終止。
[0151] 作為另一選擇，如果僅將全部四種ddNTP(沒有dNTP)加入到反應(yīng)混合物中，引物將 總是延伸僅一個核苷酸，以對應(yīng)于靶SNP位置。在這種情況下，將引物設(shè)計為結(jié)合所述SNP位 置上游的一個核苷酸（即，引物的3 '末端核苷酸與在靶SNP位點5 '側(cè)上緊鄰靶SNP位點的核 苷酸雜交）。僅延伸一個核苷酸是優(yōu)選的，因為它最大程度地減小了延伸的引物的總質(zhì)量， 因而增加了可選擇的SNP核苷酸之間的質(zhì)量差的分辨率。此外，帶質(zhì)量標(biāo)記的ddNTP可用于 弓丨物延伸反應(yīng)中，以代替未修飾的ddNTP。這增加了用ddNTP延伸的引物之間的質(zhì)量差，從而 提供增加的靈敏度和準(zhǔn)確度，并且對分型雜合堿基位置特別有用。質(zhì)量標(biāo)記也緩解了對密 集樣品制備過程的需要并降低了質(zhì)譜分析儀的必需分辨力。
[0152] 然后，可以將延伸的引物純化，并通過MALDI-T0F質(zhì)譜法來分析，以確定存在于靶 SNP位置的核苷酸的身份。在一種分析方法中，將來自引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物與形成基質(zhì)的光 吸收晶體結(jié)合。然后用能源(例如激光)沖擊所述基質(zhì)以將核酸分子電離并解吸為氣相。然 后將離子化的分子噴射到飛行管中并沿著該管朝向檢測器加速。電離事件(例如激光脈沖） 和分子-檢測器碰撞之間的時間為所述分子的飛行時間。飛行時間與離子化分子的質(zhì)荷比 (m/z)精確相關(guān)。具有更小的m/z的離子比具有更大的m/z的離子沿管行進得更快，因此較輕 的離子先于較重的離子到達檢測器。然后將飛行時間轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的高度精確的m/z。以此方 式，可以基于細微的質(zhì)量差和相應(yīng)的飛行時間差(在單個堿基位置具有不同核苷酸的核酸 分子的固有屬性)來鑒定SNP。
[0153] 核酸也可以通過直接DNA測序來評分。可以使用多種自動測序程序，包括質(zhì)譜法測 序。根據(jù)本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地設(shè)計出用于這種自動測序程序的測 序引物。商業(yè)設(shè)備，比如Applied Biosystems 377,3100,3700,3730和373(^10嫩分析儀 (Foster City，Calif.)，在本領(lǐng)域中常用于自動測序。核酸序列的確定也可以采用高通量 突變篩選系統(tǒng)，例如Spectru Medixsystem。
[0154] 在一個實施方式中，一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在使用下一代測序 (NGC)技術(shù)來確定。下一代測序(NGS)技術(shù)包括能夠在每次儀器運行中對超過10 14個堿基對 (kbp)的DNA進行測序的儀器。通常，測序產(chǎn)生大量的獨立讀出序列，每個代表核酸的10至 1000個堿基之間的任何位置。通常為了置信度而對核酸進行冗余測序，將每單位區(qū)域的復(fù) 制稱為覆蓋度（即，"10 X覆蓋度"或"100 X覆蓋度"）。下一代測序方法是本領(lǐng)域已知的，并 且描述于例如Metzker(2010)中。
[0155] 因此，本文使用的術(shù)語"下一代測序"或"NGS"或"NG測序"指確定個體核酸分子(例 如，在單個分子測序中）或以高通量模式克隆擴增的個體核酸分子的代替物(例如，同時測 序多于10 3、104、105或更多分子)的核苷酸序列的任何測序方法。
[0156] 用于下一代測序的平臺包括但不限于Roche/454基因組測序儀（GS)FLX系統(tǒng)、 Illumina/Solexa基因組分析儀(GA)、Life/APG的支持寡核苷酸連接檢測（SOLiD)系統(tǒng)、 Polonator 的G · 007系統(tǒng)、He licos BioScience s 的He 1 i Scope基因測序系統(tǒng)及 Pacific Biosciences的PacBio RS系統(tǒng)。
[0157] 在一個實施方式中，確定一個或多個SNP的存在涉及靶向型下一代測序（也稱為 "靶標(biāo)捕獲"或"序列捕獲"下一代測序）。這種靶標(biāo)富集技術(shù)在測序前利用單鏈寡核苷酸探 針來捕獲來自DNA樣品的候選基因組區(qū)域(參見例如Shen等，2013)。現(xiàn)在有若干種靶標(biāo)富集 策略，其共同目標(biāo)是以高準(zhǔn)確性和完全性捕獲候選基因組區(qū)域，同時降低成本。最廣泛使用 的方法利用多重PCR擴增、雜交捕獲、選擇性靶標(biāo)環(huán)化和寡核苷酸選擇性測序。
[0158] HLA等位基因及HLA分型
[0159] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解本發(fā)明的方法可以與HLA分型結(jié)合使用。當(dāng)與HLA等位基 因關(guān)聯(lián)使用時，術(shù)語"分型"指等位基因的鑒定，即檢測等位基因并將該等位基因與相同基 因座的其它等位基因區(qū)分開。因此，本發(fā)明的方法可以進一步包括:確定非C4基因中一個或 多個HLA SNP的存在，或確定在潛在移植供體和/或受體中一個或多個非C4基因的HLA單倍 型的存在。如本文使用的，術(shù)語"單倍型"指通常一起遺傳的遺傳變異或標(biāo)志物（"等位基 因"）的任意組合。
[0160] 分子HLA分型方法依賴于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它適合的技術(shù)擴增足夠 拷貝數(shù)的HLA序列。用于HLA分型的PCR擴增可以是基因座特異性、等位基因組特異性或等位 基因特異性的，視所使用的技術(shù)而定。進一步測試擴增子以檢測特定多態(tài)性序列，例如定義 編碼特定HLA抗原的特定HLA等位基因或相關(guān)等位基因的組的那些多態(tài)性序列。
[0161] HLA分子中的多態(tài)性主要發(fā)生在包含肽結(jié)合區(qū)域的蛋白結(jié)構(gòu)域中。對于I類HLA分 子，DNA分型方法主要集中在第二和第三個外顯子上，其編碼HLA-A、HLA-B和Cw重鏈的第1和 第2結(jié)構(gòu)域。對于II類分子，肽結(jié)合位點由α和β鏈的第一結(jié)構(gòu)域組成，其由它們各自基因的 第二個外顯子編碼。
[0162] 對于HLA-DR，僅β鏈?zhǔn)嵌鄳B(tài)性的。因此，DR分型策略一般集中在DRB1、DRB3、DRB4和 DRB5基因的第二個外顯子上。應(yīng)該指明，DRB1基因座的等位基因編碼血清學(xué)確定的DR抗原 1-18,而DRB3-5基因座分別編碼DR52、DR53和DR51抗原。所有的個體都攜帶DRB1基因，但是 DRB3-5基因的存在因特定單倍型攜帶不同的DRB1基因而變化。因此，個體可以具有少至一 種DR抗原（如果它們對DR1、DR8或DR10是純合子的）或者多至四個DR抗原(例如，DR15、DR17、 DR51、DR52)。由于對α和β鏈均具有特異性的HLA抗體的報道，近年來另外的注意力集中在 HLA-DQ和DP抗原上。因此，HLA-DQ和DP的完全分型也必須考慮多態(tài)性α鏈的第二個外顯子。
[0163] 試劑盒
[0164] 本發(fā)明提供用于為受體鑒定移植供體的試劑盒。所述試劑盒可適用于核酸物種的 檢測，或者可用于多肽基因產(chǎn)物的檢測。
[0165] 對于核酸的檢測，所述試劑盒可包含第一容器，例如小瓶或塑料管或微孔板，其包 含一種或多種寡核苷酸探針?？蛇x地，試劑盒可包含裝有引物的第二容器。探針可以是可與 包含單核苷酸多態(tài)性基因座的DNA雜交的探針，或包含能夠與多個單核苷酸多態(tài)性基因座 雜交的多個探針。也可以開發(fā)包含固定在固體支持物上的寡核苷酸探針的試劑盒，例如，使 用陣列。
[0166] 對于核酸的PCR擴增，試劑盒中可以包括核酸引物，其與包含單核苷酸多態(tài)性基因 座的核酸的至少一部分互補。引物組通常包含至少兩種能夠特異性擴增DNA的寡核苷酸?？?包含允許進行定量PCT確定的帶熒光標(biāo)記的寡核苷酸（例如，TaqMan化學(xué)、分子信標(biāo)）。還可 以包括用于DNA擴增的適合的酶。
[0167] 在試劑盒中可以包含對照核酸，目的是進行對比或驗證。
[0168] 實施例
[0169] 實施例1. C4基因中SNP的祖先單倍型特異性。
[0170] 使用序列特異性引物(SSP)來檢測補體C4基因中的8.1祖先單倍型(AH)特異性SNP 對（圖2)。樣品1具有8.1AH的α、β和δ區(qū)塊標(biāo)志物，并且對γ區(qū)塊SNP標(biāo)志物測試呈陽性。樣品 2、3和4不具有8.1ΑΗ的任何標(biāo)志物，并且對γ區(qū)塊SNP標(biāo)志物的SSP測試是陰性的。
[0171]圖3的表顯示出，許多具有相同的C4同種異型的樣品具有不同的SNP譜。某些SNP在 多種樣品中發(fā)現(xiàn)，而某些看上去對于樣品是獨特的（祖先單倍型）。該數(shù)據(jù)表明SNP譜是MHC 祖先單倍型的γ區(qū)塊的標(biāo)志物，且不是樣品的同種異型。#8和#15 γ型測定是針對C4A和C4B 的對照SSP測定，且未列出。
[0172] 實施例2.示例性PCR分型試劑盒
[0173] 本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了一種PCT測定試劑盒，用于匹配患者和供體以減少嚴(yán)重急 性移植體抗宿主病的風(fēng)險。該PCR試劑盒包含含有PCR緩沖液、dNTP、MgCl 2和序列特異性引 物及單瓶DNA聚合酶的26種混合物。用于擴增C4基因單核苷酸多態(tài)性的每種混合物以單瓶 880μ1提供。在測定中所要擴增的單核苷酸多態(tài)性是六13189、1!4952、612749)13950-A14483、G12071、A11483、T9763、A12152、A14831、T14757、C16954、T9881、C9796、A12568-八12837、1'19588、1'10289、厶11437、1'14563、厶20170、1'17316、(：10676、615108、1'10309和/或 C13193中的一個或多個。所述測定試劑盒進一步包含用于擴增C4A和C4B基因內(nèi)部片段的對 照混合物。
[0174]優(yōu)選地，在該測定試劑盒中所要測試的DNA樣品是高分子量人類基因組DNA，其在 Tris/EDTA緩沖液中的濃度范圍為20-100ngAU，且0D26Q/28()>1.8,其提取自ACD或EDTA抗凝 全血樣本中。
[0175] PCR測定步驟
[0176] 1.為每個待測試樣品設(shè)定所有的PCR測定混合物。
[0177] 2.使所述測定混合物在室溫快速解凍。一旦解凍，對混合物進行短暫渦旋。
[0178] 3.將7.85μ1的每種混合物加入到反應(yīng)孔中。將7.85μ1加入到每個待測試樣品的不 擴增對照孔中。
[0179] 4.為在測定中所要分型的每個樣品制備DNA(64μ1)和DNA聚合酶（4.8μ1)的混合 物。
[0180] 5.將2.15μ1的DNA/聚合酶混合物分配到每個反應(yīng)孔中。
[0181 ] 6.將反應(yīng)孔密封并且通過渦旋和短暫離心而輕輕混合。
[0182] 7.將反應(yīng)孔放置到熱循環(huán)儀中并且施加以下擴增條件：
[0184] 8.在完成PCR時，將擴增板從熱循環(huán)儀中移出，對其直接進行凝膠電泳，或儲存在4 °(：直至需要使用。
[0185] 瓊脂糖凝膠電泳及說明
[0186] 1.內(nèi)參對照和靶擴增子的擴增通過瓊脂糖凝膠電泳來確認，其中使用2μ1的每種 PCR產(chǎn)物與5μ1的上樣緩沖液(可使用其它體積)的組合。推薦使用1%的瓊脂糖凝膠。
[0187] 2.在每個測試樣品的不擴增對照中必須沒有PCR產(chǎn)物。如果條帶明顯，可能發(fā)生了 某些水平的污染，并且必須重新運行。
[0188] 3.所有的陰性反應(yīng)應(yīng)當(dāng)擴增內(nèi)參對照擴增子。
[0189] 4.所有的陽性序列特異性PCR(SSP)將導(dǎo)致靶擴增子的擴增。擴增子的預(yù)期大小列 在表1中。
[0190] 表1.擴增產(chǎn)物的預(yù)期大小。

[0192] 實施例3.針對γ型（SNP)匹配患者。
[0193] 針對SNP組，使用PCR-SSP測定對患者和供體進行了分型。如果供體或患者對于來 自26個SNP的組的至少一個SNP是陽性而對應(yīng)的供體/患者不是，則將患者/供體對定義為不 匹配（圖4和圖5)。圖4顯示出γ型不匹配導(dǎo)致嚴(yán)重aGVHD的風(fēng)險增加。針對γ型匹配(M)和不 匹配(ΜΜ)的患者(X)，及該患者是否被診斷為有急性GVHD和急性GVHD等級。圖5顯示出γ型 匹配導(dǎo)致長時間生存的機會增加。
[0194] 實施例4. γ型PCR分型試劑盒的另一個實施例。
[0195] 本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了另一種用于匹配患者和供體以降低嚴(yán)重急性GVHD風(fēng)險的 PCT測定試劑盒。所述PCR試劑盒包含25種混合物，其包含:PCR緩沖液、dNTP、MgCl2和序列特 異性引物、不擴增對照混合物、和單瓶DNA聚合酶。將每個用于擴增C4基因單核苷酸多態(tài)性 的混合物提供到32孔板的單個孔中。在測定中所要擴增的單核苷酸多態(tài)性為A13189、 T14952、G12749、G12071、A11483、T9763、A12152、A14831、T14757、C16954、T9881、C9796、 A12568-A12837、T19588、T10289、A11437、T14563、A20170、T17316、C10676、G15108、T10309 和/或C13193中的一個或多個。該測定試劑盒進一步包含用于擴增C4A和C4B基因內(nèi)部片段 的對照混合物。
[0196] 優(yōu)選地，在該測定試劑盒中所要測試的DNA樣品為高分子量人類基因組DNA，其在 Tris/EDTA緩沖液中的濃度范圍為20-100ngAU，且0D26Q/28()>1.8,且其提取自ACD或EDTA抗 凝全血樣本。
[0197]
[0198] 1.PCR 設(shè)置
[0199] 1.1對于單個樣品，每個32孔反應(yīng)板都包含足夠的γ型混合物。在室溫下快速解凍 所述γ型混合物/反應(yīng)板。一旦解凍，短暫渦旋并且離心所述32孔板以確保所有的混合物下 落到孔的底部。
[0200] 1.2根據(jù)下表2,為每個待分型的樣品制備基因組DNA和DNA聚合酶(DNA P0L-γ型） 的混合物。對于每個新的PCR，其應(yīng)當(dāng)新鮮配制。脈沖渦旋所述溶液3-4次以混合。
[0201] 表2.每個樣品所要求的DNA/聚合酶混合物的組成
[0203] 1.3將2yL DNA/聚合酶混合物分配到每個反應(yīng)孔中。密封所述反應(yīng)孔，并且輕輕混 合。短暫離心所述反應(yīng)孔。
[0204] 1.4將反應(yīng)孔放置到熱循環(huán)儀中，并且根據(jù)下列熱循環(huán)條件進行擴增：
[0206] 1.5擴增需要約2.5小時完成。當(dāng)PCR完成時，將所述板從熱循環(huán)儀中移出，產(chǎn)物通 過凝膠電泳直接分析，或儲存在4°C直至需要使用。
[0207] 2.瓊脂糖凝膠電泳及說明
[0208] 2.1內(nèi)參對照和靶擴增子的擴增通過瓊脂糖凝膠電泳來確認，其中使用2μ1每種 PCR產(chǎn)物與5μ1上樣緩沖液(其它的上樣緩沖液體積應(yīng)當(dāng)在使用前進行驗證)的組合。推薦使 用2 %的瓊脂糖凝膠。
[0209] 2.2在每個測試樣品的陰性對照孔中（混合物26)必須沒有PCR產(chǎn)物。如果條帶明 顯，可能發(fā)生了某些水平的污染，并且必須重新運行。
[0210] 2.3所有的陰性γ型反應(yīng)應(yīng)當(dāng)擴增內(nèi)參對照擴增子。如果靶擴增子和內(nèi)參對照擴 增子都不明顯，則反應(yīng)不能被解釋，并且應(yīng)當(dāng)在相關(guān)的γ型工作表上記錄"失敗"（〇)。
[0211] 2.4在擴增靶擴增子時，觀察和記錄陽性γ型反應(yīng)。當(dāng)對反應(yīng)進行評分時，對照表1 來檢查每個靶擴增子的預(yù)期大小。陽性反應(yīng)可呈現(xiàn)強的靶擴增子和非常弱的或消失的內(nèi)參 對照。這是可接受的陽性反應(yīng)。當(dāng)對反應(yīng)評分時，記錄結(jié)果中使用數(shù)字'1'記錄陰性反應(yīng)并 且使用數(shù)字'2'記錄陽性反應(yīng)。任何失敗的反應(yīng)(如2.3中描述的)應(yīng)當(dāng)記錄為'0'。
[0212] 2.5患者γ型譜可與供體γ型譜比較，以輔助對γ區(qū)塊匹配的預(yù)測。為此，應(yīng)該在 工作表中記錄每個測試的患者和潛在供體的相關(guān)樣品信息，這包括姓名、樣品ID和DNA濃 度。γ型凝膠圖像的拷貝可輸入工作表。然后可以通過用"2"給呈現(xiàn)靶條帶的陽性反應(yīng)打分 和用"Γ給僅呈現(xiàn)內(nèi)參對照條帶的陰性反應(yīng)打分來解讀凝膠圖像。失敗或"不擴增"的反應(yīng)， 其中靶標(biāo)和內(nèi)參對照均缺失，用"0"評分。這些結(jié)果應(yīng)當(dāng)輸入到患者和供體的工作表中。
[0213] 2.6-旦所有的結(jié)果被輸入和評分，對結(jié)果進行比較以查明是否任何分型/輸入的 供體與患者為γ型匹配。如果檢測到污染或任何反應(yīng)失敗，可能需要重復(fù)進行測試。
[0214] 圖6顯示了 γ型匹配(Α)和不匹配(Β)的個體的γ型PCR SSP分析。
[0215] 實施例5. γ型回顧性研究。
[0216] 對225個無關(guān)造血干細胞移植(HSCT)供體-受體對進行回顧性研究，這些供體-受 體對來自從1996至2005年在3個巴西中心進行的移植。移植對中的每個個體使用Luminex技 術(shù)進行HLA分型（A、B、C、DRB1、DQB1)。通過PCR-SSP分析用23個SNP及C4A和C4B同型特異性 SNP進行γ型測定，在移植/受體對中γ型SNP譜完全匹配時記錄γ型匹配。在SNP譜中有至 少一個SNP差異時記錄γ型不匹配。
[0217] 分析HLA型和γ型譜證明了HLA不匹配的對更可能是γ型不匹配的（表3)。
[0218] 表3.HLA不匹配的對更可能是γ型不匹配的
[0220] 卡方檢驗ρ〈0·001
[0221] 另外，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，10/10HLA匹配的對中γ型匹配降低了cGvHD和III/IV 級aGvHD的風(fēng)險（圖7)。據(jù)顯示，9/10HLA匹配的對中γ型匹配顯著提高了存活，這可能是平 衡疾病復(fù)發(fā)和GvHD的結(jié)果。在此方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)γ型匹配、HLA 9/10匹配的患者的存活 率超過γ型匹配且HLA 10/10匹配的患者。
[0222]總的來說，本發(fā)明的發(fā)明人確定了非HLA基因組序列影響無關(guān)造血干細胞移植的 結(jié)果。這表明γ型匹配和高分辨率HLA分型導(dǎo)致了對造血干細胞移植結(jié)果至關(guān)重要的非HLA 基因座匹配。因此，本發(fā)明的γ型測定可以用于鑒定最佳供體，以用于在無關(guān)HSCT后改進結(jié) 果。
[0223] 本領(lǐng)域技術(shù)人員會知曉，在不脫離廣泛描述的本發(fā)明的范圍的情況下，可以對具 體實施方式中所顯示的發(fā)明進行多種修改和/或變化。因此，本發(fā)明的實施方式僅是說明性 的且非限制的。
[0224] 本文討論和/或參考的所有出版物都以其整體并入本文。
[0225] 本申請要求AU 2013903971的優(yōu)先權(quán)，將其全部內(nèi)容作為參考并入本文。
[0226] 對本說明書中所包括的任意文件、發(fā)案、材料、設(shè)備、物品等的討論僅以為本發(fā)明 提供語境為目的。不應(yīng)認為這是承認它們中的任何一個或全部因存在于本申請每個權(quán)利要 求的優(yōu)先權(quán)日之前而構(gòu)成部分現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)或本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的公知常識。
[0227] 參考文獻
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[0230] Petersdorf等（2007)PL〇S Med，4(l):e8
[0231] Shen等（2013)Genome Medicine，5:50〇
【主權(quán)項】
1. 一種為需要移植的受體鑒定移植供體的方法，所述方法包括： a) 確定在需要移植的受體的MHC γ區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存 在； b) 確定在一個或多個潛在移植供體的MHC γ區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基 因的存在;和 c) 基于同時在所述移植供體和需要移植的所述受體的MHC γ區(qū)塊中一個或多個單核苷 酸多態(tài)性等位基因的存在，鑒定移植供體。2. -種降低移植受體發(fā)展移植物抗宿主病的可能性的方法，所述方法包括： a) 確定在需要移植的受體的MHC γ區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存 在； b) 確定在一個或多個潛在移植供體的MHC γ區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基 因的存在； 其中，同時在所述移植受體和一個或多個潛在移植供體的MHC γ區(qū)塊中一個或多個單 核苷酸多態(tài)性等位基因的存在表明所述移植受體在從所述移植供體移植了移植物后發(fā)展 移植物抗宿主病的可能性降低。3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，確定在需要移植的受體和/或潛在供體的MHC γ 區(qū)塊中一個或多個單個多核苷酸多態(tài)性等位基因的存在的步驟包括:獲得預(yù)定的MHC γ區(qū) 塊單核苷酸多態(tài)性等位基因信息和/或MHCγ區(qū)塊單倍型信息。4. 如權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法，其中，確定在潛在移植供體的受體的MHC γ區(qū) 塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在的步驟包括:分析來自所述受體和/或來 自潛在供體的核酸樣品以確定所述一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，分析核酸樣品的步驟包括:進行選自PCR-SSP測定、 等位基因特異性探針雜交、等位基因特異性引物延伸、等位基因特異性擴增、核酸測序、5' 核酸酶消化、分子信標(biāo)測定、寡核苷酸連接測定、大小分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性梯度 凝膠電泳和直接核苷酸測序中的一種或多種的技術(shù)。6. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，所述方法包括從潛在移植供體和/或受體獲得生 物樣品并且從所述生物樣品中分離出核酸。7. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，所述核酸樣品從獲自潛在移植供體和/或受體的 生物樣品中分離出。8. 如前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述方法包括確定至少24個單核苷酸多 態(tài)性等位基因的存在。9. 如前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述方法還包括:在受體和潛在移植供體 中檢測一個或多個其它等位基因的存在或確定一個或多個其它單倍型的存在。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述方法還包括確定一個或多個其它HLA等位基因 和/或HLA單倍型。11. 如前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述方法還包括基于以下i)或ii)來選 擇移植供體： i) 在潛在移植供體的MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在，或 ii) 在潛在移植供體中MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在以及 一個或多個其它HLA等位基因和/或HLA單倍型的存在。12. -種將同種異基因移植物移植到受體中的方法，所述方法包括： i)根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法選擇移植供體， i i)從所述移植供體中移出供體移植物，和 i i i)將所述移植物移植到受體中。13. -種用于為受體鑒定移植供體的試劑盒，所述試劑盒包含： a) 用于檢測MHCy區(qū)塊中一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的核酸試劑;和 b) 用于檢測所述一個或多個單個多核苷酸多態(tài)性等位基因的說明書。14. 如權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包含對MHC γ區(qū)塊中的一個或多個 單核苷酸多態(tài)性等位基因具有特異性的寡核苷酸探針。15. 如權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中，所述寡核苷酸探針帶有可檢測標(biāo)記。16. 如權(quán)利要求13~15中任一項所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包含用于擴增MHC γ 區(qū)塊中的一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因的寡核苷酸引物。17. 如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述試劑盒適于進行PCR-SSP測定。18. -種用于為受體鑒定移植供體的核苷酸陣列，所述核苷酸陣列包含對MHCy區(qū)塊中 的一個或多個單核苷酸多態(tài)性等位基因具有特異性的探針。19. 一種進行一個或多個PCR-SSP測定以檢測MHC γ區(qū)塊中的單核苷酸多態(tài)性的方法， 所述方法包括： i) 將基因組DNA與DNA聚合酶混合以形成DNA-聚合酶混合物， ii) 將所述DNA-聚合酶混合物與用于擴增來自MHCy區(qū)塊的單核苷酸多態(tài)性等位基因 的寡核苷酸引物合并，以形成反應(yīng)混合物，及 i i i)使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷熱循環(huán)以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。20. 如權(quán)利要求19所述的方法，所述方法還包括分析所述擴增產(chǎn)物以檢測所述單核苷 酸多態(tài)性。21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳來分析。22. 如權(quán)利要求19~21中任一項所述的方法，其中，所述基因組DNA是高分子量人類基 因組DNA。23. 如權(quán)利要求19~22中任一項所述的方法，其中，所述基因組DNA的濃度為約20ngAU 至約 lOOng/μΙ。24. 如權(quán)利要求19~23中任一項所述的方法，所述方法包括從生物樣品中提取基因組 DNA025. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述方法包括從酸-檸檬酸鹽-葡萄糖溶液(ACD) 或EDTA抗凝全血中提取基因組DNA。26. 如權(quán)利要求19~25中任一項所述的方法，其中，所述基因組DNA的光密度(OD)比的 測量值為0D26Q/28Q〉1 · 8 〇27. 如權(quán)利要求19~26中任一項所述的方法，其中，所述單核苷酸多態(tài)性等位基因在C4 基因中。28. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述單核苷酸多態(tài)性等位基因選自C2321、T9763、 C9796、T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、 A12837、G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、 615108、(：16954、1'17316、1'19588和/或厶20170。29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述方法包括檢測至少24個單核苷酸多態(tài)性等位 基因。30. -種為需要移植的受體鑒定移植供體和/或減少移植受體發(fā)展移植物抗宿主病的 可能性的方法，所述方法包括進行權(quán)利要求19-29中任一項所述的方法以鑒定移植受體和/ 或潛在移植供體的MHC γ區(qū)塊中的單核苷酸多態(tài)性。31. 權(quán)利要求13~17中任一項所述的試劑盒或權(quán)利要求18所述的核苷酸陣列在鑒定移 植受體和/或潛在移植供體的MHC γ區(qū)塊中的單核苷酸多態(tài)性中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105899675SQ201480067952
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月15日
【發(fā)明人】D·C·塞伊爾, H·M·霍干, K·梅爾考利亞
【申請人】康內(nèi)西奧基因組學(xué)私人有限公司