一種快速檢測灰葡萄孢菌對sdhi類殺菌劑抗性的方法及引物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的方法及引物組 合物，可用于灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性群體發(fā)展的動(dòng)態(tài)監(jiān)測與抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為作 物灰霉病的抗性治理、流行預(yù)警及合理用藥指導(dǎo)提供重要的理論依據(jù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 灰霉病是一類由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea)引起的植物真菌病害，可危害 200多種蔬菜、果樹以及觀賞性植物等重要的經(jīng)濟(jì)作物，該病的發(fā)生可引起植物幼苗、果實(shí) 及貯藏器官的猝倒、落葉、花腐、爛果及爛窯，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著保護(hù)地蔬 菜生產(chǎn)的發(fā)展，加重了灰霉病的發(fā)生和流行。目前由于作物種質(zhì)資源缺少高抗灰霉病的品 種，采用化學(xué)藥劑是控制灰霉病最有效方便的途徑之一。多年來，灰霉病主要采用苯并咪 唑類、二甲酰亞胺類、嘧啶胺類、酰胺類、甲氧基丙烯酸酯類（Qols)、琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHI)等化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，但隨著使用年限的增長和使用劑量的增加，田間逐漸產(chǎn)生了 抗藥性群體，從而導(dǎo)致該病防效顯著下降?；移咸焰呔鷮ΤＳ脷⒕鷦┛顾幮缘谋O(jiān)測不僅能 應(yīng)用于作物灰霉病的抗藥性流行預(yù)警，而且也能為作物灰霉病的抗性治理提供用藥指導(dǎo)。 傳統(tǒng)的殺菌劑抗性檢測或監(jiān)測的方法主要是通過分離培養(yǎng)病原菌，然后在含藥培養(yǎng)基上培 養(yǎng)，根據(jù)藥劑對菌絲生長的抑制作用鑒定是否為抗藥性菌株，該方法檢測周期較長，從分離 到鑒定長達(dá)1周，甚至數(shù)周，且在病原菌培養(yǎng)過程中存在雜菌污染，給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來誤差； 同時(shí)，還需投入大量的人力資源，增加檢測成本。近年來，隨著核酸相關(guān)分子檢測技術(shù)的發(fā) 展，PCR技術(shù)為植物病原菌的抗藥性檢測提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，但是檢測需要昂貴 的實(shí)驗(yàn)儀器及繁瑣的電泳過程，檢測時(shí)間長，檢測成本高昂等，不能滿足經(jīng)濟(jì)高效檢測的需 求，并且在鑒定過程中還需要接觸大量有毒有害試劑，對實(shí)驗(yàn)操作人員存在較大的安全隱 患。因此，開發(fā)對植物病原菌抗藥性檢測的新技術(shù)已迫在眉睫。
[0003] 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP)是2000年由日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新穎的 恒溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物等疾病的基因診斷。該技術(shù)原理是：利用一 套（4種）特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)， 60~65°C范圍60min內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物--白色的焦磷酸鎂沉淀 產(chǎn)生。羥基萘酚藍(lán)（HNB)是一種金屬離子指示劑，根據(jù)反應(yīng)液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)出不 同的顏色，陰性（沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物）時(shí)為紫色，陽性（有產(chǎn)物擴(kuò)增）時(shí)為天藍(lán)色。LAMP方法 的最大特點(diǎn)就是實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器；擴(kuò)增反應(yīng)極快；擴(kuò)增產(chǎn)生的 產(chǎn)物量大，通過肉眼即可判定結(jié)果，不需要繁瑣的電泳過程；靈敏度高、特異性強(qiáng)；操作簡 便、快捷，極適于病原的快速診斷及抗性檢測。
[0004] 經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑的抗藥性主要是由灰葡萄孢 菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基（SdhB)突變造成，該基因編碼第225、230或272位氨基酸 密碼子的突變可引起灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生。225位氨基酸突變的 基因型為P225Y(CCC -TTC) ;230為氨基酸突變的基因型為N230I(AAC -ATC) ;272位 氨基酸的突變可分為3種突變基因型，分別為H272R(CAC - TAC)、H272Y(CAC - CGC)和 H272L(CAC - CTC)。5 種突變基因型 P225Y、N230I、H272R、H272Y 和 H272L 約占抗性突變 類型的比例分別為5. 26%、8. 77%、68. 42%、15. 79%和1. 75%。因此，在本發(fā)明中，依據(jù)灰 葡萄孢菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基（SdhB)272位氨基酸的3種突變基因型（H272R/H272Y/ H272)，基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)建立了灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的快速分 子檢測技術(shù)。該檢測技術(shù)具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點(diǎn)，能大大提高檢測效率， 對灰霉病的有效防治、抗藥性流行預(yù)警具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。然而，經(jīng)檢索目前國內(nèi)外尚未 有灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗藥性菌株的LAMP快速分子檢測的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 已報(bào)道的灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性菌株的鑒定及檢測方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi) 力、成本高的缺點(diǎn)。針對這一缺點(diǎn)，根據(jù)灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性菌株的基因型，通 過實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，建立了一種快速檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性菌株的方法。該方 法具有簡便、快速、省時(shí)省力、靈敏度高、檢測成本低等特點(diǎn)，對灰霉病的抗藥性監(jiān)測、控制 病害發(fā)生與流行、指導(dǎo)合理用藥及減少經(jīng)濟(jì)損失具有實(shí)用價(jià)值。目前在國內(nèi)外，本發(fā)明是 LAMP技術(shù)在檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的首次報(bào)道。
[0006] 田間采集的SDHI類殺菌劑抗性灰葡萄孢菌株約86%的突變類型是由于灰葡萄孢 菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基（SdhB)第272位氨基酸密碼子突變造成的。該位點(diǎn)的突變可 分為 3 種突變基因型，分別為 H272R(CAC - TAC)、H272Y(CAC - CGC)和 H272L(CAC - CTC)。 本發(fā)明所述的快速檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性菌株的分子生物學(xué)方法，可同時(shí) 檢測上述3種突變基因型，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] SEQIDNO. 1所示的灰葡萄孢菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基作為靶標(biāo)在LAMP檢測灰 葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性中的應(yīng)用。
[0008] 用于檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP引物組合物：由SEQIDN0. 2 所示的正向內(nèi)引物FIP、SEQIDNO. 3所示的反向內(nèi)引物BIP、SEQIDNO. 4所示的正向外引 物F3、SEQIDN0. 5所示的反向外引物B3、SEQIDN0. 6所示的環(huán)引物L(fēng)F組成。
[0009] 本發(fā)明所述的LAMP引物組合物在檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性中的應(yīng) 用。
[0010] 本發(fā)明所述的LAMP引物組合物在制備灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性LAMP檢 測試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] -種檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP檢測試劑盒，含有本發(fā)明所述 的引物組合物。
[0012] 本發(fā)明所述的檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP檢測試劑盒，包含 的檢測溶液為：240U/mLBstDNA聚合酶，20mMTris-HCl，10mMKCl，10mM(NH4)2S04,2mM MgS04,0.1%TritonX-100,2.0mMMgCl2,0.6mMdNTPs，0.32M甜菜堿，0.2mM羥基溴酚藍(lán) (HNB)，0. 8yM正向內(nèi)引物FIP，0. 8yM反向內(nèi)引物BIP，0. 2yM正向外引物F3,0. 2yM反向 外引物B3,0. 4yM環(huán)引物L(fēng)F，加入無菌超純水制備得到。
[0013] -種檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP試劑盒在檢測灰葡萄孢菌對 SDHI類殺菌劑抗性中的應(yīng)用。
[0014] -種檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法，取待檢灰葡萄孢菌 的DNA為模板，利用本發(fā)明的引物組合物或本發(fā)明所述的LAMP檢測試劑盒進(jìn)行LAMP擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結(jié)果，若存在梯狀條帶，則證明所檢測灰葡 萄孢菌為灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑272位抗性突變型菌株；若無梯狀條帶，則證明所檢 測灰葡萄孢菌為非272位抗性突變型菌株；或觀察LAMP反應(yīng)溶液顏色變化，若為天藍(lán)色，判 定為灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑272位抗性突變型菌株；若為紫色，判定為非272位抗性 突變型菌株。
[0015] 本發(fā)明所述的檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法，LAMP反應(yīng) 參數(shù)為 59 ~61°C，15 ~120min。
[0016] 本發(fā)明提供的快速檢測灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑抗性的分子生物學(xué)方法，具 有靈敏度高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益結(jié)果是：
[0017] 1、簡便易行：該檢測方法通過恒溫水浴鍋或有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通 過反應(yīng)產(chǎn)物顏色變化即可判定結(jié)果，省去了昂貴的儀器設(shè)備及繁瑣的電泳操作過程；
[0018] 2、檢測高效性：該檢測方法所用檢測時(shí)間僅需45min，當(dāng)加入環(huán)引物L(fēng)F后，15min 就可以完成檢測，大大提高了檢測效率，而傳統(tǒng)的室內(nèi)生物測定法需要幾天時(shí)間，PCR檢測 需要繁瑣的電泳過程，也要數(shù)小時(shí)；
[0019] 3、靈敏度高：將構(gòu)建的質(zhì)粒載體稀釋成不同的濃度，作為模板，進(jìn)行靈敏度檢測， 最低檢測下限為普通PCR檢測下限的100倍；
[0020] 4、特異性強(qiáng)：該方法通過2對引物特異性識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，相對于 PCR引物識(shí)別靶序列的2個(gè)獨(dú)立區(qū)域而言，特異性大大提高，假陽性出現(xiàn)的概率也隨之降 低；
[0021] 5、準(zhǔn)確性高：該方法幾乎不受反應(yīng)混合液中存在的大量外源DNA和雜質(zhì)的影響， 不需要從樣本中純化DNA，可直接利用發(fā)病組織及病殘?bào)w提取DNA進(jìn)行快速檢測，大大提高 檢測準(zhǔn)確度；
[0022] 6、本發(fā)明是針對灰葡萄孢菌琥珀酸脫氫酶基因B亞基（SdhB)第272位氨基酸的 3種突變類型進(jìn)行同時(shí)檢測，均能表現(xiàn)出較好的特異性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的抗性監(jiān)測和抗性流 行預(yù)警具有重要的應(yīng)用前景；
[0023] 7、本發(fā)明是國內(nèi)外首次利用LAMP技術(shù)對SDHI類殺菌劑抗性的灰葡萄孢菌株進(jìn)行 檢測，這種方法簡便快捷，對抗性菌株的準(zhǔn)確診斷、及時(shí)了解抗性群體發(fā)展動(dòng)態(tài)、指導(dǎo)科學(xué) 用藥、降低成本及減少環(huán)境污染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義；
【附圖說明】
[0024] 圖1 :LAMP檢測的反應(yīng)溫度優(yōu)化
[0025] 圖2 :LAMP檢測的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化
[0026] 圖3 :LAMP檢測的靈敏度優(yōu)化
[0027] 圖4 :LAMP檢測的重復(fù)性優(yōu)化。圖中顯示第1-3管呈紫色，為陰性；4-15管呈天 藍(lán)色，為陽性。其中，1-3為灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑的敏感菌株；4-7為灰葡萄孢菌對 SDHI類殺菌劑的H272R突變基因型菌株；8-11為灰葡萄孢菌對SDHI類殺菌劑的H272Y突 變基因型菌株；12-1