甲型流感病毒全基因組擴增方法及使用的復(fù)合引物和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種病毒的全基因組擴增方法，具體設(shè)及一種甲型流感病毒的全基因 組擴增方法，W及在該方法中所使用的復(fù)合引物和試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲型流感病毒基因組由8條負(fù)鏈RNA節(jié)段構(gòu)成。根據(jù)核蛋白（NP)和基質(zhì)蛋白（M)不 同分為A型、B型、C型。
[0003] A型流感病毒根據(jù)表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同分為16個HA亞型和9 個NA亞型。A型流感病毒常引起世界性大流行。
[0004] B型和C型流感病毒不分亞型。B型、C型流感病毒W(wǎng)局部暴發(fā)和散發(fā)流行為特征。 [000引禽流感(avian inf luenza，AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的一種家禽和野禽 的疾病綜合征，其病原禽流感病毒屬正粘病毒科流感病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒，根據(jù)血 凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同可分為16個HA亞型和9個NA亞型。
[0006] 目前，研究甲型流感病毒基因進(jìn)化的主要技術(shù)需要對甲型流感病毒的8個基因節(jié) 段分別進(jìn)行擴增后再進(jìn)行測序，不僅費事費力，而且對實驗室和人員要求較高，通量低，不 適用于大批量的樣本測序。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種復(fù)合引物，該復(fù)合引物對所有甲型流感病毒都 具有良好的特異性。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0009] -種用在甲型流感病毒全基因組擴增中的復(fù)合引物，其特征在于，包括2條正向引 物和1條反向引物，其中，
[0010] 正向引物F1 的序列為:ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG;
[0011] 正向引物F2 的序列為:ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG;
[0012] 反向引物R 的序列為:ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種檢測試劑盒，該檢測試劑盒能夠使獲得甲型流 感病毒的全基因組產(chǎn)物變得更加容易。
[0014] 為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0015] -種用在甲型流感病毒全基因組擴增中的試劑盒，試劑盒內(nèi)裝有若干管反應(yīng)液和 反應(yīng)復(fù)合酶，其特征在于，前述反應(yīng)液中含有前面記載的正向引物F1、正向引物F2和反向引 物R。
[0016] 前述的試劑盒，其特征在于，前述反應(yīng)液由W下成分組成： 無 RNA酶水 10/^、 反應(yīng)鹽離子緩沖液27///、 正向引物F1 ?μ、
[0017] 正向引物F2 ΙμΙ、 反向引物民 \叫、 RNA酶抑制劑 ΙμΙ、 共計 41/i。
[0018] 本發(fā)明的第Ξ個目的在于提供一種甲型流感病毒全基因組擴增方法，該方法操作 簡單、特異性好、靈敏度高、檢測快速、結(jié)果可靠。
[0019] 為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0020] -種甲型流感病毒全基因組擴增方法，其特征在于，包括W下步驟：
[0021 ] Stepl:利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA;
[0022] Step2:利用前面記載的試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴增核酸；
[0023] Step3:電泳擴增產(chǎn)物，并根據(jù)電泳圖判斷擴增結(jié)果。
[0024] 前述的擴增方法，其特征在于，在Step2中，擴增核酸的具體步驟為：
[0025] (1)將試劑盒中的反應(yīng)液混勻，離屯、，分裝，4化1/孔；
[0026] (2)向反應(yīng)孔中加入提取的樣品RNA，祉1 /孔；
[0027] (3)將試劑盒中的反應(yīng)復(fù)合酶加入到反應(yīng)孔中，1μ1/孔；
[002引（4)震蕩離屯、后上PCR機進(jìn)行檢測。
[0029] 前述的擴增方法，其特征在于，設(shè)置的PCR循環(huán)條件為：
[0030]
[0031]
[0032] 本發(fā)明的有益之處在于：
[0033] -、經(jīng)實驗證明，本發(fā)明的復(fù)合引物對所有甲型流感病毒都具有良好的特異性，能 快速有效的得到甲型流感病毒的全基因組產(chǎn)物；
[0034] 二、本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用方便，無需配置反應(yīng)體系，減少了人為誤差，增加了試驗 的準(zhǔn)確性，使得獲得甲型流感病毒的全基因組產(chǎn)物變得更加容易，而且保證了實驗結(jié)果重 復(fù)性更好；
[0035] Ξ、經(jīng)實驗證明，本發(fā)明的擴增方法不僅操作簡單，而且特異性好、靈敏度高、檢測 快速(PCR反應(yīng)時間小于4小時）、結(jié)果可靠，為臨床診斷、檢驗檢疫等領(lǐng)域的甲型流感病毒二 代測序技術(shù)提供了簡單可行的技術(shù)方案。
【附圖說明】
[0036] 圖1是采用本發(fā)明的方法獲得的甲型流感病毒8個基因節(jié)段擴增后結(jié)果圖；
[0037] 圖2是采用本發(fā)明的方法獲得的不同亞型的流感病毒8個基因節(jié)段擴增后結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0038] W下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作具體的介紹。
[0039] 一、引物與探針
[0040] 從NCBI上下載國內(nèi)甲型流感病毒的全基因序列，平均每年兩株。使用bioedit軟件 進(jìn)行比對，選擇8個基因節(jié)段兩端的保守區(qū)域。引物探針設(shè)計使用商業(yè)軟件Lasergene中的 PrimerSelect軟件，設(shè)計后的引物進(jìn)行合成。
[0041] 最終，本發(fā)明設(shè)計得到了由2條正向引物和1條反向引物組成的復(fù)合引物，該復(fù)合 引物的序列如下：
[0042] 正向引物F1 的序列為:ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG;
[0043] 正向引物F2 的序列為:ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG;
[0044] 反向引物R 的序列為:ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。
[004引探針序列與目的基因負(fù)鏈的堿基序列一致。
[0046] 因為正向引物F1、正向引物F2和反向引物R是針對甲型流感病毒8個基因節(jié)段的兩 端保守區(qū)，所W本發(fā)明的復(fù)合引物對所有甲型流感病毒都具有良好的特異性，能快速有效 的得到甲型流感病毒的全基因組產(chǎn)物。
[0047] 二、檢測試劑盒
[0048] 試劑盒內(nèi)裝有若干管反應(yīng)液和反應(yīng)復(fù)合酶，其中，反應(yīng)液中含有前面記載的正向 引物FI、正向引物F2和反向引物R。
[0049] 1、反應(yīng)液的成分和用量如下： 無 RNA酶水 1