一種基于mda的全基因組擴增的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA擴增技術領域，具體地，涉及一種基于MDA的全基因組擴增的方 法。
【背景技術】
[0002] 過去二十幾年里，隨著基因測序技術水平的提高以及千人基因組計劃、癌癥基因 組計劃、Meta-Hit計劃等重大國際合作項目的相繼開展，基因組研宄日漸被推向高潮。然 而，迄今為止使用的測序材料無一例外都是數(shù)百萬甚至更多細胞的混合DNA樣本。這種方 法能夠得到全基因組序列信息，但是對其進行研宄得到的結果只是一群細胞中信號的平均 值，或者只代表其中占優(yōu)勢數(shù)量的細胞信息，單個細胞獨有的特性被忽視。例如，科學家想 找出哪種突變存在于哪種細胞中幾乎是不可能的，只存在于少數(shù)細胞（如早期癌細胞）中 的突變也基本上被掩藏。另一方面，有些樣品稀少無法在實驗室培養(yǎng)，樣品量不足以進行全 基因組分析，例如腫瘤循環(huán)細胞、組織微陣列、早期發(fā)育的胚胎細胞等。這些都是全基因組 測序遇到的難題。
[0003] 單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新 技術。其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的 基因組之后通過外顯子捕獲進而高通量測序用于揭示細胞群體差異和細胞進化關系。
[0004] 全基因組擴增技術主要分為兩種類型：一是基于熱循環(huán)以PCR為基礎的擴增技 術，如簡并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、連接反應介導的PCR(LM-PCR)、擴增前引物延伸反 應（PEP)等；一是基于等溫反應不以PCR為基礎的擴增技術，如多重置換擴增（MDA)和基于 引物酶的全基因組擴增（PWGA)。
[0005] 在這兩種類型中，PCR擴增比較經典，但是，對不同的序列來說，PCR擴增的效率存 在相當大的偏差，易產生擴增偏倚問題：如富含CG的DNA序列和相應基因座位的非隨機丟 失，等位基因的非隨機丟失，以及與DNA片段大小相關的偏差（傾向于擴增更多短片段），尤 其是在應用于單細胞時，大量短片段導致片段間序列丟失，從而使其應用受限
[0006] MDA是目前公認的最好的單細胞基因組擴增技術，它能對全基因組進行高保真的 均勻擴增，擴增出10?IOOkb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列。但當樣 本量降低到單個細胞，就無法得到準確的擴增，對于單細胞基因組擴增需求來說，目前存在 技術壁皇。MALBAC的方法存在操作復雜，覆蓋率不高，PCR引入誤差等等缺陷。對于臨床應 用，存在這一些包括流程復雜、覆蓋率不高、誤差等問題。

【發(fā)明內容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種基于MDA的全基因組擴增的方法， 該方法能夠有效的進行單個細胞全基因組的擴增，提供足夠量的DNA為后續(xù)檢測使用。該 方法克服了覆蓋率低的問題，相比PCR的方法，該方法降低了誤差率，操作簡便，更便于臨 床檢測采用。
[0008] 本發(fā)明的技術方案如下：一種基于MDA的全基因組擴增的方法，其特征在于，包括 如下步驟，
[0009] 1)分離提取出單個細胞；
[0010] 2)提取所述單細胞的基因組DNA ;單細胞基因組DNA的提取目前有很多種方法，比 如Cell Search的方法，微流控芯片提取法。本發(fā)明獲得單細胞基因組DNA的方法還可以 是加入細胞裂解酶和裂解液，靜置10分鐘，通過裂解細胞得到其基因組DNA ;
[0011] 3)以步驟2)所得單細胞基因組DNA用稀釋溶液稀釋，得到DNA模板，用Haplox法 單細胞全基因組擴增試劑盒進行多重置換擴增
[0012] 4)將步驟3)所得產物進行純化，得到純化DNA。
[0013] 還包括步驟5)測序分析所得純化DNA。
[0014] Haplox法單細胞全基因組擴增試劑盒進行多重置換擴增的具體步驟如下：
[0015] 制備混合液A :在擴增體系中，加入隨機引物OCtamer和DNA模板，隨機引物 octamer的濃度為40 μ M，得到混合液A ;
[0016] 制備混合液 B :新鮮混合 IOx Phi29Buffer, ImM dNTPs, 0· ImM dUTP, Η20, and Phi29Polymerase(10U/yL,Enzymat ics)，得到混合液 B;4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0017] 反應進行：將混合液A與混合液B等體積混合加入反應管，在30°C下反應4-10個 小時，升溫至65°C失活酶；
[0018] 測試DNA濃度：隨后向反應管加入50uL H2O，用Qubit 2. Ofluorometer測試DNA 的濃度至 300 - 3000ng DNA。
[0019] 較佳地，反應進行時，將混合液A與混合液B等體積混合加入反應管后，再加入礦 物油覆蓋反應液，而后在30°C下反應。
[0020] 較佳地，反應完成后，升溫至65°C失活酶，隨后向反應管加入50uL H20,混合均勻， 快速離心，將混合液轉移至干凈無菌的封口膜上，液相會呈現(xiàn)水珠液滴，油相會分散到封口 膜上；用移液槍將液滴吸取到一個新的無菌小試管中，用Qubit 2. Ofluorometer測試DNA 的濃度至 300 - 3000ng DNA。
[0021] 純化DNA 的方法選用 Backman 的 Agencourt AMPure XP 試劑盒或 Qiagen Mini PCR column。
[0022] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所述基于MDA的全基因組擴增的方法，該方法能夠 有效的進行單個細胞全基因組的擴增，提供足夠量的DNA為后續(xù)檢測使用。而且該方法克 服了覆蓋率低的問題，相比PCR的方法，該方法降低了誤差率。該方法操作簡便，更便于臨 床檢測采用。
【附圖說明】
[0023] 圖1為MDA法擴增，MALBAC法擴增和普通PCR擴增的測序覆蓋率比較結果。
[0024] 圖2為MDA法擴增，MALBAC法擴增和普通PCR擴增的測序錯誤率比較結果。
【具體實施方式】
[0025] 除另有說明外，本申請中所有的科技術語都具有本發(fā)明所屬領域普通技術人員通 常理解的相同的含義。下列實施例旨在進一步舉例說明實現(xiàn)本發(fā)明的具體方式，而不應理 解為對本發(fā)明的限制。在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對發(fā)明進行改動得到的技 術方案都將落入本發(fā)明的權利要求范圍之內。
[0026] 實施例
[0027] 在本申請中，如無特別說明，本發(fā)明的實施都使用分子生物學、為生物學、重組DNA 和免疫學的常規(guī)技術，這些技術都是本領域技術人員所掌握的常規(guī)技術。這些技術在下 了文件中有詳細描述：Sambrook 等人編著的 Molecular Cloning:Alaboratory Mannual, 第二版（1989) ;Nucleic Acid Hybridizat ion(B.D.Hames 和 S.J.Higgin 編著，1984); Immnochemica I Methods in Cel I And Molecular Biology(Academic Press,London)〇 [0028] 實施例I :
[0029] 一種基于MDA的全基因組擴增的方法，包括如下步驟，
[0030] 1)分離提取出單個腫瘤細胞；
[0031] 2)用Cel I Search的方法提取所述單個腫瘤細胞的基因組DNA ;
[0032] 3)以步驟2)所得單細胞基因組DNA為模板，分別用Haplox法單細胞全基因組擴 增試劑盒進行多重置換擴增（MDA)，具體地，包括如下步驟：
[0033] 制備混合液A :在擴增體系中，加入隨機引物octamer和基因組DNA模板，隨機引 物octamer的濃度為40 μ M，得到混合液A ;
[0034] 制備混合液 B :新鮮混合 IOx Phi29Buffer, ImM dNTPs, 0· ImM dUTP, Η20, and Phi29Polymerase(10U/yL,Enzymat ics)，得到混合液 B;4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0035] 反應進行：將混合液A與混合液B等體積混合加入反應管，再加入礦物油覆蓋反應 液，在30°C下反應4-10個小時，升溫至65°C失活酶；
[0036] 測試DNA濃度：隨后向反應管加入50uL H2O，混合均勾，快速離心，將混合液轉移 至干凈無菌的封口膜上，液相會呈現(xiàn)水珠液滴，油相會分散到封口膜上；用移液槍將液滴吸 取到一個新的無菌小試管中，用Qubi t 2. Ofluorometer測試DNA的濃度至300 - 3000ng DNA0
[0037] 4)將步驟3)所得產物分別進行純化，得到純化DNA ;
[0038] 5)分別測序分析所得純化DNA，將測序結果與模板DNA序列進行對比，計算測序覆 蓋率和錯誤率，將數(shù)據(jù)記錄如表1，并依據(jù)表1中的數(shù)據(jù)作圖1和圖2。
[0039] 表I. Haplox法單細胞全基因組擴增覆蓋率和錯誤率比較
[0040]
【主權項】
1. 一種基于MDA的全基因組擴增的方法，其特征在于，包括如下步驟， 1) 分離提取出單個細胞； 2) 提取所述單細胞的基因組DNA ; 3) 以步驟2)所得單細胞基因組DNA用稀釋溶液稀釋，得到DNA模板，用Haplox法單細 胞全基因組擴增試劑盒進行多重置換擴增 4) 將步驟3)所得產物進行純化，得到純化DNA。
2. 如權利要求1所述的基于MDA的全基因組擴增的方法，其特征在于，還包括步驟5) 測序分析所得純化DNA。
3. 如權利要求1所述的基于MDA的全基因組擴增的方法，其特征在于，Haplox法單細 胞全基因組擴增試劑盒進行多重置換擴增的具體步驟如下： 制備混合液A :在擴增體系中，加入隨機引物octamer和DNA模板，隨機引物octamer的 濃度為40 μ M，得到混合液A ; 制備混合液 B :新鮮混合 IOx Phi29Buffer, ImM dNTPs, 0· ImM dUTP, Η20, and Phi29Polymerase(10U/yL,Enzymat ics)，得到混合液 B;4°C保存?zhèn)溆茫? 反應進行：將混合液A與混合液B等體積混合加入反應管，在30°C下反應4-10個小時， 升溫至65 °C失活酶； 測試DNA濃度：隨后向反應管加入50uL H2O，用Qubit 2. Ofluorometer測試DNA的濃 度至 300 - 3000ng DNA。
4. 如權利要求3所述的基于MDA的全基因組擴增的方法，其特征在于， 反應進行時，將混合液A與混合液B等體積混合加入反應管后，再加入礦物油覆蓋反應 液，而后在30°C下反應。
5. 如權利要求4所述的基于MDA的全基因組擴增的方法，其特征在于，反應完成后，升 溫至65°C失活酶，隨后向反應管加入50uL H20,混合均勻，快速離心，將混合液轉移至干凈 無菌的封口膜上，液相會呈現(xiàn)水珠液滴，油相會分散到封口膜上；用移液槍將液滴吸取到一 個新的無菌小試管中，用Qubi t 2. Ofluorometer測試DNA的濃度至300 - 3000ng DNA。
6. 如權利要求1所述的基于MDA的全基因組擴增的方法，其特征在于，純化DNA的方法 選用 Backman 的 Agencourt AMPure XP 試劑盒或 Qiagen Mini PCR column。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于MDA的全基因組擴增的方法，其特征在于，包括如下步驟，1)分離提取出單個細胞；2)提取所述單細胞的DNA；3)以步驟2)所得單細胞DNA為模板，用Haplox法單細胞全基因組擴增試劑盒進行多重置換擴增(MDA)；4)將步驟3)所得產物進行純化，得到純化DNA。
【IPC分類】C12N15-10, C12Q1-68
【公開號】CN104560950
【申請?zhí)枴緾N201410709576
【發(fā)明人】許明炎
【申請人】深圳市海普洛斯生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月28日