專利名稱：與sars相關(guān)的冠狀病毒全基因組芯片及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與SARS相關(guān)的冠狀病毒全基因組芯片及其構(gòu)建策略、方法及用途。
背景技術(shù)：
病毒檢測(cè)基因芯片背景?；蛐酒?，簡(jiǎn)單地說(shuō)就是在一塊特殊處理過(guò)的玻璃片或其它固相支持物(如硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)上，將基因探針以大規(guī)模陣列的形式排布，形成可與目的分子(如病毒基因組)相互作用的固相表面。分子雜交后的探針陣列因?yàn)樘结樕辖Y(jié)合目的分子的不同而在激光的順序激發(fā)下分別呈現(xiàn)不同的熒光發(fā)射譜征，根據(jù)其波長(zhǎng)及波幅特征收集信號(hào)，作出比較分析從而得到所要的信息。
基因芯片現(xiàn)今的應(yīng)用主要有以下方面基因表達(dá)時(shí)空特征分析；基因差異表達(dá)檢測(cè)；新基因的發(fā)現(xiàn)；大規(guī)模DNA測(cè)序；基因型、基因突變和多態(tài)性分析；遺傳病相關(guān)基因的定位；腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)；單一或少量感染性疾病的診斷以及藥物研究等。
病毒檢測(cè)芯片具有以下特點(diǎn)1、高通量每平方厘米上可以結(jié)合5000～10000個(gè)核酸探針，也就是說(shuō)可以同時(shí)平行地進(jìn)行上萬(wàn)個(gè)分子雜交反應(yīng)?，F(xiàn)今基因序列已知的上千種病毒僅通過(guò)一張芯片就可以完全容納。
2、高精確度、靈敏度通過(guò)分子雜交來(lái)檢測(cè)病毒的存在是當(dāng)前應(yīng)用的技術(shù)中精確性和特異性最高的，據(jù)報(bào)道中表明，應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行臨床診斷，準(zhǔn)確度可達(dá)到98％-100％。
3、組合性現(xiàn)在開發(fā)出的可以檢測(cè)病毒的基因芯片產(chǎn)品均只能單一性檢測(cè)一種或少量幾種病毒，如此則不能發(fā)揮基因芯片最大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。我們的病毒組合檢測(cè)芯片將幾乎全部已知病毒的檢測(cè)組合在一張芯片上，最大程度地利用芯片技術(shù)的潛力，提高時(shí)效性的同時(shí)降低成本。病毒的組合檢測(cè)對(duì)于環(huán)境監(jiān)控和質(zhì)量監(jiān)督等方面則具有劃時(shí)代的意義。
4、周期短、低成本、低工作量通過(guò)常規(guī)方法對(duì)病毒進(jìn)行分子檢測(cè)通常至少需要一周時(shí)間，且對(duì)于多種病毒則需要相同的工作重復(fù)進(jìn)行。病毒組合檢測(cè)芯片可以在4～5小時(shí)的自動(dòng)化過(guò)程中一次性檢測(cè)所有病毒，大大降低工作時(shí)耗、強(qiáng)度和試驗(yàn)成本。
SARS冠狀病毒相關(guān)背景及SARS冠狀病毒全基因組芯片的
背景技術(shù)：
從2002年11月到現(xiàn)在，世界范圍內(nèi)的急性呼吸窘迫綜合癥(severe acute respiratorysyndrome，SARS)的爆發(fā)和流行被證明與一種新型變異的冠狀病毒相關(guān)，目前國(guó)際上將這種病毒叫做SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS related virus)或SARS病毒(SARS virus)，在本發(fā)明中我們稱之為“與SARS相關(guān)的冠狀病毒”。在中國(guó)將這種急性呼吸窘迫綜合癥也稱做非典型性肺炎。3月23日，亞特蘭大的美國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄往UCSF Dr.Deresi教授的標(biāo)本經(jīng)過(guò)其對(duì)包含1000種病毒的芯片測(cè)試，首次證實(shí)造成這種大規(guī)模流行的病因是一種冠狀病毒。繼之，加拿大BCCA基因組科學(xué)中心4月13日首次發(fā)布了SARS冠狀病毒(Genbank序列號(hào)AY274119)全序列，4月15日Genbank加以注釋再次發(fā)布(Genbank序列號(hào)NC_004718)。4月16日給猴子單獨(dú)接種這種從臨床確診病人身上分離的SARS冠狀病毒，發(fā)現(xiàn)在猴子身上引起的癥狀與SARS病人極其相似。WHO的SARS多中心協(xié)作研究成員在WHO多國(guó)協(xié)作研究基礎(chǔ)上基本確定一種新型冠狀病毒是這種急性呼吸道癥狀SARS的病原，衣原體等其它可疑病原仍需進(jìn)一步評(píng)估。
所報(bào)道的目前認(rèn)為是SARS的發(fā)病原因的冠狀病毒，是一種變異程度非常大的冠狀病毒。它屬于冠狀病毒科(來(lái)自拉丁語(yǔ)corona，象皇冠的)，是一種RNA病毒，病毒體含有單鏈正鏈線性RNA分子，感染脊椎動(dòng)物，尤其是溫血?jiǎng)游?，包括一些哺乳?比如人、牛、貓、豬和鼠)，以及幾種禽類(比如火雞和雞)。該科病毒基因組由RNA組成，具有29,000個(gè)到31,000個(gè)堿基。
香港大學(xué)最新發(fā)現(xiàn)，感染人類的“非典”病毒成員最少有6個(gè)。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，可為近日部分患者藥物無(wú)效、病情反復(fù)之謎，提供破解的線索。然而，從衛(wèi)生防疫角度看，“非典”病毒數(shù)目繁多，短期內(nèi)逐一擊破，會(huì)非常困難。港大醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系將多個(gè)來(lái)自世界各地的“非典”病毒樣本作比較，竟發(fā)現(xiàn)當(dāng)中6個(gè)病毒樣本，某一段基因出現(xiàn)不相同的組合，包括兩個(gè)來(lái)自香港本地、兩個(gè)來(lái)自廣州、一個(gè)來(lái)自加拿大和一個(gè)來(lái)自美國(guó)的，就是說(shuō)6個(gè)病毒是家族中不同的成員。不過(guò)，目前尚不知哪個(gè)樣本的病毒是“母體”，研究人員傾向于來(lái)自香港的一個(gè)樣本與來(lái)自加拿大和美國(guó)的相似；而來(lái)自香港的另一個(gè)樣本，則與廣州的兩個(gè)樣本相似。暫時(shí)未知這些非典型肺炎病毒家族成員是本已存在，還是由其中一種非典型肺炎病毒變種衍生出來(lái)的。而各家族成員之間的關(guān)系，以至病征上的異同都尚未清楚。不過(guò)，這發(fā)現(xiàn)可能有助解答一系列患者感染后出現(xiàn)病情極大差異之謎。
香港大學(xué)的研究結(jié)果，證實(shí)一直以米不少人“非典”病毒不只一種的擔(dān)憂，是正確的。雖然未知這六個(gè)病毒成員之間的關(guān)系，但由于成員有六個(gè)之多，有關(guān)專家由此推斷，非典型肺炎的康復(fù)者有可能在康復(fù)后，再受另一種病毒成員侵襲，身體并沒(méi)有相應(yīng)抗體下而受感染，造成重復(fù)感染的現(xiàn)象。另一方面，若病毒有6個(gè)成員，部分病患者體內(nèi)可能同時(shí)有兩個(gè)以上不同病毒成員，令醫(yī)護(hù)人員更難制訂有效的治療方案。醫(yī)護(hù)人員必須知道病人身上的病毒是哪一個(gè)成員，才可以采取最有效的治療方案，而測(cè)試方法亦因此受到限制。這無(wú)疑對(duì)防治及康復(fù)等工作倍添困難。
歷史上，標(biāo)準(zhǔn)病毒檢測(cè)技術(shù)依賴于病毒分離和體外病毒培養(yǎng)或者免疫檢測(cè)。當(dāng)前SARS冠狀病毒的抗體和抗原標(biāo)準(zhǔn)還未建立，并且免疫檢測(cè)主要依賴于抗體的質(zhì)量和可獲得性，SARS冠狀病毒單克隆抗體和ELISA的IgM抗體研究還正在進(jìn)行。SARS標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞株也未建立，SARS冠狀病毒體外培養(yǎng)較難，SARS冠狀病毒代謝模式和抗體動(dòng)力學(xué)研究仍不清楚，已經(jīng)開發(fā)出的SARS冠狀病毒診斷ELISA試劑盒的敏感性及特異性還有待進(jìn)一步確認(rèn)。甚至是目前最好的方法學(xué)的缺陷也變得明顯。我們研制的SARS冠狀病毒全基因組芯片除了在診斷上具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，對(duì)基因多樣性數(shù)據(jù)庫(kù)的建立；人群中SARS冠狀病毒全基因組序列變異的監(jiān)控以及環(huán)境中SARS冠狀病毒污染的監(jiān)控有特別重要的意義。目前針對(duì)冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)存在著局限性，因此SARS冠狀病毒全基因組芯片的應(yīng)用是十分必須的。下面將就三個(gè)方面闡述SARS冠狀病毒全基因組芯片的重要意義(1)SARS冠狀病毒全基因組芯片對(duì)于“超級(jí)傳染源”的早期發(fā)現(xiàn)以及愈后病人對(duì)環(huán)境污染的監(jiān)控有重要意義。PCR檢測(cè)具有很好的特異性，但是無(wú)法檢測(cè)出所有分泌冠狀病毒的病人。盡早并可靠地檢測(cè)出SARS冠狀病毒可以幫助醫(yī)生識(shí)別當(dāng)病人出現(xiàn)發(fā)燒和其他可疑癥狀時(shí)是否感染了SARS，同時(shí)將其及時(shí)隔離并嚴(yán)格實(shí)施控制感染的措施。這將大大降低SARS病人將疾病繼續(xù)傳播的危險(xiǎn)。
超級(jí)傳染源”一詞用以描述一名感染SARS的病人將疾病傳染給很多人?！俺?jí)傳染源”的現(xiàn)象出現(xiàn)在疾病暴發(fā)的早期，當(dāng)時(shí)對(duì)這種現(xiàn)象沒(méi)有足夠的認(rèn)識(shí)和了解。最初人們只知道SARS是一種新型疾病，認(rèn)為很多患有非典型性肺炎的病人是由其他原因造成的，因此并沒(méi)有對(duì)感染者實(shí)施隔離和嚴(yán)格的控制措施。因此疾病暴發(fā)的早期沒(méi)有實(shí)行嚴(yán)格的感染控制措施。在缺乏保護(hù)措施的情況下，很多醫(yī)務(wù)工作者，病人親屬以及前往醫(yī)院的探視者都暴露于SARS冠狀病毒之下，隨后也都發(fā)展為SARS病患。有專家指出SARS病人出院后在一段時(shí)間內(nèi)都有可能對(duì)環(huán)境造成潛在的SARS冠狀病毒威脅。
(2)SARS冠狀病毒全基因組芯片對(duì)于追蹤并確定SARS冠狀病毒的動(dòng)物來(lái)源有重要意義。已有報(bào)道狗的主人中一人因感染“非典”后死亡，家中其他成員也根據(jù)防治“非典”的有關(guān)措施予以隔離。家人養(yǎng)的這只寵物狗，也在此期間死亡，有關(guān)部門還沒(méi)有確定其是否是因?yàn)楦腥尽胺堑洹倍?。荷蘭Utrecht大學(xué)的Peter Rottier研究小組通過(guò)對(duì)傳染性貓腹腦炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus，F(xiàn)IPV)導(dǎo)入小鼠冠狀病毒的一個(gè)基因片段，貓F(tuán)IPV就可以感染小鼠細(xì)胞了，這項(xiàng)研究證明冠狀病毒能夠通過(guò)基因改組輕易的改變宿主，進(jìn)而推斷SARS冠狀病毒可能是現(xiàn)有的動(dòng)物及人類冠狀病毒突變成一種更致命的形式造成的。如果另外的證據(jù)支持這種動(dòng)物性感染，通過(guò)對(duì)動(dòng)物身上分離得到的SARS冠狀病毒進(jìn)行全基因組芯片分析可以輕易分析證實(shí)這種種系間傳播的分子依據(jù)。
(3)SARS冠狀病毒全基因組芯片對(duì)于SARS冠狀病毒基因多樣化數(shù)據(jù)庫(kù)的建立有重要意義。有報(bào)道說(shuō)從臺(tái)灣兩個(gè)人分離到SARS冠狀病毒其并不出現(xiàn)SARS相關(guān)臨床癥狀，對(duì)這種分離到的SARS冠狀病毒進(jìn)行全基因組芯片分析有助于對(duì)SARS冠狀病毒遺傳抗性的認(rèn)識(shí)。當(dāng)然SARS冠狀病毒可能存在的天然遺傳抗性不是由單一因素決定的，但是僅僅依靠血清學(xué)以及PCR的方法不能確定SARS冠狀病毒相關(guān)具體基因的多樣性以及可能發(fā)生的微小改變，當(dāng)RNA病毒(比如HIV病毒和流行性感冒病毒)在活細(xì)胞內(nèi)迅速增殖(基因組復(fù)制和病毒體裝配)時(shí)，它們可以在短期內(nèi)較容易地在不同組織中改變其遺傳結(jié)構(gòu)。因此，專家認(rèn)為研究SARS冠狀病毒的突變范圍對(duì)病毒感染的診斷和治療是非常必要的。SARS冠狀病毒全基因組芯片可以方便快捷地達(dá)到這一目的，對(duì)病毒毒株的變異以及分子流行病學(xué)調(diào)查有重要意義。
我們?cè)O(shè)計(jì)的SARS冠狀病毒全基因組芯片主要根據(jù)GenBank公布的SARS相關(guān)冠狀病毒全基因組序列(GenBank序列號(hào)NC_004718)以及迄今GenBank公布的所有SARS冠狀病毒全基因組序列(包括1、SARS冠狀病毒HKU-39849，GenBank序列號(hào)AY278491；2、SARS冠狀病毒Urbani，GenBank序列號(hào)AY278741；3、SARS冠狀病毒CUHK-W1，GenBank序列號(hào)AY278554；以及GenBank已公布了部分基因組序列的SARS冠狀病毒1、SARS冠狀病毒BJ04，GenBank序列號(hào)AY279354；2、SARS冠狀病毒BJ03，GenBank序列號(hào)AY278490；3、SARS冠狀病毒GZ01，GenBank序列號(hào)AY278489；4、SARS冠狀病毒BJ01，GenBank序列號(hào)AY278488；5、SARS冠狀病毒BJ02，GerBank序列號(hào)AY278487；6、SARS冠狀病毒Taiwan RNA-directed RNA多聚酶(pol)基因部分編碼區(qū)，GenBank序列號(hào)AY268049；7、SARS冠狀病毒Vietnam200300592多聚酶基因部分編碼區(qū)，GenBank序列號(hào)AY269391)。它與現(xiàn)在已有的冠狀病毒比較結(jié)果顯示，其核苷酸水平的相似性極差。其中我國(guó)測(cè)完SARS冠狀病毒全基因組序列的五株SARS相關(guān)冠狀病毒分別分離自廣州和北京地區(qū)的患者及死亡病例中。其中兩株分別來(lái)源于不同地區(qū)死亡病例的尸解肺組織標(biāo)本；一株來(lái)源于北京尸解肝和淋巴結(jié)組織混合物；還有一株則來(lái)源于北京患者鼻咽拭子標(biāo)本。
與加拿大與美國(guó)發(fā)布的冠狀病毒序列的比較顯示，該病毒的變異能力極強(qiáng)，在很短的幾代內(nèi)有多處堿基突變。包括進(jìn)這些不同來(lái)源的所有標(biāo)本全基因組序列，將使我們的芯片覆蓋了所有已知的變異并將十分準(zhǔn)確地確定標(biāo)本是否被SARS冠狀病毒感染，并有助于了解病毒的突變機(jī)制，及時(shí)掌握病毒在各地區(qū)的分布情況，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
我們的選擇策略是，從待選基因組序列的5’端開始，以40-80個(gè)堿基為探針標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度，相鄰探針重疊5-30個(gè)堿基，選出的探針序列完全覆蓋了整個(gè)基因組序列。與存放小量的PCR擴(kuò)增基因策略不同，這使我們能夠靶向基因的最大獨(dú)特性區(qū)域，得以在保留敏感性的同時(shí)消除交叉雜交的問(wèn)題。而且它不需要昂貴的和費(fèi)時(shí)的酶擴(kuò)增以及證實(shí)上千條DNA模板的過(guò)程。這對(duì)冠狀病毒特別重要，因?yàn)槠浠蚪MA/T含量比較高，約60％，使用較長(zhǎng)的合成的寡核苷酸解決了這一問(wèn)題。
根據(jù)同樣的選擇策略，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)以及禽傳染性氣管炎病毒(Avian infectious bronchitisvirus)的40-80堿基對(duì)長(zhǎng)的病毒最保守序列的特異性寡核苷酸探針，這樣在快速排查SARS冠狀病毒的基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步排查是否還有其它動(dòng)物類型冠狀病毒的感染。冠狀病毒在人以及家畜和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上引起的許多疾病都有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，經(jīng)常導(dǎo)致動(dòng)物嚴(yán)重的腸道或者呼吸道感染。豬傳染性胃腸炎是由冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種急性、高度接觸性的傳染病。病豬和帶毒豬是本病的主要傳染來(lái)源。目前尚無(wú)特效的藥物可供治療，此病發(fā)病率很高，傳播快，一旦發(fā)病，采取隔離、消毒措施效果不大。禽傳染性支氣管炎，通常可根據(jù)發(fā)病情況，解剖所見作出診斷。目前尚無(wú)特效藥物。
本芯片還包含從煙草花葉病毒全基因組序列以及人基因組中10000個(gè)已知基因和7000多個(gè)EST片段選出的40-80個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的寡核苷酸的陰性探針，共計(jì)有數(shù)十個(gè)至一百個(gè)芯片掃描的陰性對(duì)照點(diǎn)。將雜交完畢的芯片置于激光共聚焦芯片掃描儀中進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換，以激光作為激發(fā)光源進(jìn)行掃描，采集各個(gè)雜交點(diǎn)熒光信號(hào)的位置、熒光強(qiáng)度等信息，運(yùn)用專業(yè)分析軟件例如AMAD(Analysis of Microarray Data的縮寫)對(duì)所采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，主要組成分析、各種簇的分析，進(jìn)而確定樣品是否有SARS感染。本芯片將仔細(xì)選擇的病毒序列與隨機(jī)擴(kuò)增步驟組合，克服了以往基于RT-PCR檢測(cè)策略的局限，使得檢測(cè)范圍更廣，檢測(cè)結(jié)果更為公正。
冠狀病毒在人以及家畜和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上引起的許多疾病都有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，經(jīng)常導(dǎo)致動(dòng)物嚴(yán)重的腸道或者呼吸道感染。
豬傳染性胃腸炎是由冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種急性、高度接觸性的傳染病。病豬和帶毒豬是本病的主要傳染來(lái)源。目前尚無(wú)特效的藥物可供治療，此病發(fā)病率很高，傳播快，一旦發(fā)病，采取隔離、消毒措施效果不大。禽傳染性支氣管炎，通?？筛鶕?jù)發(fā)病情況，解剖所見作出診斷。目前尚無(wú)特效藥物。
我們?cè)趪?guó)際互聯(lián)網(wǎng)上查獲，國(guó)際上只有Combimatrix公司宣布在SARS病毒全序列發(fā)布48小時(shí)之內(nèi)研發(fā)出了診斷SARS相關(guān)冠狀病毒的芯片。本發(fā)明的與SARS相關(guān)的冠狀病毒全基因組芯片包括進(jìn)剛剛測(cè)完序的全基因組序列信息，并立足于現(xiàn)有的芯片開發(fā)及病毒背景資源豐富的優(yōu)勢(shì)，將不斷完成的其它SARS病毒變異序列有效地包括進(jìn)去。下面是目前已知的所有冠狀病毒分離株+---Corona_S2 (130)+---Viruses(130)+---ssrna positive-strand viruses-no dna stage(130)+---nidovirales(130)+---coronaviridae (130)+---coronavirus transmissible (5)+---coronavirus enteric (2)+---coronavirus epidemic (4)+---coronavirus coronavirus (37)+---coronavirus sialodacryoadenitis (1)+---coronavirus gastroenteritis (5)+---coronavirus hepatitis (9)+---coronavirus infectious (61)+---coronavirushemagglutinating (1)+---coronavirus respiratory (5)下面是目前已經(jīng)得到全基因組序列的冠狀病毒·Avian infectious bronchitis virus.Avian infectious bronchitis virus(strain 6/82).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette CK).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette M42).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette US).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette)
.Avian infectious bronchitis virus(strain D274).Avian infectious bronchitis virus(strain D3896).Avian infectious bronchitis virus(strain Gray).Avian infectious bronchitis virus(strain KB8523).Avian infectious bronchitis virus(strain M41).Avian infectious bronchitis virus(strain Portugal/322/82).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/123/82).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/142/86).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/167/84).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/183/66).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/68/84)·Avian infectious laryngotracheitis virus·Enteric coronavirus·Equine coronavirus·Group 1 speciesCanine coronavirusFeline coronavirusHuman coronavirus(strain 229E)Porcine epidemic diarrhea virusTransmissible gastroenteritis virus·Group 2 speciesBovine coronavirusHuman coronavirus(strain OC43)Murine hepatitis virusPorcine hemagglutinating encephalomyelitis virusRat coronavirus·Group 3 speciesTurkey enteric coronavirus·Human enteric coronavirus 4408
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中，我們的芯片設(shè)計(jì)的策略是以SARS冠狀病毒TOR2株全基因組序列(NC_004718)為檢測(cè)對(duì)象，設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針和芯片。我們以SARS冠狀病毒全基因組中的每40-80個(gè)堿基序列作為一個(gè)探針序列，相鄰探針序列重復(fù)5-30個(gè)堿基，特別是以70個(gè)堿基序列作為一個(gè)探針序列，相鄰探針序列重復(fù)25個(gè)堿基作為首選的選擇模式，從而覆蓋整個(gè)SARS冠狀病毒的基因組。合成好的探針利用基因芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制于固相載體表面，固相載體可以包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等材料制成的片基。
利用逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，我們將來(lái)自人體的血液及分泌物等臨床樣品以及相關(guān)病毒的標(biāo)準(zhǔn)樣品等中提取的總體RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，在擴(kuò)增的過(guò)程中摻入熒光標(biāo)記。擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)后，熒光信號(hào)通過(guò)基因芯片掃描儀掃描分析處理，最終得到全基因組探針的陰陽(yáng)性結(jié)果。經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)毒株雜交結(jié)果的對(duì)比可以得到檢測(cè)樣品的帶毒情況。
本發(fā)明的技術(shù)路線是探針設(shè)計(jì)、探針合成、芯片點(diǎn)制、樣本處理與標(biāo)記、芯片雜交、結(jié)果分析。
本發(fā)明描述了一種基因芯片，其特征是固定在基片上的探針矩陣覆蓋了SARS冠狀病毒的全基因組序列，所描述的SARS冠狀病毒的全基因組序列是指GenBank已公布的SARS冠狀病毒毒株或亞型的全基因組序列，所描述的SARS冠狀病毒毒株或亞型包括SARScoronavirus TOR2(GenBank序列號(hào)NC 004718/AY274119)，SARS coronavirus HKU-39849(GenBank序列號(hào)AY278491)，SARS coronavirus CUHK-W1(GenBank序列號(hào)AY278554)，SARS coronavirus Urbani(GenBank序列號(hào)AY278741)，SARS coronavirns BJ01(GenBank序列號(hào)AY278488)，SARS coronavirns BJ02(GenBank序列號(hào)AY278487)，SARS coronavirusBJ03(GenBank序列號(hào)AY278490)，SARS coronavirus BJ04(GenBank序列號(hào)AY279354)，SARS coronavirus GZ01(GenBank序列號(hào)AY278489)。
本發(fā)明所描述的基因芯片上的探針特征是從SARS冠狀病毒全基因組中的每40-80個(gè)堿基序列作為一個(gè)探針序列，相鄰探針序列重復(fù)5-30個(gè)堿基，所描述的基因芯片上的探針特征特別是指以70個(gè)堿基序列作為一個(gè)探針序列，相鄰探針序列重復(fù)25個(gè)堿基的模式。
根據(jù)同樣的選擇策略，我們還設(shè)計(jì)了針對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)以及禽傳染性氣管炎病毒(Avian infectious bronchitisvirus)的40-100堿基對(duì)長(zhǎng)的病毒特異性寡核苷酸探針。這樣的設(shè)計(jì)策略的目的是，在快速排查SARS冠狀病毒的基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步排查是否還有其它動(dòng)物類型冠狀病毒的感染。
本發(fā)明所描述的基因芯片的用途之一是用于檢測(cè)SARS冠狀病毒，所描述的檢測(cè)對(duì)象可以包括來(lái)自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動(dòng)植物樣品、食品水源樣品以及水環(huán)境和大氣環(huán)境樣品等等，所描述的基因芯片的用途之二是用于監(jiān)測(cè)SARS冠狀病毒的變異和亞型，所描述的監(jiān)測(cè)對(duì)象可以包括來(lái)自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動(dòng)植物樣品、食品水源樣品以及水環(huán)境和大氣環(huán)境樣品等等。
本發(fā)明所描述的基因芯片的用途之三是用于鑒別SARS冠狀病毒和其它冠狀病毒，所描述的鑒別對(duì)象可以包括來(lái)自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動(dòng)植物樣品、食品水源樣品以及水環(huán)境和大氣環(huán)境樣品等等。


說(shuō)明書附圖中圖1所示為與SARS相關(guān)的冠狀病毒全基因組芯片點(diǎn)樣示意圖，點(diǎn)制規(guī)則為每條探針重復(fù)三個(gè)點(diǎn)，分為5個(gè)矩陣，每個(gè)矩陣136條探針，每個(gè)矩陣包括38個(gè)陽(yáng)性坐標(biāo)點(diǎn)，形成25列×14行的點(diǎn)陣。每組三聯(lián)點(diǎn)為一條探針。圖中的A所示的灰色點(diǎn)為陽(yáng)性坐標(biāo)點(diǎn)，B所示的黑色三聯(lián)點(diǎn)為檢測(cè)探針。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的與SARS相關(guān)的冠狀病毒全基因組芯片的制備和用途作了詳細(xì)說(shuō)明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1 芯片的制備探針的選取我們選取SARS冠狀病毒TOR2株全基因組序列(NC_004718)為檢測(cè)對(duì)象，設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針和芯片。TOR2株全基因組序列(NC_004718)基因組全長(zhǎng)29736堿基，從5’端開始，以70個(gè)堿基為探針標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度，相鄰探針重疊25個(gè)堿基。如探針1的首尾位置為基因組序列中第1-70個(gè)堿基，探針2的首尾位置為基因組序列中第46-115個(gè)堿基，探針3的首尾位置為基因組序列中第91-160個(gè)堿基，探針4的首尾位置為基因組序列中第136-205個(gè)堿基，以此類推，共得到660個(gè)探針，如表1所示，這660個(gè)探針覆蓋了該基因組的全部序列。每條探針的5’端進(jìn)行氨基修飾。
表1 SARS冠狀病毒TOR2株全基因組探針序列序號(hào) 序列 起始位點(diǎn)sars001 CTACCCAGGAAAAGCCAACCAACCTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTG1sars002 CTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTAGCTGTCGCTCGGCTGCATGCCTAGTGCACCTACGCAGTATAAA46sars003 GCCTAGTGCACCTACGCAGTATAAACAATAATAAATTTTACTGTCGTTGACAAGAAACGAGTAACTCGTC91sars004 GTTGACAAGAAACGAGTAACTCGTCCCTCTTCTGCAGACTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGTCGAT136sars005 CGGTTTCGTCCGTGTTGCAGTCGATCATCAGCATACCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGA181sars006 GTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGAGAGCCTTGTTCTTGGTGTCAACGAGAAAACACACGTCCAAC226sars007 GTCAACGAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTCCTTCAGGTTAGAGACGTGCTAGTGCGTGGCT271sars008 GTTAGAGACGTGCTAGTGCGTGGCTTCGGGGACTCTGTGGAAGAGGCCCTATCGGAGGCACGTGAACACC316sars009 GCCCTATCGGAGGCACGTGAACACCTCAAAAATGGCACTTGTGGTCTAGTAGAGCTGGAAAAAGGCGTAC361sars010 CTAGTAGAGCTGGAAAAAGGCGTACTGCCCCAGCTTGAACAGCCCTATGTGTTCATTAAACGTTCTGATG406sars011 TATGTGTTCATTAAACGTTCTGATGCCTTAAGCACCAATCACGGCCACAAGGTCGTTGAGCTGGTTGCAG451sars012 CACAAGGTCGTTGAGCTGGTTGCAGAAATGGACGGCATTCAGTACGGTCGTAGCGGTATAACACTGGGAG496sars013 GGTCGTAGCGGTATAACACTGGGAGTACTCGTGCCACATGTGGGCGAAACCCCAATTGCATACCGCAATG541sars014 GAAACCCCAATTGCATACCGCAATGTTCTTCTTCGTAAGAACGGTAATAAGGGAGCCGGTGGTCATAGCT586sars015 AATAAGGGAGCCGGTGGTCATAGCTATGGCATCGATCTAAAGTCTTATGACTTAGGTGACGAGCTTGGCA631sars016 TATGACTTAGGTGACGAGCTTGGCACTGATCCCATTGAAGATTATGAACAAAACTGGAACACTAAGCATG676sars017 GAACAAAACTGGAACACTAAGCATGGCAGTGGTGCACTCCGTGAACTCACTCGTGAGCTCAATGGAGGTG721sars018 CTCACTCGTGAGCTCAATGGAGGTGCAGTCACTCGCTATGTCGACAACAATTTCTGTGGCCCAGATGGGT766sars019 AACAATTTCTGTGGCCCAGATGGGTACCCTCTTGATTGCATCAAAGATTTTCTCGCACGCGCGGGCAAGT811sars020 GATTTTCTCGCACGCGCGGGCAAGTCAATGTGCACTCTTTCCGAACAACTTGATTACATCGAGTCGAAGA856sars021 CAACTTGATTACATCGAGTCGAAGAGAGGTGTCTACTGCTGCCGTGACCATGAGCATGAAATTGCCTGGT901sars022 GACCATGAGCATGAAATTGCCTGGTTCACTGAGCGCTCTGATAAGAGCTACGAGCACCAGACACCCTTCG946sars023 AGCTACGAGCACCAGACACCCTTCGAAATTAAGAGTGCCAAGAAATTTGACACTTTCAAAGGGGAATGCC991sars024 TTTGACACTTTCAAAGGGGAATGCCCAAAGTTTGTGTTTCCTCTTAACTCAAAAGTCAAAGTCATTCAAC1036sars025 AACTCAAAAGTCAAAGTCATTCAACCACGTGTTGAAAAGAAAAAGACTGAGGGTTTCATGGGGCGTATAC1081sars026 ACTGAGGGTTTCATGGGGCGTATACGCTCTGTGTACCCTGTTGCATCTCCACAGGAGTGTAACAATATGC1126sars027 TCTCCACAGGAGTGTAACAATATGCACTTGTCTACCTTGATGAAATGTAATCATTGCGATGAAGTTTCAT1171sars028 TGTAATCATTGCGATGAAGTTTCATGGCAGACGTGCGACTTTCTGAAAGCCACTTGTGAACATTGTGGCA1216sars029 AAAGCCACTTGTGAACATTGTGGCACTGAAAATTTAGTTATTGAAGGACCTACTACATGTGGGTACCTAC1261sars030 GGACCTACTACATGTGGGTACCTACCTACTAATGCTGTAGTGAAAATGCCATGTCCTGCCTGTCAAGACC1306sars031 ATGCCATGTCCTGCCTGTCAAGACCCAGAGATTGGACCTGAGCATAGTGTTGCAGATTATCACAACCACT1351sars032 AGTGTTGCAGATTATCACAACCACTCAAACATTGAAACTCGACTCCGCAAGGGAGGTAGGACTAGATGTT1396sars033 CGCAAGGGAGGTAGGACTAGATGTTTTGGAGGCTGTGTGTTTGCCTATGTTGGCTGCTATAATAAGCGTG1441sars034 TATGTTGGCTGCTATAATAAGCGTGCCTACTGGGTTCCTCGTGCTAGTGCTGATATTGGCTCAGGCCATA1486sars035 AGTGCTGATATTGGCTCAGGCCATACTGGCATTACTGGTGACAATGTGGAGACCTTGAATGAGGATCTCC1531sars036 GTGGAGACCTTGAATGAGGATCTCCTTGAGATACTGAGTCGTGAACGTGTTAACATTAACATTGTTGGCG1576sars037 CGTGTTAACATTAACATTGTTGGCGATTTTCATTTGAATGAAGAGGTTGCCATCATTTTGGCATCTTTCT1621sars038 GTTGCCATCATTTTGGCATCTTTCTCTGCTTCTACAAGTGCCTTTATTGACACTATAAAGAGTCTTGATT1666sars039 ATTGACACTATAAAGAGTCTTGATTACAAGTCTTTCAAAACCATTGTTGAGTCCTGCGGTAACTATAAAG1711sars040 GTTGAGTCCTGCGGTAACTATAAAGTTACCAAGGGAAAGCCCGTAAAAGGTGCTTGGAACATTGGACAAC1756sars041 AAAGGTGCTTGGAACATTGGACAACAGAGATCAGTTTTAACACCACTGTGTGGTTTTCCCTCACAGGCTG1801sars042 CTGTGTGGTTTTCCCTCACAGGCTGCTGGTGTTATCAGATCAATTTTTGCGCGCACACTTGATGCAGCAA1846sars043 TTTGCGCGCACACTTGATGCAGCAAACCACTCAATTCCTGATTTGCAAAGAGCAGCTGTCACCATACTTG1891sars044 CAAAGAGCAGCTGTCACCATACTTGATGGTATTTCTGAACAGTCATTACGTCTTGTCGACGCCATGGTTT1936sars045 TTACGTCTTGTCGACGCCATGGTTTATACTTCAGACCTGCTCACCAACAGTGTCATTATTATGGCATATG1981sars046 AACAGTGTCATTATTATGGCATATGTAACTGGTGGTCTTGTACAACAGACTTCTCAGTGGTTGTCTAATC2026sars047 CAGACTTCTCAGTGGTTGTCTAATCTTTTGGGCACTACTGTTGAAAAACTCAGGCCTATCTTTGAATGGA2071sars048 AAACTCAGGCCTATCTTTGAATGGATTGAGGCGAAACTTAGTGCAGGAGTTGAATTTCTCAAGGATGCTT2116sars049 GGAGTTGAATTTCTCAAGGATGCTTGGGAGATTCTCAAATTTCTCATTACAGGTGTTTTTGACATCGTCA2161sars050 ATTACAGGTGTTTTTGACATCGTCAAGGGTCAAATACAGGTTGCTTCAGATAACATCAAGGATTGTGTAA2206sars051 TCAGATAACATCAAGGATTGTGTAAAATGCTTCATTGATGTTGTTAACAAGGCACTCGAAATGTGCATTG2251sars052 AACAAGGCACTCGAAATGTGCATTGATCAAGTCACTATCGCTGGCGCAAAGTTGCGATCACTCAACTTAG2296sars053 GCAAAGTTGCGATCACTCAACTTAGGTGAAGTCTTCATCGCTCAAAGCAAGGGACTTTACCGTCAGTGTA2341sars054 AGCAAGGGACTTTACCGTCAGTGTATACGTGGCAAGGAGCAGCTGCAACTACTCATGCCTCTTAAGGCAC2386sars055 CAACTACTCATGCCTCTTAAGGCACCAAAAGAAGTAACCTTTCTTGAAGGTGATTCACATGACACAGTAC2431sars056 GAAGGTGATTCACATGACACAGTACTTACCTCTGAGGAGGTTGTTCTCAAGAACGGTGAACTCGAAGCAC2476sars057 CTCAAGAACGGTGAACTCGAAGCACTCGAGACGCCCGTTGATAGCTTCACAAATGGAGCTATCCTCGGCA2521sars058 TTCACAAATGGAGCTATCGTCGGCACACCAGTCTGTGTAAATGGCCTCATGCTCTTAGAGATTAAGGACA2566sars059 CTCATGCTCTTAGAGATTAAGGACAAAGAACAATACTGCGCATTGTCTCCTGGTTTACTGGCTACAAACA2611sars060 TCTCCTGGTTTACTGGCTACAAACAATGTCTTTCGCTTAAAAGGGGGTGCACCAATTAAAGGTGTAACCT2656sars061 GGTGCACCAATTAAAGGTGTAACCTTTGGAGAAGATACTGTTTGGGAAGTTCAAGGTTACAAGAATGTGA2701sars062 GAAGTTCAAGGTTACAAGAATGTGAGAATCACATTTGAGCTTGATGAACGTGTTGACAAAGTGCTTAATG2746sars063 GAACGTGTTGACAAAGTGCTTAATGAAAAGTGCTCTGTCTACACTGTTGAATCCGGTACCGAAGTTACTG2791sars064 GTTGAATCCGGTACCGAAGTTACTGAGTTTGCATGTGTTGTAGCAGAGGCTGTTGTGAAGACTTTACAAC2836sars065 GAGGCTGTTGTGAAGACTTTACAACCAGTTTCTGATCTCCTTACCAACATGGGTATTGATCTTGATGAGT2881sars066 AACATGGGTATTGATCTTGATGAGTGGAGTGTAGCTACATTCTACTTATTTGATGATGCTGGTGAAGAAA2926sars067 TTATTTGATGATGCTGGTGAAGAAAACTTTTCATCACGTATGTATTGTTCCTTTTACCCTCCAGATGAGG2971sars068 TGTTCCTTTTACCCTCCAGATGAGGAAGAAGAGGACGATGCAGAGTGTGAGGAAGAAGAAATTGATGAAA3016sars069 TGTGAGGAAGAAGAAATTGATGAAACCTGTGAACATGAGTACGGTACAGAGGATGATTATCAAGGTCTCC3061sars070 ACAGAGGATGATTATCAAGGTCTCCCTCTGGAATTTGGTGCCTCAGCTGAAACAGTTCGAGTTGAGGAAG3106sars071 GCTGAAACAGTTCGAGTTGAGGAAGAAGAAGAGGAAGACTGGCTGGATGATACTACTGAGCAATCAGAGA3151sars072 GATGATACTACTGAGCAATCAGAGATTGAGCCAGAACCAGAACCTACACCTGAAGAACCAGTTAATCAGT3196sars073 ACACCTGAAGAACCAGTTAATCAGTTTACTGGTTATTTAAAACTTACTGACAATGTTGCCATTAAATGTG3241sars074 ACTGACAATGTTGCCATTAAATGTGTTGACATCGTTAAGGAGGCACAAAGTGCTAATCCTATGGTGATTG3286sars075 CAAAGTGCTAATCCTATGGTGATTGTAAATGCTGCTAACATACACCTGAAACATGGTGGTGGTGTAGCAG3331sars076 CTGAAACATGGTGGTGGTGTAGCAGGTGCACTCAACAAGGCAACCAATGGTGCCATGCAAAAGGAGAGTG3376sars077 AATGGTGCCATGCAAAAGGAGAGTGATGATTACATTAAGCTAAATGGCCCTCTTACAGTAGGAGGGTCTT3421sars078 GGCCCTCTTACAGTAGGAGGGTCTTGTTTGCTTTCTGGACATAATCTTGCTAAGAAGTGTCTGCATGTTG3466sars079 CTTGCTAAGAAGTGTCTGCATGTTGTTGGACCTAACCTAAATGCAGGTGAGGACATCCAGCTTCTTAAGG3511sars080 GGTGAGGACATCCAGCTTCTTAAGGCAGCATATGAAAATTTCAATTCACAGGACATCTTACTTGCACCAT3556sars081 TCACAGGACATCTTACTTGCACCATTGTTGTCAGCAGGCATATTTGGTGCTAAACCACTTCAGTCTTTAC3601sars082 GGTGCTAAACCACTTCAGTCTTTACAAGTGTGCGTGCAGACGGTTCGTACACAGGTTTATATTGCAGTCA3646sars083 CGTACACAGGTTTATATTGCAGTCAATGACAAAGCTCTTTATGAGCAGGTTGTCATGGATTATCTTGATA3691sars084 CAGGTTGTCATGGATTATCTTGATAACCTGAAGCCTAGAGTGGAAGCACCTAAACAAGAGGAGCCACCAA3736sars085 GCACCTAAACAAGAGGAGCCACCAAACACAGAAGATTCCAAAACTGAGGAGAAATCTGTCGTACAGAAGC3781sars086 GAGGAGAAATCTGTCGTACAGAAGCCTGTCGATGTGAAGCCAAAAATTAAGGCCTGCATTGATGAGGTTA3826sars087 ATTAAGGCCTGCATTGATGAGGTTACCACAACACTGGAAGAAACTAAGTTTCTTACCAATAAGTTACTCT3871sars088 AAGTTTCTTACCAATAAGTTACTCTTGTTTGCTGATATCAATGGTAAGCTTTACCATGATTCTCAGAACA3916sars089 AAGCTTTACCATGATTCTCAGAACATGCTTAGAGGTGAAGATATGTCTTTCCTTGAGAAGGATGCACCTT3961sars090 TCTTTCCTTGAGAAGGATGCACCTTACATGGTAGGTGATGTTATCACTAGTGGTGATATCACTTGTGTTG4006sars091 ACTAGTGGTGATATCACTTGTGTTGTAATACCCTCCAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAGATGCTCTCAA4051sars092 GGTGGCACTACTGAGATGCTCTCAAGAGCTTTGAAGAAAGTGCCAGTTGATGAGTATATAACCACGTACC4096sars093 GTTGATGAGTATATAACCACGTACCCTGGACAAGGATGTGCTGGTTATACACTTGAGGAAGCTAAGACTG4141sars094 TATACACTTGAGGAAGCTAAGACTGCTCTTAAGAAATGCAAATCTGCATTTTATGTACTACCTTCAGAAG4186sars095 GCATTTTATGTACTACCTTCAGAAGCACCTAATGCTAAGGAAGAGATTCTAGGAACTGTATCCTGGAATT4231sars096 ATTCTAGGAACTGTATCCTGGAATTTGAGAGAAATGCTTGCTCATGCTGAAGAGACAAGAAAATTAATGC4276sars097 GCTGAAGAGACAAGAAAATTAATGCCTATATGCATGGATGTTAGAGCCATAATGGCAACCATCCAACGTA4321sars098 GCCATAATGGCAACCATCCAACGTAAGTATAAAGGAATTAAAATTCAAGAGGGCATCGTTGACTATGGTG4366sars099 CAAGAGGGCATCGTTGACTATGGTGTCCGATTCTTCTTTTATACTAGTAAAGAGCCTGTAGCTTCTATTA4411sars100 AGTAAAGAGCCTGTAGCTTCTATTATTACGAAGCTGAACTCTCTAAATGAGCCGCTTGTCACAATGCCAA4456sars101 AATGAGCCGCTTGTCACAATGCCAATTGGTTATGTGACACATGGTTTTAATCTTGAAGAGGCTGCGCGCT4501sars102 TTTAATCTTGAAGAGGCTGCGCGCTGTATGCGTTCTCTTAAAGCTCCTGCCGTAGTGTCAGTATCATCAC4546sars103 CCTGCCGTAGTGTCAGTATCATCACCAGATGCTGTTACTACATATAATGGATACCTCACTTCGTCATCAA4591sars104 AATGGATACCTCACTTCGTCATCAAAGACATCTGAGGAGCACTTTGTAGAAACAGTTTCTTTGGCTGGCT4636sars105 GTAGAAACAGTTTCTTTGGCTGGCTCTTACAGAGATTGGTCCTATTCAGGACAGCGTACAGAGTTAGGTG4681sars106 TCAGGACAGCGTACAGAGTTAGGTGTTGAATTTCTTAAGCGTGGTGACAAAATTGTGTACCACACTCTGG4726sars107 GACAAAATTGTGTACCACACTCTGGAGAGCCCCGTCGAGTTTCATCTTGACGGTGAGGTTCTTTCACTTG4771sars108 CTTGACGGTGAGGTTCTTTCACTTGACAAACTAAAGAGTCTCTTATCCCTGCGGGAGGTTAAGACTATAA4816sars109 TCCCTGCGGGAGGTTAAGACTATAAAAGTGTTCACAACTGTGGACAACACTAATCTCCACACACAGCTTG4861sars110 AACACTAATCTCCACACACAGCTTGTGGATATGTCTATGACATATGGACAGCAGTTTGGTCCAACATACT4906sars111 GGACAGCAGTTTGGTCCAACATACTTGGATGGTGCTGATGTTACAAAAATTAAACCTCATGTAAATCATG4951sars112 AAAATTAAACCTCATGTAAATCATGAGGGTAAGACTTTCTTTGTACTACCTAGTGATGACACACTACGTA4996sars113 CTACCTAGTGATGACACACTACGTAGTGAAGCTTTCGAGTACTACCATACTCTTGATGAGAGTTTTCTTG5041sars114 CATACTCTTGATGAGAGTTTTCTTGGTAGGTACATGTCTGCTTTAAACCACACAAAGAAATGGAAATTTC5086sars115 AACCACACAAAGAAATGGAAATTTCCTCAAGTTGGTGGTTTAACTTCAATTAAATGGGCTGATAACAATT5131sars116 TCAATTAAATGGGCTGATAACAATTGTTATTTGTCTAGTGTTTTATTAGCACTTCAACAGCTTGAAGTCA5176sars117 TTAGCACTTCAACAGCTTGAAGTCAAATTCAATGCACCAGCACTTCAAGAGGCTTATTATAGAGCCCGTG5221sars118 CAAGAGGCTTATTATAGAGCCCGTGCTGGTGATGCTGCTAACTTTTGTGCACTCATACTCGCTTACAGTA5266sars119 TGTGCACTCATACTCGCTTACAGTAATAAAACTGTTGGCGAGCTTGGTGATGTCAGAGAAACTATGACCC5311sars120 GGTGATGTCAGAGAAACTATGACCCATCTTCTACAGCATGCTAATTTGGAATCTGCAAAGCGAGTTCTTA5356sars121 TTGGAATCTGCAAAGCGAGTTCTTAATGTGGTGTGTAAACATTGTGGTCAGAAAACTACTACCTTAACGG5401sars122 GGTCAGAAAACTACTACCTTAACGGGTGTAGAAGCTGTGATGTATATGGGTACTCTATCTTATGATAATC5446sars123 ATGGGTACTCTATCTTATGATAATCTTAAGACAGGTGTTTCCATTCCATGTGTGTGTGGTCGTGATGCTA5491sars124 CCATGTGTGTGTGGTCGTGATGCTACACAATATCTAGTACAACAAGAGTCTTCTTTTGTTATGATGTCTG5536sars125 GAGTCTTCTTTTGTTATGATGTCTGCACCACCTGCTGAGTATAAATTACAGCAAGGTACATTCTTATGTG5581sars126 TTACAGCAAGGTACATTCTTATGTGCGAATGAGTACACTGGTAACTATCAGTGTGGTCATTACACTCATA5626sars127 TATCAGTGTGGTCATTACACTCATATAACTGCTAAGGAGACCCTCTATCGTATTGACGGAGCTCACCTTA5671sars128 TATCGTATTGACGGAGCTCACCTTACAAAGATGTCAGAGTACAAAGGACCAGTGACTGATGTTTTCTACA5716sars129 GGACCAGTGACTGATGTTTTCTACAAGGAAACATCTTACACTACAACCATCAAGCCTGTGTCGTATAAAC5761sars130 ACCATCAAGCCTGTGTCGTATAAACTCGATGGAGTTACTTACACAGAGATTGAACCAAAATTGGATGGGT5806sars131 GAGATTGAACCAAAATTGGATGGGTATTATAAAAAGGATAATGCTTACTATACAGAGCAGCCTATAGACC5851sars132 TACTATACAGAGCAGCCTATAGACCTTGTACCAACTCAACCATTACCAAATGCGAGTTTTGATAATTTCA5896sars133 CCAAATGCGAGTTTTGATAATTTCAAACTCACATGTTCTAACACAAAATTTGCTGATGATTTAAATCAAA5941sars134 AAATTTGCTGATGATTTAAATCAAATGACAGGCTTCACAAAGCCAGCTTCACGAGAGCTATCTGTCACAT5986sars135 GCTTCACGAGAGCTATCTGTCACATTCTTCCCAGACTTGAATGGCGATGTAGTGGCTATTGACTATAGAC6031sars136 GATGTAGTGGCTATTGACTATAGACACTATTCAGCGAGTTTCAAGAAAGGTGCTAAATTACTGCATAAGC6076sars137 AAAGGTGCTAAATTACTGCATAAGCCAATTGTTTGGCACATTAACCAGGCTACAACCAAGACAACGTTCA6121sars138 CAGGCTACAACCAAGACAACGTTCAAACCAAACACTTGGTGTTTACGTTGTCTTTGGAGTACAAAGCCAG6166sars139 CGTTGTCTTTGGAGTACAAAGCCAGTAGATACTTCAAATTCATTTGAAGTTCTGGCAGTAGAAGACACAC6211sars140 GAAGTTCTGGCAGTAGAAGACACACAAGGAATGGACAATCTTGCTTGTGAAAGTCAACAACCCACCTCTG6256sars141 TGTGAAAGTCAACAACCCACCTCTGAAGAAGTAGTGGAAAATCCTACCATACAGAAGGAAGTCATAGAGT6301sars142 ACCATACAGAAGGAAGTCATAGAGTGTGACGTGAAAACTACCGAAGTTGTAGGCAATGTCATACTTAAAC6346sars143 GTTGTAGGCAATGTCATACTTAAACCATCAGATGAAGGTGTTAAAGTAACACAAGAGTTAGGTCATGAGG6391sars144 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GTGCACTCTCAGGTATTGCTGCTGAACAGGATCGCAACACACGTGAAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAAT23716sars529 AAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAATGTACAAAACCCCAACTTTGAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTC23761sars530 AATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCTGACCCTCTAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTAT23806sars531 TAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTATTGAGGACTTGCTCTTTAATAAGGTGACACTCGCTGATGCTGGCTT23851sars532 AGGTGACACTCGCTGATGCTGGCTTCATGAAGCAATATGGCGAATGCCTAGGTGATATTAATGCTAGAGA23896sars533 GCCTAGGTGATATTAATGCTAGAGATCTCATTTGTGCGCAGAAGTTCAATGGACTTACAGTGTTGCCACC23941sars534 TCAATGGACTTACAGTGTTGCCACCTCTGCTCACTGATGATATGATTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGT23986sars535 TTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGTTAGTGGTACTGCCACTGCTGGATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGC24031sars536 GATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGCTCTTCAAATACCTTTTGCTATGCAAATGGCATATAGGTTCAATGG24076sars537 TGCAAATGGCATATAGGTTCAATGGCATTGGAGTTACCCAAAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAACAAAT24121sars538 TTCTCTATGAGAACCAAAAACAAATCGCCAACCAATTTAACAAGGCGATTAGTCAAATTCAAGAATCACT24166sars539 CGATTAGTCAAATTCAAGAATCACTTACAACAACATCAACTGCATTGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAA24211sars540 TGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAACCAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTC24256sars541 ACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCG24301sars542 GTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGAGGTACAAATTGACAGGTTAATTAC24346sars543 AGGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTAACACAACAACTAAT24391sars544 AAACCTATGTAACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAA24436sars545 CTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTG24481sars546 GACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAAGGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCA24526sars547 TGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTACATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAG24571sars548 TCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTTGTCATGAAGGCAAAGCATA24616sars549 CAATTTGTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTTGTGTTTAATGGCACTTCTTGGTT24661sars550 TTGTGTTTAATGGCACTTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGA24706sars551 TTTCTCCACAAATAATTACTACAGACAATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCAT24751sars552 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CGAAGTTTACTACCAGCTTGAGTCTACACAAATTACTACAGACACTGGTATTGAAAATGCTACATTCTTC25876sars577 TGGTATTGAAAATGCTACATTCTTCATCTTTAACAAGCTTGTTAAAGACCCACCGAATGTGCAAATACAC25921sars578 AGACCCACCGAATGTGCAAATACACACAATCGACGGCTCTTCAGGAGTTGCTAATCCAGCAATGGATCCA25966sars579 AGTTGCTAATCCAGCAATGGATCCAATTTATGATGAGCCGACGACGACTACTAGCGTGCCTTTGTAAGCA26011sars580 GACTACTAGCGTGCCTTTGTAAGCACAAGAAAGTGAGTACGAACTTATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAA26056sars581 TATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAAACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTC26101sars582 TAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTCACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGA26146sars583 ACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTTTAGTAAAA26191sars584 TATTGTTAACGTGAGTTTAGTAAAACCAACGGTTTACGTCTACTCGCGTGTTAAAAATCTGAACTCTTCT26236sars585 GCGTGTTAAAAATCTGAACTCTTCTGAAGGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAACGAACTAACTATTATTA26281sars586 GGTCTAAACGAACTAACTATTATTATTATTCTGTTTGGAACTTTAACATTGCTTATCATGGCAGACAACG26326sars587 ACATTGCTTATCATGGCAGACAACGGTACTATTACCGTTGAGGAGCTTAAACAACTCCTGGAACAATGGA26371sars588 CTTAAACAACTCCTGGAACAATGGAACCTAGTAATAGGTTTCCTATTCCTAGCCTGGATTATGTTACTAC26416sars589 TTCCTAGCCTGGATTATGTTACTACAATTTGCCTATTCTAATCGGAACAGGTTTTTGTACATAATAAAGC26461sars590 AACAGGTTTTTGTACATAATAAAGCTTGTTTTCCTCTGGCTCTTGTGGCCAGTAACACTTGCTTGTTTTG26506sars591 TGGCCAGTAACACTTGCTTGTTTTGTGCTTGCTGCTGTCTACAGAATTAATTGGGTGACTGGCGGGATTG26551sars592 ATTAATTGGGTGACTGGCGGGATTGCGATTGCAATGGCTTGTATTGTAGGCTTGATGTGGCTTAGCTACT26596sars593 GTAGGCTTGATGTGGCTTAGCTACTTCGTTGCTTCCTTCAGGCTGTTTGCTCGTACCCGCTCAATGTGGT26641sars594 TTTGCTCGTACCCGCTCAATGTGGTCATTCAACCCAGAAACAAACATTCTTCTCAATGTGCCTCTCCGGG26686sars595 ATTCTTCTCAATGTGCCTCTCCGGGGGACAATTGTGACCAGACCGCTCATGGAAAGTGAACTTGTCATTG26731sars596 CTCATGGAAAGTGAACTTGTCATTGGTGCTGTGATCATTCGTGGTCACTTGCGAATGGCCGGACACTCCC26776sars597 CACTTGCGAATGGCCGGACACTCCCTAGGGCGCTGTGACATTAAGGACCTGCCAAAAGAGATCACTGTGG26821sars598 GACCTGCCAAAAGAGATCACTGTGGCTACATCACGAACGCTTTCTTATTACAAATTAGGAGCGTCGCAGC26866sars599 TATTACAAATTAGGAGCGTCGCAGCGTGTAGGCACTGATTCAGGTTTTGCTGCATACAACCGCTACCGTA26911sars600 TTTGCTGCATACAACCGCTACCGTATTGGAAACTATAAATTAAATACAGACCACGCCGGTAGCAACGACA26956sars601 ACAGACCACGCCGGTAGCAACGACAATATTGCTTTGCTAGTACAGTAAGTGACAACAGATGTTTCATCTT27001sars602 TAAGTGACAACAGATGTTTCATCTTGTTGACTTCCAGGTTACAATAGCAGAGATATTGATTATCATTATG27046sars603 AGCAGAGATATTGATTATCATTATGAGGACTTTCAGGATTGCTATTTGGAATCTTGACGTTATAATAAGT27091sars604 TTGGAATCTTGACGTTATAATAAGTTCAATAGTGAGACAATTATTTAAGCCTCTAACTAAGAAGAATTAT27136sars605 TAAGCCTCTAACTAAGAAGAATTATTCGGAGTTAGATGATGAAGAACCTATGGAGTTAGATTATCCATAA27181sars606 ACCTATGGAGTTAGATTATCCATAAAACGAACATGAAAATTATTCTCTTCCTGACATTGATTGTATTTAC27226sars607 TCTTCCTGACATTGATTGTATTTACATCTTGCGAGCTATATCACTATCAGGAGTGTGTTAGAGGTACGAC27271sars608 ATCAGGAGTGTGTTAGAGGTACGACTGTACTACTAAAAGAACCTTGCCCATCAGGAACATACGAGGGCAA27316sars609 GCCCATCAGGAACATACGAGGGCAATTCACCATTTCACCCTCTTGCTGACAATAAATTTGCACTAACTTG27361sars610 CTGACAATAAATTTGCACTAACTTGCACTAGCACACACTTTGCTTTTGCTTGTGCTGACGGTACTCGACA27406sars611 TTGCTTGTGCTGACGGTACTCGACATACCTATCAGCTGCGTGCAAGATCAGTTTCACCAAAACTTTTCAT27451sars612 GATCAGTTTCACCAAAACTTTTCATCAGACAAGAGGAGGTTCAACAAGAGCTCTACTCGCCACTTTTTCT27496sars613 AAGAGCTCTACTCGCCACTTTTTCTCATTGTTGCTGCTCTAGTATTTTTAATACTTTGCTTCACCATTAA27541sars614 TTTTAATACTTTGCTTCACCATTAAGAGAAAGACAGAATGAATGAGCTCACTTTAATTGACTTCTATTTG27586sars615 GCTCACTTTAATTGACTTCTATTTGTGCTTTTTAGCCTTTCTGCTATTCCTTGTTTTAATAATGCTTATT27631sars616 ATTCCTTGTTTTAATAATGCTTATTATATTTTGGTTTTCACTCGAAATCCAGGATCTAGAAGAACCTTGT27676sars617 AATCCAGGATCTAGAAGAACCTTGTACCAAAGTCTAAACGAACATGAAACTTCTCATTGTTTTGACTTGT27721sars618 GAAACTTCTCATTGTTTTGACTTGTATTTCTCTATGCAGTTGCATATGCACTGTAGTACAGCGCTGTGCA27766sars619 ATGCACTGTAGTACAGCGCTGTGCATCTAATAAACCTCATGTGCTTGAAGATCCTTGTAAGGTACAACAC27811sars620 TGAAGATCCTTGTAAGGTACAACACTAGGGGTAATACTTATAGCACTGCTTGGCTTTGTGCTCTAGGAAA27856sars621 CTGCTTGGCTTTGTGCTCTAGGAAAGGTTTTACCTTTTCATAGATGGCACACTATGGTTCAAACATGCAC27901sars622 GGCACACTATGGTTCAAACATGCACACCTAATGTTACTATCAACTGTCAAGATCCAGCTGGTGGTGCGCT27946sars623 GTCAAGATCCAGCTGGTGGTGCGCTTATAGCTAGGTGTTGGTACCTTCATGAAGGTCACCAAACTGCTGC27991sars624 TTCATGAAGGTCACCAAACTGCTGCATTTAGAGACGTACTTGTTGTTTTAAATAAACGAACAAATTAAAA28036sars625 TTTTAAATAAACGAACAAATTAAAATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCA28081sars626 TCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGACAATAACCAGAATG28126sars627 GATTCAACTGACAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTT28171sars628 CCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATG28216sars629 TGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCA28261sars630 CCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAG28306sars631 GACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCA28351sars632 GGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTT28396sars633 TACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAA28441sars634 AAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCA28486sars635 CCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAA28531sars636 ACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCA28576sars637 TACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAA28621sars638 TCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAA28666sars639 AGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAG28711sars640 ACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAAC28756sars641 AGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCAT28801sars642 ACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACAAAACAGTACAACG28846sars643 CGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAA28891sars644 CGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAAC28936sars645 ATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCT28981sars646 TTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACAT29026sars647 ATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCAC29071sars648 ATTAAATTGGATGACAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCAT29116sars649 CTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAA29161sars650 GAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAGACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGC29206sars651 TTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCA29251sars652 GCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTC29296sars653 AGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCATAAACACTCATGATGACCACACAAGGCAGATGGGCTATGT29341sars654 ACCACACAAGGCAGATGGGCTATGTAAACGTTTTCGCAATTCCGTTTACGATACATAGTCTACTCTTGTG29386sars655 TTACGATACATAGTCTACTCTTGTGCAGAATGAATTCTCGTAACTAAACAGCACAAGTAGGTTTAGTTAA29431sars656 AAACAGCACAAGTAGGTTTAGTTAACTTTAATCTCACATAGCAATCTTTAATCAATGTGTAACATTAGGG29476sars657 CTTTAATCAATGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCATCGAGGCCACGCGGAGT29521sars658 CATTTTCATCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGGGTACAGTGAATAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATAT29566sars659 TAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCC29611sars660 AATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAAAAAAAA29656另外，選取四條煙草花葉病毒特異性探針作為陰性對(duì)照探針，序列來(lái)源于煙草花葉病毒基因組(GenBank序列號(hào)NC_001367)。如表2所示表2 煙草花葉病毒特異性探針序列序號(hào) 序列 起始位點(diǎn)tmv1 ATATTCTTAAGTATGTGTGCAAAACTTACTTCCCGGCCTCTAATAGAGAGGTTTACATGAAGGAGTTTTT 895tmv2 TCTGCTGCGGTGTCGAATCTCGTCAAGATCCTCAAAGATACAGCTGCTATTGACCTTGAAACCCGTCAAA 2220tmv3 CTTCTTAAAGGAGTTAAGCTTATTGATAGTGGATACGTCTGTTTAGCCGGTTTGGTCGTCACGGGCGAGT 5065tmv4 TGACAATTGCAGAGGAGGTGTGAGCGTGTGTCTGGTGGACAAAAGGATGGAAAGAGCCGACGAGGCCACT 5145我們還選取了豬傳染性胃腸炎病毒以及禽傳染性氣管炎病毒特異性探針序列共12條探針，序列見表3表3 豬傳染性胃腸炎病毒以及禽傳染性氣管炎病毒特異性探針序列TGEV1CTCTTATGGTGGTGCTTCAGTTTGTATTTATTGCAGATGCCATGTTGAACATCCTGCTATTGATGGATTATGEV1_rc TAATCCATCAATAGCAGGATGTTCAACATGGCATCTGCAATAAATACAAACTGAAGCACCACCATAAGAGTGEV2AGGTGTTATAACACTTGACAACCAAGATCTTAATGGCAATTTCTACGATTTCGGCGATTTCGTGAAGACTTGEV2_rc AGTCTTCACGAAATCGCCGAAATCGTAGAAATTGCCATTAAGATCTTGGTTGTCAAGTGTTATAACACCTTGEV3GATAATGGTTGTTTGATGGGATGGGACTATCCTAAGTGTGACCGTGCTTTACCTAATATGATTAGAATGGTGEV3_rc CCATTCTAATCATATTAGGTAAAGCACGGTCACACTTAGGATAGTCCCATCCCATCAAACAACCATTATCAIBV1AACACTAGAAATGCTTCTGTAGTTATTGGAACAACCAAGTTTTATGGCGGTTGGGACAACATGTTGAGAAAIBV1_rc TTCTCAACATGTTGTCCCAACCGCCATAAAACTTGGTTGTTCCAATAACTACAGAAGCATTTCTAGTGTTAIBV2TTATGGGTTGGGATTATCCTAAGTGTGATAGAGCAATGCCTAATTTGTTGCGTATAGCAGCATCCTTAGTAIBV2_rc ACTAAGGATGCTGCTATACGCAACAAATTAGGCATTGCTCTATCACACTTAGGATAATCCCAACCCATAAAIBV3TATTTATGTTAAACCTGGTGGCACTAGCAGTGGTGATGCTACTACTGCTTATGCAAACAGTGTTTTTAACAIBV3_rc GTTAAAAACACTGTTTGCATAAGCAGTAGTAGCATCACCACTGCTAGTGCCACCAGGTTTAACATAAATA我們還設(shè)計(jì)了針對(duì)香港公布的CUHK-W1-S的SARS全序列的特異性探針序列共3條探針，序列見表4表4 CUHK-W1-S的SARS的特異性探針序列CUHK-W1-S-210 TACTATTAATCATACGTTTGGCAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCACAGAGCUHK-W1-S-710 CCTTTTCACCTGCTCAAGACATTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTTAAAGCCAACCUHK-W1-S-1710 ATTAGACATTTCACCTTGCTCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGGAACAAATGCTTCATCTGAA當(dāng)然不局限于CUHK-W1-S的SARS還包括了根據(jù)其它最新公布的SARS序列所設(shè)計(jì)的特異性探針。
同時(shí)選取來(lái)自人基因組序列的40-100條寡核苷酸單個(gè)或者成組分布排列作為芯片掃描的對(duì)照。
SARS冠狀病毒TOR2株660個(gè)探針，煙草花葉病毒4個(gè)探針，豬傳染性胃腸炎病毒以及禽傳染性氣管炎病毒12條探針，CUHK-W1-S的SARS全序列探針序列共3條探針，最后，上述總共679個(gè)探針。
實(shí)施例2 芯片點(diǎn)制將上述679個(gè)探針約計(jì)為680個(gè)探針進(jìn)行矩陣設(shè)計(jì)。按679條探針進(jìn)行合成，合成產(chǎn)物溶于點(diǎn)樣緩沖液(3×SSC)，終濃度為800ng/ul。通過(guò)基因芯片點(diǎn)樣儀將探針溶液點(diǎn)于醛基修飾的玻璃片基上，隨后在濕度為60％的環(huán)境中進(jìn)行水合30min，以使探針的氨基與片基的醛基發(fā)生連接反應(yīng)，從而使探針固定于片基之上。
點(diǎn)制規(guī)則為每條探針重復(fù)三個(gè)點(diǎn)，分為5個(gè)矩陣，每個(gè)矩陣136條探針，每個(gè)矩陣包括38個(gè)陽(yáng)性坐標(biāo)點(diǎn)，形成25列×14行的點(diǎn)陣。如說(shuō)明書附圖中圖1所示，圖1為SARS冠狀病毒全基因組芯片點(diǎn)樣示意圖，每組三聯(lián)點(diǎn)為一條探針。圖中的A所示的灰色點(diǎn)為陽(yáng)性坐標(biāo)點(diǎn)，B所示的黑色三聯(lián)點(diǎn)為檢測(cè)探針。實(shí)施例3 樣本處理與標(biāo)記對(duì)于可能含有SARS冠狀病毒的待測(cè)樣本，通過(guò)Trizol試劑應(yīng)用常規(guī)方法提取總體RNA，用5’端帶有特異性末端的九堿基隨機(jī)引物(GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN)進(jìn)行隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄，然后利用特異性末端(GTTTCCCAGTCACGATC)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，在擴(kuò)增的過(guò)程中摻入Cy3或Cy5標(biāo)記的dCTP以使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有熒光信號(hào)。
操作流程如下RT(20ul體系)，1ul隨機(jī)引物(GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN，100pmol/ul)2ulRNA模板(1-2ug總體RNA)1ul dNTP(10mM)8ul DEPC-ddH2O混勻，70℃5min，迅速冰浴，快速離心加入4ul5*第一鏈合成Buffer2ul0.1M DTT1ul RNA酶抑制劑(40U/ul)25℃5min，加入1ul反轉(zhuǎn)錄酶，混勻，25℃10min，42℃1h，70℃ 15min終止。
PCRA(20ul體系)RT產(chǎn)物1ul10*PCR Buffer 2ul隨機(jī)引物1ul(GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN，100pmol/ul)dNTP(10mM)0.6ulddH2O 14.4ulTaq(5U/ul)1ul95 5min-94 1min-30 5min-72 3min-5cycles-72 5minB(50ul體系)PCR-A產(chǎn)物5ul10*PCR Buffer 5ul特異引物2ul(GTTTCCCAGTCACGATC，100pmol/ul)dNTP(10mM)1ulCy3/5-dCTP(1mM)1ulddH2O 34ulTaq(5U/ul)2ul95 5min-94 50s-40 1min-50 1min-72 1min-30cycles-72 5min實(shí)施例4 芯片雜交將芯片進(jìn)行預(yù)處理，即分別用0.5％SDS和去離子水漂洗芯片，晾干備用。
將標(biāo)記好的50ul待測(cè)樣品擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行冷凍真空干燥，用1×雜交緩沖液20ul重新溶解，95℃變性5min，迅速冰浴，取20ul雜交液滴加于芯片表面，并以蓋玻片覆蓋，37℃溫浴1小時(shí)后，分別用0.5％SDS和去離子水漂洗芯片5min，晾干后通過(guò)基因芯片掃描儀掃描芯片，并利用分析軟件計(jì)算各條探針的信號(hào)值與分析陰陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例5 結(jié)果分析經(jīng)過(guò)采集SARS冠狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株(臨床病人的血清及呼吸道分泌物樣品)以及其他與SARS冠狀病毒具有同源性的冠狀病毒，包括感染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus)、牛冠狀病毒(Bovine coronavirus)等(病毒標(biāo)準(zhǔn)品)，采用正常人血清及呼吸道分泌物樣品作為陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)以上技術(shù)路線進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果為1、雜交結(jié)果中陰性對(duì)照探針均呈現(xiàn)陰性信號(hào)；2、標(biāo)準(zhǔn)毒株雜交結(jié)果中SARS冠狀病毒檢測(cè)探針中陽(yáng)性率為83％-92％；3、其他與SARS冠狀病毒相關(guān)的冠狀病毒雜交結(jié)果中SARS冠狀病毒檢測(cè)探針中陽(yáng)性率為37％-58％；4、陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)象雜交結(jié)果中SARS冠狀病毒檢測(cè)探針中陽(yáng)性率為1％-16％。
通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)得到雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，即在陰性探針?lè)磻?yīng)呈陰性的前提下，80％以上檢測(cè)探針為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)可判定待測(cè)樣品帶有SARS病毒；30％-80％檢測(cè)探針為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)可判定待測(cè)樣品帶有與SARS病毒相關(guān)的病毒；30％以下檢測(cè)探針為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)可判定待測(cè)樣品不帶有與SARS病毒相關(guān)的病毒。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明描述了一種基因芯片，其特征是固定在基片上的探針矩陣覆蓋了SARS冠狀病毒的全基因組序列。
2.權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒的全基因組序列是指GenBank已公布的SARS冠狀病毒毒株或亞型的全基因組序列。
3.權(quán)利要求2中所述的SARS冠狀病毒毒株或亞型包括SARS coronavirus TOR2(GenBank序列號(hào)NC 004718/AY274119)，SARS coronavirus HKU-39849(GenBank序列號(hào)AY278491)，SARS coronavirus CUHK-WI(GenBank序列號(hào)AY278554)，SARScoronavirus Urbani(GenBank序列號(hào)AY278741)，SARS coronavirus BJ01(GenBank序列號(hào)AY278488)，SARS coronavirus BJ02(GenBank序列號(hào)AY278487)，SARScoronavirus BJ03(GenBank序列號(hào)AY278490)，SARS coronavirus BJ04(GenBank序列號(hào)AY279354)，SARS coronavirus GZ01(GenBank序列號(hào)AY278489)。
4.權(quán)利要求1所述的基因芯片上的探針特征是從SARS冠狀病毒全基因組中的每40-80個(gè)堿基序列作為一個(gè)探針序列，相鄰探針序列重復(fù)5-30個(gè)堿基。
5.權(quán)利要求1所述的基因芯片上的探針特征特別是指以70個(gè)堿基序列作為一個(gè)探針序列，相鄰探針序列重復(fù)25個(gè)堿基的模式。
6.權(quán)利要求1所述的基因芯片的用途之一是用于檢測(cè)SARS冠狀病毒。
7.權(quán)利要求6所述的檢測(cè)對(duì)象可以包括來(lái)自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動(dòng)植物樣品、食品水源樣品以及水環(huán)境和大氣環(huán)境樣品等等。
8.權(quán)利要求1所述的基因芯片的用途之二是用于監(jiān)測(cè)SARS冠狀病毒的變異和亞型。
9.權(quán)利要求8所述的監(jiān)測(cè)對(duì)象可以包括來(lái)自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動(dòng)植物樣品、食品水源樣品以及水環(huán)境和大氣環(huán)境樣品等等。
10.權(quán)利要求1所述的基因芯片的用途之三是用于鑒別SARS冠狀病毒和其它冠狀病毒。
11.權(quán)利要求10所述的鑒別對(duì)象可以包括來(lái)自人體的血液及分泌物等臨床樣品、動(dòng)植物樣品、食品水源樣品以及水環(huán)境和大氣環(huán)境樣品等等。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于急性傳染性疾病SARS相關(guān)冠狀病毒診斷的全基因組基因芯片，并提供了用于診斷其它有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的動(dòng)物冠狀病毒基因芯片的高檢出率的新引物。該全基因組基因芯片包括檢測(cè)監(jiān)控系統(tǒng)(A)和疾病診斷系統(tǒng)(B)兩個(gè)系統(tǒng)，可準(zhǔn)確、快速檢測(cè)SARS相關(guān)冠狀病毒，并設(shè)有檢測(cè)監(jiān)控系統(tǒng)，診斷時(shí)間更短，且大大提高診斷準(zhǔn)確性。本發(fā)明的SARS冠狀病毒全基因組芯片尤其適用于檢疫局的生物體檢測(cè)、醫(yī)院臨床樣本，生物環(huán)境病毒污染監(jiān)控、病人出院后疾病的傳播及人群中SARS冠狀病毒基因組水平的微小變化規(guī)律及基因多樣性數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，特別對(duì)追蹤SARS冠狀病毒的動(dòng)物來(lái)源都將具有十分深遠(yuǎn)的重要意義。本發(fā)明特別應(yīng)用于診斷領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1450173SQ0312295
公開日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2003年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者吳小岳, 馬鑫, 任魯風(fēng), 董小巖 申請(qǐng)人:本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有限公司