一種用于快速提取dna的磁性納米粒子的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于快速提取DNA的磁性納米粒子的制備方法。
【背景技術】
[0002]隨著人類基因組計劃的完成，當代生物學、醫(yī)學等已深入到分子水平，對所利用的進行高效分離、富集、提取、轉載的DNA生物大分子的需求也日益提高。然而目前常用的DNA提取純化方法都因存在自身缺陷而無法滿足人們進行深入實驗的要求。酚/氯仿抽提法曾經(jīng)是分子生物學中經(jīng)典的提取DNA方法，但由于酚/氯仿對人體的巨大毒害作用和對環(huán)境的強烈污染，在提倡綠色環(huán)保的今天將會大大局限其的應用范圍。時市場上的DNA抽提試劑盒由于操作步驟比較復雜、原料需要預處理、且原料自身理化性能不強造成產(chǎn)率不高等而無法滿足人們的要求。
[0003]四氧化三鐵磁性納米粒子毒性低，具有磁響應性，當粒徑足夠小時，具有超順磁性，即在外加磁場中有較強的磁性，撤離磁場時，磁性很快消失，剩磁為零，不會被永久磁化。
[0004]經(jīng)PAA包覆的四氧化三鐵磁性納米粒子，可以使其既具有磁性和水溶性，又具有表面活性基團，能進一步和細胞、酶、蛋白質、抗體及核酸等多種生物分子偶聯(lián)。在外加磁場的作用下，磁性納米粒子能夠很方便地和底液分離，具有操作簡便和分離效率高的優(yōu)點。此夕卜，PAA四氧化三鐵磁性納米粒子具有大的比表面積，為修飾多種高密度分子探針提供了基礎，在細胞分離、蛋白質純化及DNA分離檢測等領域顯示出廣闊的應用前景。
[0005]總的來說，磁性納米粒子的制備方法可以分為物理法、生物法和化學法。其中物理法以機械球磨法為主要代表，球磨法是將微米或亞微米的粒子進行長時間研磨，然后分散到油基介質中而得，這種制備方法得到的粒子的粒徑分布比較寬，同時這種制備方法所消耗的時間也比較長。磁性納米粒子的生物制備法主要是指磁性納米粒子廣泛地存在于各種生物體如細菌，鴿子等體內，利用生物法制備的粒子粒徑比較均一且形貌規(guī)則，缺點在于細菌培養(yǎng)較為困難，粒子提取的過程也較為繁瑣。所以目前來說，對于研宄磁性納米粒子的合成主要還限于化學法制備的磁性納米粒子，磁性納米材料的化學合成法又可以分為均相制備法和非均相制備法，其中均相制備法包括共沉淀法和高溫分解法，非均相制備方法有微乳液法、溶膠-凝膠法、超聲化學法、激光分解法和電化學沉積法等。
[0006]本發(fā)明采用高溫分解法研制粒徑均一、磁響應性強的生物相容性PAA四氧化三鐵磁性納米粒子，應用于細胞DNA的提取純化。
[0007]傳統(tǒng)的DNA分離純化方法不僅需接觸多種有機溶劑和有毒試劑，而且步驟繁雜難以控制。PAA四氧化三鐵磁性納米粒子可以通過其表面羧基與DNA分子結合，再用緩沖液洗脫即可得到純化率較高的DNA分子。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提出一種用于快速提取DNA的磁性納米粒子的制備方法。
[0009]為達此目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0010]一種用于快速提取DNA的磁性納米粒子的制備方法，其特征在于包括如下步驟:
[0011](I)、制備納米四氧化三鐵膠體，將二氯化鐵和三三氯化鐵按2:1的摩爾比溶于水中，攪拌條件下緩慢滴加濃度為1% -10%的氨水至有絮狀黑色沉淀出現(xiàn)，直到PH為10?12，靜置24-48小時，過濾，用去離子水洗滌至PH= 7，將所得沉淀烘干待用；
[0012](2)、將PAA溶于二甘醇DEG中，配置成0.1-10M濃度的溶液，在該溶液中加入步驟(I)獲得的沉淀，攪拌的混合溶液，所述沉淀的加入量以混合溶液的重量基準為1-10% ;混合溶液在氮氣保護下油浴220°c加熱回流2h后，繼續(xù)220°C加熱回流反應2h，得到黑色粘稠的膠體液，終止反應，靜置冷卻，得反應液；
[0013](3)、將步驟⑵獲得的反應液置于離心管中，加入5倍反應液體積的無水乙醇，SOOOrpm離心5min，重復洗滌3次，沉淀用去離子水洗滌2次，分散于反應液相等體積的去離子水中；
[0014](4)用0.22 μπι膜過濾，制得聚丙烯酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子。
[0015]制備得到的PAA包覆四氧化三鐵磁性納米粒子的應用，用于細胞DNA的分離純化，步驟如下:
[0016](I)裂解組織或細胞:稱取適量組織或細胞，加入適量抽提裂解液于冰上快速磨碎成組織液或細胞液后裂解3-5小時；
[0017](2)離心后的細胞加 5 μ L細胞裂解液(3Μ NaCl、5M尿素Urea、40g/LTritonX_100、1mM 乙二胺四乙酸 EDTA、pH6.5 的 25mM Tris-HCl)混勻，加 25 μ g/μ L 的蛋白酶 K 10 μ L及40 μ g/ μ L的RNA酶5 μ L，37°C孵育30min，加入18mg/mL的PAA包覆四氧化三鐵磁性納米粒子10 μ L，靜置2min ；
[0018]紫外測得0D260/0D280的比值，并取2 μ L瓊脂糖凝膠電泳
[0019]PAA四氧化三鐵磁性納米粒子用于細胞DNA的提取純化，減少有機溶劑的使用，與傳統(tǒng)的DNA分離方法相比克服了接觸有毒試劑、步驟復雜、費時、費力等缺點。
[0020]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了一種高溫分解法制備PAA四氧化三鐵磁性納米粒子，制備的磁性納米粒子用于細胞DNA高效提取純化，大大提高了提取率，操作更加簡便。建立在磁性納米粒子基礎上的DNA純化方法無論是分離效率還是DNA收率都不遜于傳統(tǒng)方法。
【具體實施方式】
[0021]實施例1
[0022]一種用于快速提取DNA的磁性納米粒子的制備方法，其特征在于包括如下步驟:
[0023](I)、制備納米四氧化三鐵膠體，將二氯化鐵和三三氯化鐵按2:1的摩爾比溶于水中，攪拌條件下緩慢滴加濃度為10%的氨水至有絮狀黑色沉淀出現(xiàn)，直到PH為12，靜置48小時，過濾，用去離子水洗滌至PH = 7，將所得沉淀烘干待用；
[0024](2)、將PAA溶于二甘醇DEG中，配置成1M濃度的溶液，在該溶液中加入步驟(I)獲得的沉淀，攪拌的混合溶液，所述沉淀的加入量以混合溶液的重量基準為10% ;混合溶液在氮氣保護下油浴220°c加熱回流2h后，繼續(xù)220°C加熱回流反應2h，得到黑色粘稠的膠體液，終止反應，靜置冷卻，得反應液；
[0025](3)、將步驟(2)獲得的反應液置于離心管中，加入5倍反應液體積的無水乙醇，SOOOrpm離心5min，重復洗滌3次，沉淀用去離子水洗滌2次，分散于反應液相等體積的去離子水中；
[0026](4)用0.22 μπι膜過濾，制得聚丙烯酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子。
[0027]實施例2
[0028](I)、制備納米四氧化三鐵膠體，將二氯化鐵和三三氯化鐵按2:1的摩爾比溶于水中，攪拌條件下緩慢滴加濃度為I %的氨水至有絮狀黑色沉淀出現(xiàn)，直到PH為12，靜置24小時，過濾，用去離子水洗滌至PH = 7，將所得沉淀烘干待用；
[0029](2)、將PAA溶于二甘醇DEG中，配置成1M濃度的溶液，在該溶液中加入步驟(I)獲得的沉淀，攪拌的混合溶液，所述沉淀的加入量以混合溶液的重量基準為1% ;混合溶液在氮氣保護下油浴220°C加熱回流2h后，繼續(xù)220°C加熱回流反應2h，得到黑色粘稠的膠體液，終止反應，靜置冷卻，得反應液；
[0030](3)、將步驟(2)獲得的反應液置于離心管中，加入5倍反應液體積的無水乙醇，SOOOrpm離心5min，重復洗滌3次，沉淀用去離子水洗滌2次，分散于反應液相等體積的去離子水中；
[0031](4)用0.22 μπι膜過濾，制得聚丙烯酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子。
[0032]實施例3
[0033](I)、制備納米四氧化三鐵膠體，將二氯化鐵和三三氯化鐵按2:1的摩爾比溶于水中，攪拌條件下緩慢滴加濃度為5%的氨水至有絮狀黑色沉淀出現(xiàn)，直到PH為11，靜置36小時，過濾，用去離子水洗滌至PH = 7，將所得沉淀烘干待用；
[0034](2)、將PAA溶于二甘醇DEG中，配置成0.1-10Μ濃度的溶液，在該溶液中加入步驟
(I)獲得的沉淀，攪拌的混合溶液，所述沉淀的加入量以混合溶液的重量基準為6%;混合溶液在氮氣保護下油浴220°C加熱回流2h后，繼續(xù)220°C加熱回流反應2h，得到黑色粘稠的膠體液，終止反應，靜置冷卻，得反應液；
[0035](3)、將步驟(2)獲得的反應液置于離心管中，加入5倍反應液體積的無水乙醇，SOOOrpm離心5min，重復洗滌3次，沉淀用去離子水洗滌2次，分散于反應液相等體積的去離子水中；
[0036](4)用0.22 μ m膜過濾，制得聚丙稀酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子。
[0037]實施例4
[0038](I)、制備納米四氧化三鐵膠體，將二氯化鐵和三三氯化鐵按2:1的摩爾比溶于水中，攪拌條件下緩慢滴加濃度為3%的氨水至有絮狀黑色沉淀出現(xiàn)，直到PH為12，靜置48小時，過濾，用去離子水洗滌至PH = 7，將所得沉淀烘干待用；
[0039](2)、將PAA溶于二甘醇DEG中，配置成1M濃度的溶液，在該溶液中加入步驟(I)獲得的沉淀，攪拌的混合溶液，所述沉淀的加入量以混合溶液的重量基準為1% ;混合溶液在氮氣保護下油浴220°C加熱回流2h后，繼續(xù)220°C加熱回流反應2h，得到黑色粘稠的膠體液，終止反應，靜置冷卻，得反應液；
[0040](3)、將步驟⑵獲得的反應液置于離心管中，加入5倍反應液體積的無水乙醇，SOOOrpm離心5min，重復洗滌3次，沉淀用去離子水洗滌2次，分散于反應液相等體積的去離子水中；
[0041] (4)用0.22 μπι膜過濾，制得聚丙烯酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子。
【主權項】
1.一種用于快速提取DNA的磁性納米粒子的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)、制備納米四氧化三鐵膠體，將二氯化鐵和三氯化鐵按2:1的摩爾比溶于水中，攪拌條件下緩慢滴加濃度為1% -10%的氨水至有絮狀黑色沉淀出現(xiàn)，直到PH為10?12，靜置24-48小時，過濾，用去離子水洗滌至PH = 7，將所得沉淀烘干待用； (2)、將聚丙烯酸(PAA)溶于二甘醇DEG中，配置成0.1-10M濃度的溶液，在該溶液中加入步驟(I)獲得的沉淀，攪拌的混合溶液，所述沉淀的加入量為混合溶液的重量的1-10% ;混合溶液在氮氣保護下油浴220°C加熱回流2h后，繼續(xù)220°C加熱回流反應2h，得到黑色粘稠的膠體液，終止反應，靜置冷卻，得反應液； (3)、將步驟⑵獲得的反應液置于離心管中，加入5倍反應液體積的無水乙醇，SOOOrpm離心5min，重復洗滌3次，沉淀用去離子水洗滌2次，分散于反應液相等體積的去離子水中； (4)用0.22 μ m膜過濾，制得聚丙烯酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子。
【專利摘要】一種用于快速提取DNA的磁性納米粒子的制備方法，包括(1)、制備納米四氧化三鐵膠體，將二氯化鐵和三三氯化鐵按2:1的摩爾比溶于水中，攪拌條件下緩慢滴加濃度為1％-10％的氨水至有絮狀黑色沉淀出現(xiàn)；(2)、將聚丙烯酸(PAA)溶于二甘醇DEG中，配置成0.1-10M濃度的溶液，在該溶液中加入步驟(1)獲得的沉淀，反應得到黑色粘稠的膠體液，終止反應，靜置冷卻，得反應液；(3)、將步驟(2)獲得的反應液置于離心管中，加入5倍反應液體積的無水乙醇，重復洗滌3次，沉淀用去離子水洗滌2次，分散于反應液相等體積的去離子水中；(4)用0.22μm膜過濾，制得聚丙烯酸包覆四氧化三鐵磁性納米粒子。
【IPC分類】C12N15-10
【公開號】CN104560949
【申請?zhí)枴緾N201410614801
【發(fā)明人】華文蔚
【申請人】華文蔚
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月4日