Lectin檢測(cè)的LAMP引物組及基因等溫?cái)U(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，提供了利用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)大豆內(nèi)源基因 Lectin的檢測(cè)的引物組，用于檢測(cè)所抽提基因組DNA的質(zhì)量，對(duì)市場(chǎng)上大豆及其加工產(chǎn)品 是否是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的判斷有輔助作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 伴隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛發(fā)展，全球農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化速度也隨之大大加 快，轉(zhuǎn)基因作物的推廣種植面積逐年遞增，然而，由于目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性尚無(wú)定 論，各國(guó)政府和消費(fèi)者普遍對(duì)此采取謹(jǐn)慎的態(tài)度，紛紛出臺(tái)一系列法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的貿(mào) 易加以限制，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)。因此，建立完善的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品及 食品檢測(cè)體系顯得尤其重要。
[0003] 由于普通PCR方法、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法需要變溫過(guò)程及其相應(yīng)的快速升降溫 及溫度控制，也就需要價(jià)格高昂的專用PCR設(shè)備，昂貴的儀器設(shè)備以及嚴(yán)重的污染問(wèn)題（假 陽(yáng)性率高），限制了PCR檢測(cè)方法的推廣。而現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求降低對(duì)儀器的依賴，等溫?cái)U(kuò)增 方法可以解決目前轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)對(duì)儀器依賴程度高的缺陷和不足，滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需 要。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（英文名稱為loop-mediatedisothermalamplification， 簡(jiǎn)稱LAMP)能在等溫（60-65Γ)條件下，短時(shí)間（通常是一小時(shí)內(nèi)）內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，是 一種"簡(jiǎn)便、快速、精確、低價(jià)"的基因擴(kuò)增方法。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫 度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn) 單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于 PCR技術(shù)，不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量 PCR〇
[0005] 凝集素基因（Lectin)是大豆中的特異性基因，在轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品檢測(cè)中被用作 檢測(cè)大豆基因組DNA提取數(shù)量和質(zhì)量的指標(biāo)。
[0006] 本發(fā)明將LAMP技術(shù)運(yùn)用于大豆內(nèi)源基因Lectin的快速檢測(cè)，可以免除高昂的儀 器投入，便于基層及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一套用于檢測(cè)大豆內(nèi)源基因Lectin的LAMP引物組。
[0008] 本發(fā)明用于檢測(cè)大豆內(nèi)源基因Lectin的LAMP引物序列為：
[0009] Lec-F3 :5'-GCCGAAGCAACCAAACATG-3'
[0010] Lec-B3 :5'-GGGGCATAGAAGGTGAAGTT-3'
[0011] Lec-FIP:5'-TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACTTTTATCCTCCAAGGAGACGCTAT-3'
[0012] Lec-BIP:5'-ACCCTCGTCTCTTGGTCGCGTTTTGCAACGCTACCGGTTTCT-3'
[0013] Lec-LF:5'-CTTTCCCGAGGAGGTCACA-3'
[0014] Lec-LF :5'-CCCCATCCACATTTGGGACAA-3'
[0015] 用上述引物組對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，若結(jié)果產(chǎn)生梯狀DNA條帶，則該樣 品含有大豆內(nèi)源基因Lectin，若擴(kuò)增結(jié)果沒有出現(xiàn)條帶，則該樣品中不含有大豆內(nèi)源基因 Lectin。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進(jìn)步在于：檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單，無(wú)需昂貴的PCR儀投入，只 需簡(jiǎn)單的水浴鍋即可，降低了實(shí)驗(yàn)室投入，適合基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明的目的是提供一套用于檢測(cè)大豆內(nèi)源基因Lectin的LAMP引物組。
[0018] 本發(fā)明用于檢測(cè)大豆內(nèi)源基因Lectin的LAMP引物序列為：
[0019] Lec-F3 :5'-GCCGAAGCAACCAAACATG-3'
[0020] Lec-B3 :5'-GGGGCATAGAAGGTGAAGTT-3'
[0021] Lec-FIP:5'-TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACTTTTATCCTCCAAGGAGACGCTAT-3'
[0022] Lec-BIP:5'-ACCCTCGTCTCTTGGTCGCGTTTTGCAACGCTACCGGTTTCT-3'
[0023] Lec-LF :5'-CTTTCCCGAGGAGGTCACA-3'
[0024] Lec-LF :5'-CCCCATCCACATTTGGGACAA-3'
[0025] 用上述引物組對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，若結(jié)果產(chǎn)生梯狀DNA條帶，則該樣 品含有大豆內(nèi)源基因Lectin，若擴(kuò)增結(jié)果沒有出現(xiàn)條帶，則該樣品中不含有大豆內(nèi)源基因 Lectin〇
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進(jìn)步在于：檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單，無(wú)需昂貴的PCR儀投入，只 需簡(jiǎn)單的水浴鍋即可，降低了實(shí)驗(yàn)室投入，適合基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。
[0027] (1)引物設(shè)計(jì)
[0028] 通過(guò)查閱文獻(xiàn)和用BLAST軟件分析篩選出大豆內(nèi)源基因Lectin基因序列，針對(duì)該 序列的六個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)出LAMP引物并合成，引物設(shè)計(jì)通過(guò)LAMP專用引物設(shè)計(jì)軟件完成，得到 如下引物：
[0029] Lec-F3 :5'-GCCGAAGCAACCAAACATG-3'
[0030] Lec-B3 :5'-GGGGCATAGAAGGTGAAGTT-3'
[0031] Lec-FIP:5'-TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACTTTTATCCTCCAAGGAGACGCTAT-3'
[0032] Lec-BIP:5'-ACCCTCGTCTCTTGGTCGCGTTTTGCAACGCTACCGGTTTCT-3'
[0033] Lec-LF :5'-CTTTCCCGAGGAGGTCACA-3'
[0034] Lec-LF :5'-CCCCATCCACATTTGGGACAA-3'
[0035] (2)反應(yīng)體系（反應(yīng)總體積為25μ1)
[0036]
[0038] 核酸模板：陽(yáng)性對(duì)照為濃度為5 %的大豆的基因組DNA或含有大豆內(nèi)源基因 lectin基因序列的大腸桿菌重組質(zhì)粒，陰性對(duì)照為不含lectin基因的其他物種基因組 DNA〇
[0039] ⑶恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：在60°C恒溫水浴60分鐘。
[0040] (4)檢測(cè)結(jié)果：電泳步驟（3)中的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，若產(chǎn)生特異梯狀條帶，則待測(cè)樣 品中含有大豆內(nèi)源基因lectin;若為產(chǎn)生特異梯狀條帶，則待測(cè)樣品中不含有大豆內(nèi)源基 因lectin。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種Lectin檢測(cè)LAMP引物組，其特征在于，序列為： Lec-F3 :5'-GCCGAAGCAACCAAACATG-3' Lec-B3：5'-GGGGCATAGAAGGTGAAGTT-3' Lec-FIP :5'-TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACTTTTATCCTCCAAGGAGACGCTAT-3' Lec-BIP :5'-ACCCTCGTCTCTTGGTCGCGTTTTGCAACGCTACCGGTTTCT-3' Lec-LF :5'-CTTTCCCGAGGAGGTCACA-3' Lec-LF：5'-CCCCATCCACATTTGGGACAA-3'〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Lectin檢測(cè)LAMP引物組，其特征在于，用于大豆內(nèi)源基 因Lectin檢測(cè)的核酸檢測(cè)試劑盒。3. -種基因成分CaMV35S等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于，用權(quán)利要求1中的LAMP引物組 對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增條件63°C1小時(shí)，如果電泳結(jié)果產(chǎn)生特異梯狀譜帶，則該樣 品含有大豆內(nèi)源基因Lectin，如果結(jié)果沒有出現(xiàn)特異梯狀譜帶，則樣品中不含有大豆內(nèi)源 基因Lectin。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基因成分CaMV35S等溫?cái)U(kuò)增方法，其特征在于，用于大豆 內(nèi)源基因Lectin檢測(cè)的核酸檢測(cè)試劑盒。
【專利摘要】用于檢測(cè)大豆內(nèi)源基因Lectin的LAMP擴(kuò)增用核酸引物，上述LAMP擴(kuò)增用核酸引物包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物、B3引物、LF引物和LB引物，本發(fā)明的LAMP檢測(cè)體系具有良好的特異性、靈敏度，能快速、方便、高效的檢測(cè)樣品中是否含有大豆內(nèi)源基因Lectin，以及所抽提大豆基因組DNA的質(zhì)量，有助于大豆轉(zhuǎn)基因成分的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，以能滿足國(guó)家對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的迫切需要。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105420359
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510899781
【發(fā)明人】王德國(guó), 郭孝輝, 張永清, 肖付剛, 王永真, 劉海英, 魏泉增, 張瑩麗, 馮紫艷
【申請(qǐng)人】許昌學(xué)院
【公開日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年12月8日