Pkd2基因突變檢測的擴增引物及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學體外診斷技術(shù)，具體涉及常染色體顯性多囊腎病致病基因PKD2突變檢測的擴增引物及檢測方法。所述擴增引物利用PKD2基因的序列信息設(shè)計4對PCR引物，通過長鏈PCR對PKD2進行靶向擴增，擴增區(qū)域包括全部外顯子和大部分內(nèi)含子序列，及部分5’非翻譯區(qū)序列和3’非翻譯區(qū)序列。所述方法將長鏈PCR靶向擴增結(jié)合最新發(fā)展的下一代測序技術(shù)，簡化了靶向測序流程，提高了PKD2基因突變的檢測范圍和通量，縮短了檢測周期，降低了成本。
【專利說明】
PKD2基因突變檢測的擴增引物及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學體外診斷技術(shù)，具體涉及常染色體顯性多囊腎病致病基因 PKD2 突變檢測的擴增引物及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 成人多囊腎?。╬olycystic kidney disease，PKD)是最常見的遺傳性腎病，人群 發(fā)病率約在1/400~1/1000,多為常染色體顯性遺傳，少部分為常染色體隱性遺傳。常染 色體顯性多囊腎病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)主要表 現(xiàn)為雙腎多發(fā)性進行性囊泡，引起腎臟結(jié)構(gòu)和功能損害，是終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD)最常見的遺傳病因，約占全部ESRD的10%，還可累及全身多個器官，如肝囊 月中、高血壓、顱內(nèi)動脈瘤等。
[0003] 遺傳學研究表明六0?1?主要由？1(01和？1(02基因突變引起，大約80%~85%患者 的致病基因為PKD1，導致I型多囊腎病，10%~15%患者的致病基因為PKD2,導致II型多 囊腎病。由PKD2突變引起的II型多囊腎病患者與I型多囊腎病患者相比，癥狀出現(xiàn)晚，生 存時間長，發(fā)展為腎功能衰竭的危險率低，并發(fā)癥少。對患者進行基因檢測有助于明確診 斷、直系親屬預(yù)后判斷，并為再次生育產(chǎn)前檢測提供依據(jù)。
[0004] PKD2的基因標準參照序列為GeneBank ΝΜ_000297· 3, PKD2位于人4q21_23,基 因長68kb，含15個外顯子，編碼區(qū)長度2907bp。目前已報道應(yīng)用于PKD2基因突變檢測的 方法有PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（簡稱PCR-SSCP)法、變性高效液相色譜（簡稱DHPLC)法和 Sanger測序法等，其中PCR-SSCP和DHPLC均屬于突變篩查方法，可以提高檢出突變的效率， 但兩種方法存在的影響因素較多，結(jié)果不夠穩(wěn)定，準確性較低。Sanger測序是PKD2基因突 變檢測的主要方法，常采用17對引物對PKD2的15個外顯子進行擴增，其中外顯子1因 GC 含量高，需要采用3對引物分段擴增，外顯子2至15各需1對引物，雖然該方法是PKD2基 因突變檢測的金標準，但Sanger測序工作量大、效率低、通量低，且對內(nèi)含子內(nèi)部的突變不 能進行檢測。由于PKD2基因外顯子數(shù)目較多，已鑒定出的PKD2基因突變散布于其基因的 各個區(qū)域，缺乏明顯的突變熱點，上述這些方法存在著突變檢出率較低、耗時長等缺點。此 外，US7083915B2中也公開了 PKD2基因及其用途，CN1434130A中公開了一種常染色體顯性 遺傳型多囊腎病檢測試劑盒，但是該試劑盒同樣存在引物種類多、擴增序列較短，檢測效率 低下的問題。上述現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開了的PKD2基因的相關(guān)信息均被本申請引用。
[0005] 下一代測序（next-generation sequencing，NGS)技術(shù)具有高通量、快速、準確和 成本低的優(yōu)點，可實現(xiàn)多樣本、多個基因、多外顯子的同時檢測，為臨床單基因遺傳病基因 診斷提供了新的手段。
[0006] Ion Torrent個體化基因組測序儀（PGM)是Life Technologies公司2010年底推 出的一款測序儀，Ion Torrent是基于半導體芯片的新一代革命性測序技術(shù)，該技術(shù)使用了 一種布滿小孔的高密度半導體芯片，一個小孔就是一個測序反應(yīng)池。當DNA聚合酶把4種 dNTP中的一種聚合到延伸中的DNA鏈上時，會釋放一個氫離子，反應(yīng)池中的pH值會發(fā)生變 化，位于池下的離子感受器感受到此信號，把化學信號直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，從而讀出DNA 序列。Ion Torrent測序平臺原理不同于其它NGS技術(shù)，不屬于核酸標記、熒光檢測的生化 技術(shù)，相比其它測序技術(shù)，更靈活、簡單、快速、經(jīng)濟和具有強大的擴展性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明涉及一種檢測PKD2基因突變方法，所述方法利用PKD2基因的序列信息設(shè) 計4對PCR引物，應(yīng)用長鏈PCR(Long-range PCR，LR-PCR)技術(shù)靶向擴增PKD2基因，擴增產(chǎn) 物片段化后建庫，應(yīng)用Ion Torrent個體化基因組測序儀進行高通量測序，通過生物信息學 分析獲得PKD2基因突變信息。
[0008] 本發(fā)明提供了一種PKD2基因突變的檢測方法，該方法包括下述步驟：1)采集受檢 者標本，如外周血，提取基因組DNA ;2)應(yīng)用基因組DNA作為模板，使用4對PCR引物，優(yōu)選 的PCR引物如表1所示，采用LR-PCR技術(shù)對PKD2進行靶向擴增；3)對擴增的4個長片段 產(chǎn)物，進行純化回收；4)將純化的4個PCR產(chǎn)物進行混合，對得到的混合物進行DNA的片段 化處理；5)將打斷的PCR產(chǎn)物混合物應(yīng)用接頭標簽技術(shù)構(gòu)建1個測序文庫，對不同的受檢 者基因組DNA樣品可以通過添加不同的文庫接頭標簽（Barcode Adapter)來區(qū)分各自的測 序文庫；6)將得到的多個測序文庫進行混合，利用下一代測序技術(shù)進行測序，優(yōu)選的是Ion Torrent半導體測序技術(shù)，獲得打斷后的DNA序列；7)基于標簽（Barcode)序列區(qū)分不同 的基因組DNA樣品，通過生物信息學分析將單個樣品測序獲得的DNA序列片段比對到參考 PKD2基因上，進行SNVs和Indels提取，排除多態(tài)性變異獲得該標本PKD2基因突變信息。
[0009] 在本發(fā)明的檢測方法中，所述PCR引物是用于特異性擴增PKD2的PCR引物，優(yōu)選 的PCR引物如表1所示，即：SEQ ID N0 :1、SEQ ID N0 :2用于擴增PKD2基因外顯子1至外 顯子2基因序列，SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4用于擴增外顯子3至外顯子6基因序列，SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6用于擴增外顯子7至外顯子10基因序列，SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8用于擴增外顯子11至外顯子15基因序列，擴增片段1大小為12606bp，擴增片段2大 小為12297bp，擴增片段3大小為10573bp，擴增片段4大小為10559bp，4個片段總共擴增 46035bp的基因序列，覆蓋PKD2基因67.6% (46kb/68kb)的區(qū)域。擴增區(qū)域包括全部外顯 子，及部分5'非翻譯區(qū)序列和3'非翻譯區(qū)序列，擴增區(qū)域還包括內(nèi)含子1、內(nèi)含子3、內(nèi)含 子4、內(nèi)含子5、內(nèi)含子7、內(nèi)含子8、內(nèi)含子9、內(nèi)含子11、內(nèi)含子12、內(nèi)含子13和內(nèi)含子14 序列，及部分內(nèi)含子2、內(nèi)含子6和內(nèi)含子10序列。
[0010] 本發(fā)明的檢測方法中，所述長鏈PCR (Long-range PCR，LR-PCR)又稱長距離 PCR (Long-distance，LD-PCR)，由于4個LR-PCR擴增片段均大于10kb，且片段1包含高GC 區(qū)段，普通的PCR反應(yīng)體系和條件很難成功，優(yōu)選的PCR反應(yīng)體系包含0. 5M甜菜堿，優(yōu)選的 PCR反應(yīng)條件采用2步法PCR。
[0011] 本發(fā)明的檢測方法中，所述DNA片段化方法包括化學打斷方法和物理打斷方法， 其中所述化學方法包括傳統(tǒng)酶切方法和新型轉(zhuǎn)座酶法，所述物理打斷方法包括超聲打斷方 法或機械打斷方法。所述DNA打斷后，獲得長度150bp-300bp的片段。所述純化回收方法 包括但不限于磁珠回收，也可以是電泳割膠回收。
[0012] 本發(fā)明的檢測方法中，所述NGS技術(shù)包括但不限于Ion Torrent半導體測序技術(shù)， 也可以是雙端測序（Paired end)技術(shù)，例如IlluminaMiseq測序儀和IlluminaHiseq 2000 測序儀，對不同的測序平臺需采用不同的建庫方法。
[0013] 本發(fā)明還提供了一組用于特異性擴增PKD2的PCR引物，該組PCR引物共4對，分 別如下：SEQ ID N0 :1 和 SEQ ID NO :2 ;SEQ ID N0 :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID N0 :5 和 SEQ ID NO :6 ;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8。
[0014] 本發(fā)明還提供了下述 4 對 PCR 引物：SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8 在檢測 PKD2 基因突變中的用途。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測PKD2基因突變的試劑盒，其中包括下述試劑：
[0016] (1)由 SEQ ID N0 :1、SEQ ID N0 :2、SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5、 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID勵：8分別編碼的0嫩片段作為？〇?引物各1以1，引物 的濃度為l〇ymol/L;(2)10XGeneAmp High Fidelity PCR緩沖液5μ1 ;(3)10mmol/LdNTP 2 μ 1 ; (4) 5mol/L 甜菜堿 10 μ 1 ; (5) 5U/ μ 1 聚合酶混合物 1 μ 1 〇
[0017] 本發(fā)明還提供了一種靶基因突變的檢測方法，其特征在于包括下述步驟：（1)從 受檢標本中提取基因組DNA ; (2)應(yīng)用基因組DNA作為模板，選取靶基因并設(shè)計4對PCR引 物，采用LR-PCR技術(shù)對靶基因進行靶向擴增，PCR反應(yīng)體系包含0. 5M甜菜堿，PCR反應(yīng)條 件采用2步法PCR ; (3)對擴增的4個長片段產(chǎn)物，進行純化回收；(4)將純化的4個PCR產(chǎn) 物進行混合，對得到的混合物進行DNA的片段化處理；其中所述DNA片段化方法包括化學 打斷方法和物理打斷方法，其中所述化學方法包括傳統(tǒng)酶切方法和新型轉(zhuǎn)座酶法，所述物 理打斷方法包括超聲打斷方法或機械打斷方法；（5)將打斷的PCR產(chǎn)物混合物應(yīng)用接頭標 簽技術(shù)構(gòu)建1個測序文庫，對不同的受檢基因組DNA樣品可以通過添加不同的文庫接頭標 簽（Barcode Adapter)來區(qū)分各自的測序文庫；(6)將得到的多個測序文庫進行混合，利用 Ion Torrent半導體測序技術(shù)，獲得打斷后的DNA序列；（7)基于標簽（Barcode)序列區(qū)分 不同的基因組DNA樣品，通過生物信息學分析將單個樣品測序獲得的DNA序列片段比對到 參考靶基因上，進行SNVs和Indels提取，排除多態(tài)性變異獲得該標本的靶基因的突變信 息。
[0018] 發(fā)曰月的有益效果
[0019] 首先，本發(fā)明基于LR-PCR靶向擴增技術(shù)，利用PKD2基因的序列信息特異性地設(shè)計 了 4對PCR引物，并改良了擴增反應(yīng)體系中的添加劑，新方法擴增所得到的序列的所有外顯 子和所測內(nèi)含子覆蓋率達到100%，并顯示高的測序深度，且測序深度均勻性好，達到了理 想的擴增效果；而按照常規(guī)方式設(shè)計的引物和擴增反應(yīng)體系不能達到該方法下擴增長DNA 片段的理想的技術(shù)效果。
[0020] 其次，本發(fā)明在同一PCR反應(yīng)體系和條件下，僅用4個PCR反應(yīng)可以擴增獲得PKD2 基因全部外顯子和大部分內(nèi)含子序列，與Ampliseq技術(shù)和其它目標區(qū)域捕獲技術(shù)相比，操 作更為簡單，成本較低，而且所檢測的基因序列更長，有助于提高致病突變的檢出率。
[0021] 最后，本發(fā)明還將LR-PCR靶向擴增技術(shù)結(jié)合最新發(fā)展的下一代測序技術(shù)，簡化了 靶向測序的流程，提高了 PKD2基因突變檢測的范圍和通量，縮短了檢測周期，降低了成本。
【附圖說明】
[0022] 下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的 本發(fā)明范圍。
[0023] 圖1為LR-PCR擴增結(jié)果圖，瓊脂糖凝膠電泳顯示4個PKD2基因擴增片段，PCR產(chǎn) 物為一系列片段大小l〇kb-13kb的單一條帶，其中泳道Μ為分子量標記物（λ -EcoT14I/Bgl II digest，Takara公司），泳道1-4分別為LR-PCR擴增片段1-4的電泳結(jié)果。
[0024] 圖2為Ion Torrent測序文庫的Agilent BioAnalyzer 2100分析結(jié)果的示意圖， 4個LR-PCR擴增產(chǎn)物片段化后進行文庫制備，Agilent BioAnalyzer 2100分析顯示文庫片 段大小為150bp-300bp，平均大小為220bp。
[0025] 圖3為PKD2基因 Ion Torrent測序的覆蓋深度和覆蓋率的示意圖，圖中顯示所有 外顯子平均覆蓋深度達到300 X，所有外顯子覆蓋率為100%。
[0026] 圖4為PKD2基因 Ion Torrent測序的IGV視圖，圖中顯示PKD2外顯子1至外顯 子15間的區(qū)域，所有外顯子和所測內(nèi)含子覆蓋率達到100%，并顯示高的測序深度，且測序 深度均勻性好。
[0027] 圖5為PKD2基因突變檢測陽性結(jié)果的Ion Torrent測序的IGV視圖，圖中顯示的 序列為PKD2基因正向序列，每個橫條為一條測序結(jié)果，淺灰色橫條代表正向讀序，深灰色 橫條代表反向讀序，黑色短線代表該位點c. 2046_2049delTACT微小缺失突變。
【具體實施方式】
[0028] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，下列實施例僅用于說明本 發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0029] 在本發(fā)明的實施例中，采用了 LR-PCR靶向擴增聯(lián)合Ion Torrent半導體測序的檢 測方法，該方法以基因組DNA為模板，采用LR-PCR技術(shù)靶向擴增PKD2基因目標區(qū)域，PCR產(chǎn) 物片段化成短序列后進行Ion Torrent PGM文庫制備和測序，對測序結(jié)果進行生物信息學 分析，獲得PKD2基因突變信息。
[0030] 實施例1
[0031] 基因組DNA提取
[0032] 采集受檢者外周血2ml，置于EDTA抗凝管中。取EDTA抗凝外周血標本0.2ml，按 全血DNA提取試劑盒說明書提取DNA。DNA濃度及純度用Nanodrop 2000光度計進行分析， 提取的基因組DNA準備做下一步LR-PCR的模板用。
[0033] 實施例2
[0034] LR-PCR 擴增
[0035] 根據(jù)PKD2基因的序列信息設(shè)計4對PCR引物，采用GeneAmp High Fidelity PCR System進行LR-PCR，共擴增4個大片段序列，分別為片段1、片段2、片段3和片段4,引物序 列和擴增產(chǎn)物大小如表1所示。PCR反應(yīng)總體積為50 μ 1，包括lOXGeneAmp High Fidelity PCR 緩沖液 5 μ 1，10mmol/LdNTP 2 μ 1，10 μ mol/L 上、下游引物各 1 μ 1，5mol/L 甜菜堿 10 μ 1，5U/ μ 1聚合酶混合物1 μ 1，20ng/ μ L DNA模板5 μ 1，超純水補足至50 μ 1 〇 PCR循 環(huán)參數(shù)：95°C變性 2min ;94°C 20sec，68°C 14min，共 35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 10min。PCR 反應(yīng)在 Veriti 96-well Thermal Cycler PCR 儀（美國 ABI 公司）上完成。 表1，擴增PKD2基因的LR-PCR引物
注：F為上游引物，R為下游引物，表中的PCR引物序列依次為：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO: 8〇
[0036] LR-PCR完成后，取5 μ 1 PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖1顯示了 4 個擴增片段大小和理論值一致，并且目標條帶很清晰，沒有非特異性擴增。其它基因組DNA 樣品的擴增結(jié)果與此類似。
[0037] 實施例3
[0038] PCR產(chǎn)物純化和混合
[0039] 采用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（TIANGEN生物）對PCR產(chǎn)物進行純化，純化產(chǎn)物采 用Qubit 2. 0熒光光度計進行定量，將純化后的4個PCR產(chǎn)物按等摩爾比進行混合，再次用 Qubit 2. 0熒光光度計進行定量。
[0040] 實施例4
[0041] PCR產(chǎn)物片段化處理
[0042] 對得到的1 μ g混合PCR產(chǎn)物采用NEBNextdsDNA片段化酶（Fragmentase)(美 國NEB公司）進行片段化，室溫反應(yīng)15~20min，并采用AgencourtAMPure XP磁珠（美國 Beckman Coulter 公司）純化。
[0043] 實施例5
[0044] 文庫構(gòu)建
[0045] 米用 Ion Xpress Plus Fragment Library 試劑盒（美國 Life Technologies 公 司）和 Ion Xpress Barcode Adapters 試劑（美國 Life Technologies 公司）進行模板 制備，對片段化產(chǎn)物加上文庫接頭（Barcode Adapter)，具體操作流程詳見試劑說明書，并 用 Agilent BioAnalyzer 2100(美國 Agilent 公司）分析制備質(zhì)量。圖 2 為 Ion Torrent 測序文庫的Agilent BioAnalyzer 2100分析結(jié)果，4個LR-PCR擴增產(chǎn)物片段化后進行文 庫制備，Agilent BioAnalyzer 2100分析顯不文庫片段大小為150bp_300bp，平均大小為 220bp〇
[0046] 實施例6
[0047] Ion Torrent PGM 測序
[0048] 乳液 PCR 和 ISPs 富集：采用 Ion PGM Xpress Template 200 Kit 在 Ion OneTouch (Life Technologies)上進行乳液PCR，對模板陽性磁珠顆粒（Ion SphereParticles，ISPs)在 Ion OneTouch ES(LifeTechnologies)上進行富集。米用 Ion PGM Sequencing 200 Kit 及 Ion Torrent316 芯片在 Ion Torrent PGM測序儀上進行測序， 共500次核酸流動注射（flows)。
[0049] 實施例7
[0050] 數(shù)據(jù)分析
[0051] 采用Ion Torrent Suite ν3· 0軟件進行Ion Torrent數(shù)據(jù)提取、序列比對及SNVs 和Indels提取，得到的SNVs和Indels經(jīng)dbSNP 138數(shù)據(jù)庫過濾后，檢索千人基因組數(shù)據(jù) 庫，獲得千人基因組最小等位基因頻率，排除多態(tài)性變異，可疑致病突變經(jīng)人類基因突變數(shù) 據(jù)庫（The Human Gene Mutation Database，HGMD)、萊頓開放式變異數(shù)據(jù)庫（Leiden Open Variation Database，L0VD)等數(shù)據(jù)庫及美國國立醫(yī)學圖書館Pubmed相關(guān)文獻，匹配已報 道的致病位點，對原始BAM文件應(yīng)用Integrative Genomics Viewer(IGV)軟件進行比對 讀序（reads)的可視化分析。圖3和圖4為1例典型的Ion Torrent測序檢測結(jié)果。圖3 顯示PKD2基因 Ion Torrent測序的覆蓋深度和覆蓋率，顯示所有外顯子平均覆蓋深度達到 300X，所有外顯子覆蓋率為100%。圖4顯示PKD2基因 Ion Torrent測序的IGV視圖，顯 示PKD2外顯子1至外顯子15間的區(qū)域，所有外顯子和所測內(nèi)含子覆蓋率達到100%，并顯 示高的測序深度，且測序深度均勻性好。
[0052] 通過本發(fā)明檢測了 10例多囊腎患者，發(fā)現(xiàn)了 1例PKD2突變檢測陽性患者，圖5顯 示這例PKD2突變檢測陽性結(jié)果，該患者存在c. 2046_2049delTACT雜合突變，該突變?yōu)橐?碼突變，導致氨基酸序列發(fā)生P. Asp682AspfSX5突變，所患疾病為II型多囊腎病。得到的 PKD2基因突變結(jié)果與Sanger測序的結(jié)果是一致的，說明本發(fā)明的方法是可行的。
【主權(quán)項】
1. 一種PKD2基因突變的檢測方法，其特征在于包括下述步驟： 1) 米集受檢者標本，如外周血，提取基因組DNA 2) 應(yīng)用基因組DNA作為模板，使用4對PCR引物：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8 ;采 用LR-PCR技術(shù)對PKD2進行靶向擴增； 3) 對擴增的4個長片段產(chǎn)物，進行純化回收； 4) 將純化的4個PCR產(chǎn)物進行混合，對得到的混合物進行DNA的片段化處理； 5) 將打斷的PCR產(chǎn)物混合物應(yīng)用接頭標簽技術(shù)構(gòu)建1個測序文庫，對不同的受檢者基 因組DNA樣品可以通過添加不同的文庫接頭標簽來區(qū)分各自的測序文庫； 6) 將得到的多個測序文庫進行混合，利用下一代測序技術(shù)進行測序，優(yōu)選的是Ion Torrent半導體測序技術(shù)，獲得打斷后的DNA序列； 7) 基于標簽序列區(qū)分不同的基因組DNA樣品，通過生物信息學分析將單個樣品測序獲 得的DNA序列片段比對到參考PKD2基因上，進行SNVs和Indels提取，排除多態(tài)性變異獲 得該標本PKD2基因突變信息。2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PCR引物是用于特異性擴增PKD2的PCR引物，優(yōu) 選的 PCR 引物為 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 ;其中： 片段1通過SEQ ID NO: 1作為上游引物、SEQ ID NO :2作為上游引物，擴增外顯子1至 外顯子2基因序列，產(chǎn)物長度12606bp ; 片段2通過SEQ ID NO :3作為上游引物、SEQ ID NO :4作為上游引物，擴增外顯子3至 外顯子6基因序列，產(chǎn)物長度12297bp ; 片段3通過SEQ ID NO :5作為上游引物、SEQ ID NO :6作為上游引物，擴增外顯子7至 外顯子10基因序列，產(chǎn)物長度10573bp ; 片段4通過SEQ ID NO :7作為上游引物、SEQ ID NO :8作為上游引物，擴增外顯子11 至外顯子15基因序列，產(chǎn)物長度10559bp ; 所述的外顯子均是PKD2基因的外顯子，4個片段總共擴增46035bp的基因序列，覆蓋 PKD2 基因 67·6% (46kb/68kb)的區(qū)域。3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述LR-PCR中，優(yōu)選的PCR反應(yīng)體系包含0. 5M甜菜 堿，優(yōu)選的PCR反應(yīng)條件采用2步法PCR。4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA片段化方法包括化學打斷方法和物理打斷方 法，其中所述化學方法包括傳統(tǒng)酶切方法和新型轉(zhuǎn)座酶法，所述物理打斷方法包括超聲打 斷方法或機械打斷方法。5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述下一代測序技術(shù)包括但不限于Ion Torrent半 導體測序技術(shù)，也可以是雙端測序（Paired end)技術(shù)，例如IlluminaMiseq測序儀和 IlluminaHiseq2000 測序儀。6. -組用于特異性擴增PKD2的PCR引物，該組PCR引物共4對，分別如下：SEQ ID NO : 1 和 SEQ ID N0:2;SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8。7. 權(quán)利要求6所述的PCR引物在檢測PKD2基因突變中的用途。8. -種用于檢測PKD2基因突變的試劑盒，其中包括下述試劑： (1) 由 PCR 引物共 4 對，分別如下：SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 ;SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ;SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8,每種 PCR 引物各 1 μ 1，引物的濃度為10 ym〇l/L ; (2) 10XGeneAmp High Fidelity PCR 緩沖液5μ1 ; (3) lOmmol/LdNTP 2 μ I ； (4) 5mol/L 甜菜堿 10 μ I ; (5) 5U/ μ 1聚合酶混合物1 μ 1。9. 一種靶基因突變的檢測方法，其特征在于包括下述步驟： (1) 從受檢標本中提取基因組DNA ; (2) 應(yīng)用基因組DNA作為模板，選取靶基因并設(shè)計4對PCR引物，采用LR-PCR技術(shù)對靶 基因進行靶向擴增，PCR反應(yīng)體系包含0. 5M甜菜堿，PCR反應(yīng)條件采用2步法PCR ; (3) 對擴增的4個長片段產(chǎn)物，進行純化回收； (4) 將純化的4個PCR產(chǎn)物進行混合，對得到的混合物進行DNA的片段化處理；其中所 述DNA片段化方法包括化學打斷方法和物理打斷方法，其中所述化學方法包括傳統(tǒng)酶切方 法和新型轉(zhuǎn)座酶法，所述物理打斷方法包括超聲打斷方法或機械打斷方法； (5) 將打斷的PCR產(chǎn)物混合物應(yīng)用接頭標簽技術(shù)構(gòu)建1個測序文庫，對不同的受檢基 因組DNA樣品可以通過添加不同的文庫接頭標簽（Barcode Adapter)來區(qū)分各自的測序文 庫； (6) 將得到的多個測序文庫進行混合，利用Ion Torrent半導體測序技術(shù)，獲得打斷后 的DNA序列： (7) 基于標簽（Barcode)序列區(qū)分不同的基因組DNA樣品，通過生物信息學分析將單個 樣品測序獲得的DNA序列片段比對到參考靶基因上，進行SNVs和Indels提取，排除多態(tài)性 變異獲得該標本的靶基因的突變信息。
【文檔編號】C12N15/11GK105886605SQ201510097221
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年3月5日
【發(fā)明人】許爭峰, 馬定遠, 胡平, 蔣濤
【申請人】南京市婦幼保健院