本發(fā)明屬于醫(yī)學中的輔助生殖領(lǐng)域，更具體地講，涉及卵母細胞非滲透性保護劑皺縮法序貫玻璃化冷凍液及使用方法。

背景技術(shù)：

卵子冷凍價值巨大，比如，罹患癌癥的適齡女性可在化療前凍存卵子，癌癥治療后再解凍卵子生育，而無需借卵；職業(yè)女性可在年輕時將卵子冷凍，待有生育意愿時解凍卵子生兒育女；在符合倫理和知情同意的前提下，輔助生殖治療的女性可將部分卵子冷凍，成功分娩后將凍存的卵子捐贈給他人，解決贈卵來源困難的難題；卵子冷凍在珍稀動物、實驗動物保種和再生醫(yī)學研究等領(lǐng)域也具有重要的研究和應(yīng)用價值。

然而，卵子冷凍技術(shù)目前并不成熟，表現(xiàn)為兩低一高，即存活率和囊胚形成率低，而流產(chǎn)率高。人卵慢速冷凍的存活率僅為50％-70％，玻璃化冷凍對慢速冷凍是一次革命，胞內(nèi)和胞外均不會形成冰晶，存活率可達85％-90％以上。但是，玻璃化技術(shù)對操作者的要求很高，冷凍結(jié)局嚴重受限于胚胎學家的操作技巧和熟練程度，表現(xiàn)有三：1)文獻顯示，使用相同冷凍液和冷凍方法的各個不同實驗室其冷凍結(jié)局有很大差別；2)同一個實驗室不同操作者之間的差異很大，以臨床上廣泛使用的15％eg+15％dmso+0.5m蔗糖+cryotop玻璃化冷凍方案為例，操作者之間的存活率差異可高達30％以上；3)同一個操作者使用相同的冷凍方法，經(jīng)過大樣本量的訓練后，存活率可有明顯提高，直至接近其個人成績的上限。這說明目前公知的人卵玻璃化冷凍方案(包括冷凍液和冷凍方法)掌握難度較大，事實也是如此，該技術(shù)并未在臨床上廣泛使用，僅作為取卵日無精子或癌癥患者放化療前的補救療法。所以，研究開發(fā)重復性好，穩(wěn)定性高，不依賴于操作者經(jīng)驗的人卵玻璃化冷凍液及冷凍方案具有重要的臨床應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供重復性好，穩(wěn)定性高，不依賴于操作者經(jīng)驗的卵母細胞非滲透性保護劑皺縮法序貫玻璃化冷凍液。

本發(fā)明的第二個目的在于提供卵母細胞非滲透性保護劑皺縮法序貫玻璃化冷凍液的使用方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明第一個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：卵母細胞非滲透性保護劑皺縮法序貫玻璃化冷凍液，其特征在于，所述序貫玻璃化冷凍液包括皺縮液、平衡液和玻璃化液，所述皺縮液為使細胞脫水的非滲透性保護劑。

作為一個優(yōu)選方案，所述皺縮液為0.01mol/l-1.0mol/l蔗糖和/或海藻糖溶液。

作為一個優(yōu)選方案，所述皺縮液為0.1mol/l-0.5mol/l蔗糖和/或海藻糖溶液。

作為一個優(yōu)選方案，所述皺縮液為0.1mol/l-0.2mol/l蔗糖和/或海藻糖溶液

作為一個優(yōu)選方案，所述平衡液為5％-10％eg+5％-10％dmso，所述玻璃化液為10％-20％eg+10％-20％dmso+0.01mol/l-1.0mol/l蔗糖和/或海藻糖。

作為一個優(yōu)選方案，所述平衡液為7.5％eg+7.5％dmso，所述玻璃化液為15％eg+15％dmso+0.5mol/l蔗糖和/或海藻糖。

為實現(xiàn)本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：卵母細胞非滲透性保護劑皺縮法序貫玻璃化冷凍液使用方法，其特征在于，將細胞分別經(jīng)皺縮液作用30秒-5分鐘、經(jīng)平衡液作用1分鐘-15分鐘和經(jīng)玻璃化液作用30秒-180秒后，裝載于玻璃化冷凍載體后投入液氮。

作為一個優(yōu)選方案，將細胞分別經(jīng)皺縮液作用1分鐘-2分鐘、經(jīng)平衡液作用8分鐘-12分鐘和經(jīng)玻璃化液作用60秒-120秒后，裝載于玻璃化冷凍載體后投入液氮。

本發(fā)明要求卵母細胞在投入液氮完成玻璃化凍結(jié)前，須序貫經(jīng)過三種冷凍液分別實現(xiàn)三個目的：第一步用一定濃度的非滲透性保護劑使細胞脫水(胞漿皺縮)，所用液體稱為皺縮液；第二步用較低濃度的滲透性保護劑使細胞充分平衡，所用液體稱為平衡液；第三步用適當濃度的非滲透性保護劑和較高濃度的滲透性保護劑使細胞進一步平衡并再次脫水，以達到投入液氮時可實現(xiàn)完全玻璃化狀態(tài)之目的，所用液體稱為玻璃化液。目前現(xiàn)有的玻璃化冷凍液核心環(huán)節(jié)為兩步，即平衡液和玻璃化液，本發(fā)明在現(xiàn)有的玻璃化方案前增加了一步，即用非滲透性的高滲液(如蔗糖、海藻糖等)使細胞脫水，胞漿體積縮小，這將會縮短細胞在第二步平衡液內(nèi)完成平衡所需要的時間，降低冷凍保護劑對細胞的毒性作用(提高發(fā)育潛能)，并可能有助于提高細胞膜的穩(wěn)定性，降低操作難度，提高復蘇存活率，這是本發(fā)明的優(yōu)勢得以實現(xiàn)的根本原因。

本發(fā)明所使用的平衡液和玻璃化液可與目前公知的、輔助生殖臨床上廣泛使用的玻璃化冷凍液相同，如平衡液為7.5％(v/v)乙二醇(ethyleneglycol，eg)+7.5％(v/v)二甲亞砜(dimethylsulfoxide，dmso)或7.5％(v/v)eg+7.5％(v/v)丙二醇(propyleneglycol，proh)，玻璃化液為15％(v/v)eg+15％(v/v)dmso+0.5mol/l蔗糖或15％(v/v)eg+15％(v/v)proh+0.5mol/l蔗糖。

對配制皺縮液、平衡液和玻璃化液所用的基礎(chǔ)液和蛋白添加物無特別要求?；A(chǔ)液可為改良的人輸卵管液(modifiedhumantubalfluid，mhtf)、tcm199或平衡鹽溶液pbs等。蛋白添加物可為終濃度為10％-20％(v/v)的人血清白蛋白(hsa)或血清替代物(serumsubstitutesupplement，sss)等。

本發(fā)明將卵子用非滲透性保護劑預處理使其體積縮小后再進行玻璃化冷凍，后續(xù)平衡液和玻璃化液可與現(xiàn)有方案類似，對臨床上廣泛使用的eg+dmso+蔗糖和/或海藻糖組合和eg+proh+蔗糖和/或海藻糖組合均可適用。文獻也有報道在卵子玻璃化冷凍前進行預處理，如直接在基礎(chǔ)液里靜置1-2分鐘(本質(zhì)是使卵子適應(yīng)室溫的操作環(huán)境，因為人卵本來培養(yǎng)在37℃的溫箱內(nèi))，或者基礎(chǔ)液中添加β-巰基乙醇(活性氧抑制劑)、細胞松弛素b或紫杉醇(細胞骨架穩(wěn)定劑)等，以減少卵子紡錘體和微觀微絲的結(jié)構(gòu)改變，這些預處理方式均著眼于提高復蘇卵子的發(fā)育潛能，目前僅在動物卵子上進行了嘗試(效果有爭議，未用于人卵)，不能降低凍卵技術(shù)的操作難度，也不能提高冷凍結(jié)局的穩(wěn)定性，與本發(fā)明所述的非滲透性保護劑皺縮法的預處理方式和預期目標均顯著不同。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：(1)細胞在進入平衡液前先用非滲透性保護劑預處理使其脫水(胞漿皺縮)，可縮短平衡液內(nèi)的作用時間，降低滲透性保護劑的化學毒性；(2)非滲透性保護劑預處理，可提高卵子胞膜的穩(wěn)定性，使卵子更耐受滲透損傷，有助于提高復蘇卵子的存活率；(3)不同熟練程度的操作者均可獲得非常穩(wěn)定的高存活率，臨床應(yīng)用前無需進行長時間、大樣本量的技術(shù)培訓；(4)結(jié)果穩(wěn)定、操作簡單，將極大有利于人卵玻璃化冷凍技術(shù)在臨床上廣泛推廣。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1.蔗糖皺縮法序貫玻璃化冷凍液的配制

皺縮液：稱取0.342g-34.2g蔗糖，加10ml-20mlsss，用mhtf或pbs補足至總量100ml，即為0.01mol/l-1.0mol/l的皺縮液。作為優(yōu)選，稱取蔗糖3.42g，加20mlsss，用mhtf補足至總量100ml，即為0.1mol/l的皺縮液。

平衡液：量取5ml-10mleg，5ml-10mldmso，加10ml-20mlsss，用mhtf或pbs補足至總量100ml，即為5％-10％eg+5％-10％dmso的平衡液。作為優(yōu)選，量取7.5mleg，7.5mldmso，加20mlsss，用mhtf補足至總量100ml，即為7.5％eg+7.5％dmso的平衡液。

玻璃化液：量取10ml-20mleg，10ml-20mldmso，稱取0.342g-34.2g蔗糖，加10ml-20mlsss，用mhtf或pbs補足至總量100ml，即為10％-20％eg+10％-20％dmso+0.01mol/l-1.0mol/l蔗糖的玻璃化液。作為優(yōu)選，量取15mleg，15mldmso，稱取17.1g蔗糖，加20mlsss，用mhtf補足至總量100ml，即為15％eg+15％dmso+0.5mol/l蔗糖的玻璃化液。

實施例2.海藻糖皺縮法序貫玻璃化冷凍液的配制

皺縮液：稱取0.378g-37.8g海藻糖，加10ml-20mlsss，用mhtf或pbs補足至總量100ml，即為0.01mol/l-1.0mol/l的皺縮液。作為優(yōu)選，稱取海藻糖3.78g，加20mlsss，用mhtf補足至總量100ml，即為0.1mol/l的皺縮液。

平衡液：量取5ml-10mleg，5ml-10mldmso，加10ml-20mlsss，用mhtf或pbs補足至總量100ml，即為5％-10％eg+5％-10％dmso的平衡液。作為優(yōu)選，量取7.5mleg，7.5mldmso，加20mlsss，用mhtf補足至總量100ml，即為7.5％eg+7.5％dmso的平衡液。

玻璃化液：量取10ml-20mleg，10ml-20mldmso，稱取0.378g-37.8g海藻糖，加10ml-20mlsss，用mhtf或pbs補足至總量100ml，即為10％-20％eg+10％-20％dmso+0.01mol/l-1.0mol/l蔗糖的玻璃化液。作為優(yōu)選，量取15mleg，15mldmso，稱取18.9g海藻糖，加20mlsss，用mhtf補足至總量100ml，即為15％eg+15％dmso+0.5mol/l海藻糖的玻璃化液。

實施例3.不同溶液的滲透壓測定及卵子在蔗糖溶液內(nèi)的體積變化

發(fā)明人測定了0.1mol/l、0.2mol/l、0.5mol/l和1.0mol/l蔗糖溶液的滲透壓，分別為387mosm/kg·h2o、505mosm/kg·h2o、899mosm/kg·h2o和1464mosm/kg·h2o(表1)。經(jīng)0.1mol/l蔗糖溶液處理2分鐘后卵子的體積縮小為原體積的62％左右，而經(jīng)1.0mol/l蔗糖溶液預處理2分鐘后卵漿容積縮小為原來的38％左右，但預處理導致的卵漿容積縮小并不影響昆明小鼠卵子的發(fā)育潛能(表2)。發(fā)明人還測定了細胞松弛素b和紫杉醇預處理液的滲透壓，分別為293mosm/kg·h2o和295mosm/kg·h2o(表1)，這與基礎(chǔ)液20％sss-mhtf(289mosm/kg·h2o)相當，都屬生理滲透壓范圍，不會造成卵漿體積減小。

表1不同溶液的滲透壓

實施例4.小鼠mⅱ卵子蔗糖皺縮法玻璃化冷凍

取出4℃冰箱內(nèi)儲存的皺縮液、平衡液和玻璃化液置室溫30分鐘后使用。分別取1ml皺縮液和平衡液置四孔板的1號孔和2號孔，2枚小鼠mⅱ卵子分別在皺縮液和平衡液內(nèi)作用1分鐘和5分鐘。卵子在平衡液內(nèi)作用到3分鐘-4分鐘時，在四孔板皿蓋上準備2個50μl的玻璃化液微滴，將平衡液內(nèi)充分平衡(5分鐘)的卵子轉(zhuǎn)移至玻璃化微滴內(nèi)，每個微滴停留30秒后，迅速裝載于冷凍載體cryotop上，直接投入液氮內(nèi)完成玻璃化凍結(jié)，再將cryotop置于冷凍支架上轉(zhuǎn)移至液氮罐內(nèi)長期保存。

實施例5.人mⅱ卵子蔗糖皺縮法玻璃化冷凍

取出4℃冰箱內(nèi)儲存的預處理液、平衡液和玻璃化液置室溫30分鐘后使用。分別取1ml預處理液和平衡液置四孔板的1號孔和2號孔，2枚體外培養(yǎng)成熟的人mⅱ卵子分別在預處理液和平衡液內(nèi)作用1分鐘和10分鐘。卵子在平衡液內(nèi)作用到8分鐘-9分鐘時，在四孔板皿蓋上準備2個50μl的玻璃化液微滴，將平衡液內(nèi)充分平衡(10分鐘)的卵子轉(zhuǎn)移至玻璃化微滴內(nèi)，每個微滴停留30秒后，迅速裝載于冷凍載體cryotop上，直接投入液氮內(nèi)完成玻璃化凍結(jié)，再將cryotop置于冷凍支架上轉(zhuǎn)移至液氮罐內(nèi)長期保存。

實施例6.卵子經(jīng)不同濃度的蔗糖溶液預處理后的發(fā)育潛能比較

常規(guī)方法促排6-8周齡昆明雌鼠，獲取mⅱ卵子，經(jīng)不同濃度的蔗糖溶液預處理1分鐘、2分鐘后，用氯化鍶化學激活，觀察卵裂率(2細胞率)、囊胚形成率、囊胚孵出率和總效率(孵出囊胚/卵子數(shù)*100％)，研究卵子經(jīng)不同濃度蔗糖溶液預處理后的發(fā)育潛能，結(jié)果顯示0.01mol/l-1.0mol/l各組蔗糖溶液處理1分鐘和2分鐘后均與對照組(0mol/l蔗糖組，即20％sss-mhtf基礎(chǔ)液、不含蔗糖)無顯著差異(表2)，所以蔗糖溶液預處理不會降低卵子的繼續(xù)發(fā)育能力，可以認為該操作是安全的。

表2不同濃度蔗糖溶液預處理卵子后的發(fā)育情況(昆明小鼠mii卵子)

各組比較無顯著差異(p＞0.05)

實施例7.兩種玻璃化冷凍方法對卵子發(fā)育潛能的影響

傳統(tǒng)法玻璃化冷凍以目前最廣泛使用的es為7.5％(v/v)eg+7.5％(v/v)dmso、vs為15％(v/v)eg+15％(v/v)dmso+0.5mol/l蔗糖、載體為cryotop為例，比較本發(fā)明所述的蔗糖皺縮法玻璃化冷凍方案對卵子發(fā)育潛能的影響。結(jié)果顯示，與新鮮對照組相比，兩種方案冷凍后，昆明小鼠卵子的發(fā)育潛能均顯著降低，但本發(fā)明所述方案冷凍卵子的存活率和發(fā)育潛能(2細胞數(shù)率和囊胚形成率)均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方案(表3)。

表3昆明小鼠mii卵兩種玻璃化冷凍方法的結(jié)果比較

^a，b，c兩兩比較有顯著差異(p＜0.05)

實施例8不同熟練程度的操作者用本發(fā)明所述方案冷凍卵子均獲得了穩(wěn)定的高存活率

不同熟練程度的操作分別用本發(fā)明公布的蔗糖皺縮法預處理玻璃化方案和傳統(tǒng)玻璃化方案(同實施例5)冷凍體外培養(yǎng)成熟的人mⅱ卵子，比較復蘇后0h和24h的存活率。結(jié)果顯示(表4)：1，同一個操作者本發(fā)明所述方案的0h和24h存活率均顯著高于傳統(tǒng)方案；2，不同熟練程度的操作者用本發(fā)明所述方案冷凍人mⅱ卵子均獲得了穩(wěn)定的高存活率，非常熟練者、基本掌握者和卵子冷凍初學者的0h和24h存活率分別為100％、100％、98.3％和100％、100％、98.3％，三組之間無差異；3，不同熟練程度的操作者用傳統(tǒng)方案冷凍人mⅱ卵子時，存活率有顯著差異，卵子冷凍的初學者(5年以上工作經(jīng)歷的中高級胚胎學家，只是沒有卵子冷凍經(jīng)驗)僅獲得56％的存活率。盡管無統(tǒng)計學差異，但傳統(tǒng)方案中基本掌握者的存活率與非常熟練者相比仍有較大的降低趨勢(80％vs90％)。由此可見，本發(fā)明所述方案在冷凍人卵時結(jié)果穩(wěn)定，操作者無需接受長時間、大樣本量的技術(shù)培訓即可開展該技術(shù)。

表4不同操作者兩種方案冷凍卵子的存活率(體外培養(yǎng)成熟的人mii卵子)

avsbp＜0.05，＊vs#p＜0·05

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。