包含乳酸菌和保護(hù)劑的新型組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于乳酸菌的干燥組合物，并且具體地涉及包含109至1013cfu/g組合物的乳酸菌細(xì)胞的干燥組合物，其中所述組合物的特征在于其還包含下列含量的保護(hù)劑(以下所有量的保護(hù)劑均相對于所述組合物中1g乳酸菌細(xì)胞確定)：6?9g海藻糖、0.1?1g菊粉和0.5?3g水解酪蛋白,并且其不包含藻酸鹽。所述組合物具有改善的感興趣細(xì)胞的儲存穩(wěn)定性。在含有藻酸鹽和不含藻酸鹽的組合物間進(jìn)行了比較試驗，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)就穩(wěn)定性而言在含藻酸鹽或不含藻酸鹽的組合物之間基本上沒有差異。此外，本發(fā)明涉及制備干燥乳酸菌組合物的方法。
【專利說明】
包含乳酸菌和保護(hù)劑的新型組合物
[0001 ]本申請是申請日為2012年6月30日、
【申請人】為科.漢森有限公司、發(fā)明名稱為"新型 組合物"的中國專利申請201280032195.7的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于乳酸菌的干燥組合物的領(lǐng)域，制備干燥乳酸菌組合物的方法以及 可以通過所述方法制備的組合物。
【背景技術(shù)】
[0003] 諸如例如微生物的細(xì)胞涉及大量工業(yè)相關(guān)過程。例如細(xì)菌培養(yǎng)物，特別是通常歸 類為乳酸菌(LAB)的細(xì)菌的培養(yǎng)物在制備所有發(fā)酵乳制品、奶酪和黃油中是至關(guān)重要的。此 類細(xì)菌的培養(yǎng)物可以稱為起子培養(yǎng)物并且它們通過執(zhí)行許多功能而將特定的特征賦予各 種乳制品。
[0004] 許多乳酸菌已知具有益生性質(zhì)（即，它們當(dāng)被攝入時對人類具有有益的健康效 應(yīng)）。在大多數(shù)情況下，必要的是微生物在長期儲存后保持活力，以便這些微生物在攝取時 發(fā)揮它們的有益效應(yīng)。已經(jīng)做出嘗試，其中凍干的細(xì)菌與充當(dāng)潮濕屏障的添加劑或充當(dāng)冷 凍細(xì)胞所需要的保護(hù)劑(所謂的冷凍保護(hù)劑)混合。在使它們更穩(wěn)定的嘗試中已經(jīng)向微生物 添加了多種類型的添加劑。
[0005] 對于一些應(yīng)用-可以說優(yōu)選應(yīng)當(dāng)具有儲存非常穩(wěn)定的乳酸菌組合物/制劑。
[0006] 例如-如果LAB組合物與奶粉混合以制備合適的嬰兒奶粉，通常需要儲存非常穩(wěn)定 的LAB組合物-其根本原因是嬰兒奶粉產(chǎn)品本身通常是儲存非常穩(wěn)定的并且可以在其實際 制造日期后相當(dāng)長的時間給予嬰兒。因此，如果嬰兒奶粉在其實際制造日期后例如30周(或 更晚)給予嬰兒-顯然摻入到嬰兒奶粉中的LAB組合物應(yīng)當(dāng)是儲存十分穩(wěn)定的以便維持LAB 細(xì)胞的活力。
[0007] W02010/138522A2(Advanced Bionutrition Corporation)記載了LAB細(xì)胞培養(yǎng)組 合物，其被說明為可用于摻入到嬰兒奶粉產(chǎn)品中。優(yōu)選的組合物包含藻酸鹽、菊粉、海藻糖 和水解蛋白質(zhì)（參見第[0094]段表1，）。
[0008] 可以說，W02010/138522A2的表1的LAB組合物包含相對高的量的可以稱為保護(hù)劑 的物質(zhì)-即，可以幫助提高乳酸菌細(xì)胞的儲存穩(wěn)定性的試劑。
[0009] 例如-可以說W02010/138522A2的表1的LAB組合物包含相對高的量的海藻糖。
[0010] W02010/138522A2 的第[0097]段寫到：
[0011 ] "嗜酸乳桿菌(Lactobacillus Acidophilus)(100g來自實驗室發(fā)酵收獲物的冷凍 濃縮物)在37 °C融化。蛋白水解產(chǎn)物預(yù)混料(100g，表1)…"
[0012]如技術(shù)人員已知的那樣，LAB細(xì)胞濃縮物，如該段落[0097]中所述，可以經(jīng)常包含 約10%的細(xì)胞干物質(zhì)。在這種假設(shè)下-可以說在此段落[0097]中描述的干燥L(fēng)AB組合物是包 含比LAB細(xì)胞本身約10倍多保護(hù)劑的LAB組合物-根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)，這可以被認(rèn)為是具有相 對高的量的保護(hù)劑的LAB組合物。
[0013] 這種具有相對高的量的保護(hù)劑的LAB組合物所存在的問題可以是它們本身經(jīng)常十 分難以適宜地干燥-例如不能顯著地使相關(guān)的LAB細(xì)胞失活。
[0014] W02010/138522A2記述了用于干燥例如段落[0097]中所述的LAB組合物的方法，如 上所述所述LAB組合物可以被認(rèn)為是具有相對高的量的保護(hù)劑的LAB組合物。
[0015] W02010/138522A2的第[0081]段寫到（著重部分被標(biāo)明）：
[0016] "用于保存生物活性微生物諸如活的或減毒的微生物的典型方法包括冷凍和真空 條件的組合，其可以導(dǎo)致膜損害和細(xì)胞成分的變性?，F(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)使用較高真空壓力（例 如，小于lOOTorr)，添加特定冷凍保護(hù)劑，獲得稠厚溶液(漿)的濃縮步驟，和/或較高的初始 溫度以防止凍結(jié)。"
[0017] W02010/138522A2的此段落[0087]可以被認(rèn)為提供了現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于合適的本文相 關(guān)干燥過程的通常所教導(dǎo)內(nèi)容的總體概述。
[0018] 本文可以說相關(guān)的是注意到TO2010/138522A2中直接和明確地記載的干燥方法例 如不涉及冷凍步驟以形成固體冷凍顆粒/小丸。
[0019] TO2010/138522A2(Advanced Bionutrition Corporation)記述了包含藻酸鹽、菊 粉、海藻糖和水解蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)組合物(參見第[0094]段表1)。
[0020] 然而，仍然存在對能夠承受提高的濕度/高水活度的改良的組合物的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明要解決的問題涉及提供一種用于制備包含乳酸菌(LAB)細(xì)胞并且可以被認(rèn) 為是相對高的量的保護(hù)劑的干粉組合物的新方法以及提供在潮濕條件下長時間地儲存穩(wěn) 定的組合物。
[0022]在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及包含109_1013cfu/g組合物的乳酸菌細(xì)胞的干燥 組合物，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相 對于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0023] (i):6_9g 海藻糖，
[0024] 0.1-lg 菊粉和
[0025] 0.5_3g水解酪蛋白，并且其特征在于
[0026]其不包含藻酸鹽。
[0027]參照本文中的工作實施例，其中證明了LAB細(xì)胞鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)LG.G?(其可從Chr. Hansen A/S，Hoersholm，Denmark商購）的儲存穩(wěn)定性在如 本文所述的組合物中被顯著提高。本發(fā)明人還采用LAB細(xì)胞干酪乳桿菌（L.ca Sei)43.2⑩ (類干酪乳桿菌類干酪亞種(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei))進(jìn)行了實驗-并且對于如本文所述的干燥組合物也證明了良好的儲存穩(wěn)定性。
[0028] 如在本文工作實施例中所說明的，如本文所述的新型組合物導(dǎo)致細(xì)胞的提高的儲 存穩(wěn)定性。具體地，所述組合物在提高的濕度/高水活度下更為穩(wěn)定。本發(fā)明提供了在具有 0.3的水活度的嬰兒奶粉中包含LAB的組合物，其中當(dāng)在30%RH在35°C保存并且在13周后測 試時活性細(xì)胞的對數(shù)損失〈2.5。優(yōu)選地，在17周后組合物活性細(xì)胞的對數(shù)損失〈2.5。
[0029] 如在實施例中所證明，就穩(wěn)定性而言，在含有或不含有藻酸鈉的組合物之間基本 上沒有差異。然而，對于已經(jīng)接受熱處理的含有藻酸鈉的組合物，與沒有藻酸鈉的組合物相 反，熱處理對穩(wěn)定性有負(fù)面影響。
[0030] 因此，本發(fā)明的一個方面涉及包含109-1013Cfu/g組合物的乳酸菌細(xì)胞的干燥組合 物，其中所述組合物的特征在于其還包含相對高的量的保護(hù)劑，如下面進(jìn)一步所詳細(xì)說明 的。優(yōu)選地，出于隨后進(jìn)一步詳細(xì)解釋的原因，所述組合物不包含藻酸鹽諸如藻酸鈉。
[0031] 如本文所討論-如本文所述的干燥組合物可以用于例如具有高水活度(aw = 0.3) 的嬰兒奶粉或用于其他高aw應(yīng)用如谷類、堅果麥片條(muesli bars)或巧克力中。
[0032]該方案基于以下:本發(fā)明人已經(jīng)利用大量不同的用于干燥這些組合物的參數(shù)進(jìn)行 了廣泛的研究并且認(rèn)識到通過使用如本文所述的干燥方法，能夠以有效方式適宜地干燥這 些組合物，所述方式可以采用相對大量的LAB組合物以工業(yè)規(guī)模應(yīng)用-即，其可以以相對低 的成本制備并且干燥可以在相對短的時期內(nèi)（例如15-30小時內(nèi)）進(jìn)行。
[0033] 如上所討論-W02010/138522A2中直接和明確地記載的干燥方法例如不涉及冷凍 步驟以形成固體冷凍顆粒/小丸。如本文所述的干燥方法還包括與W02010/138522A2中直接 和明確地記載的不同的其他方法步驟。
[0034]例如-在本發(fā)明的第一方面的方法的初次干燥步驟(e)中使用0.7-2毫巴(mbar) (對應(yīng)于525mT0RR-1500mT0RR)的真空壓力。如本文所討論-此0 · 7-2mbar的真空壓力范圍的 使用可以視作本文中本發(fā)明的方法的必要要素。如本文所討論-其僅通過在步驟(e)中在此 0.7-2mbar的真空壓力范圍內(nèi)工作就得到了本文令人滿意的用于干燥本文相關(guān)LAB的方法。 [0035]在W02010/138522A2或任何其他本文相關(guān)的本發(fā)明人已知的現(xiàn)有技術(shù)中沒有記載 或提示如在本文步驟(e)中所進(jìn)行的此0.7-2mbar范圍的使用。
[0036]簡言之，提出本發(fā)明的干燥方法代表了相對于例如W02010/138522A中直接和明確 地記載的干燥方法的顯著改進(jìn)。
[0037]因此，本發(fā)明的第一個方面涉及一種制備干粉組合物的方法，所述干粉組合物包 含：
[0038] (i):108-1014cfu/g組合物的乳酸菌(LAB)細(xì)胞;和
[0039] (ii)2g_40g的量的一種或多種保護(hù)劑-其中一種或多種保護(hù)劑的量相對于該干燥 組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定，
[0040]其中所述制備干粉組合物的方法包括以下步驟：
[0041 ] (a):發(fā)酵所述LAB細(xì)胞和收獲所述細(xì)胞以得到包含所述LAB細(xì)胞和水的LAB細(xì)胞濃 縮物-其中所述濃縮物包含1 〇8_l〇14cf u/g濃縮物干物質(zhì)的乳酸菌(LAB)細(xì)胞；
[0042] (b):將適當(dāng)量的一種或多種保護(hù)劑與所述LAB細(xì)胞濃縮物混合以形成漿料-其中 所述漿料包含2g_40g的量的一種或?qū)τ诒Ｗo(hù)劑-其中一種或多種保護(hù)劑的量相對于所述漿 料中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定，并且一種或多種保護(hù)劑和乳酸菌細(xì)胞的量兩者均以漿料中的干物 質(zhì)被測量；
[0043] (c):冷凍所述漿料以形成固體冷凍顆粒/小丸；
[0044] (d):用2kg/m2-50kg/m2的冷凍顆粒/小丸裝載托盤以在所述托盤上得到本文相關(guān) 的材料；
[0045] (e):在其中材料的溫度不會達(dá)到那么高以致超過75%的所述LAB細(xì)胞失活的溫度 下，在0.7-2毫巴(mbar)的真空壓力下初次干燥所述托盤上的材料，持續(xù)一時間段直至步驟 (b)的漿料的至少90%的水被移除；以及
[0046] (f):在其中材料的溫度不會達(dá)到那么高以致超過75%的所述LAB細(xì)胞失活的溫度 下，在0.01-0.6毫巴(mbar)的真空壓力下二次干燥步驟(e)的材料，持續(xù)足以將水活度(aw) 減少至小于0.30的時間段，從而獲得所述干粉組合物，所述干粉組合物包含：
[0047] (i): 108-1014cf u/g組合物的乳酸菌(LAB)細(xì)胞;和
[0048] (ii)2g_40g的量的一種或多種保護(hù)劑-其中一種或多種保護(hù)劑的量相對于所述干 燥組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定。
[0049] 術(shù)語"保護(hù)劑"在本文中應(yīng)當(dāng)理解為可以有助于改善感興趣乳酸菌細(xì)胞的儲存穩(wěn) 定性的任何試劑。關(guān)于如本文所述的干粉組合物和干燥這樣的干粉組合物的方法-術(shù)語"保 護(hù)劑"還可以被視作所述干粉組合物本身（其不是乳酸菌(LAB)細(xì)胞本身）中存在的任何試 劑。
[0050] 在本文上下文中如技術(shù)人員所理解-術(shù)語"其中一種或多種保護(hù)劑的量相對于所 述干燥組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定意指如果第一方面的干粉組合物例如包含2g乳酸菌 細(xì)胞，則所述干粉組合物還應(yīng)當(dāng)包含4g_80g的一種或多種保護(hù)劑-因為第一方面的方法提 到應(yīng)當(dāng)存在2g-40g的一種或多種保護(hù)劑/lg乳酸菌細(xì)胞。
[0051] 同樣，在本文上下文中如技術(shù)人員所理解-術(shù)語"以下所有量的保護(hù)劑均相對于組 合物中l(wèi)g活性乳酸菌細(xì)胞確定"意指如果所述組合物例如包含2g乳酸菌細(xì)胞，則所述組合 物應(yīng)當(dāng)例如還包含4_8g蔗糖。
[0052]由于所述組合物是干粉組合物-對于技術(shù)人員顯然的是對組合物的單一組分（例 如乳酸菌細(xì)胞和保護(hù)劑)所確定的量以干物質(zhì)測量。
[0053]如本文所述的組合物可以包括在合適的包裝中-例如，瓶子、盒子、小瓶、膠囊等。 在本文上下文中如技術(shù)人員將理解-當(dāng)本文提到組合物的重量(例如，稱到"g組合物"），則 提到所述組合物本身的重量-即，不包含合適的包裝的可能重量。
[0054]下面僅通過實施例的方式，描述本發(fā)明的實施方案。下面進(jìn)一步描述本文相關(guān)的 干燥組合物-其中可以說它們中的每一個的特征在于具體優(yōu)選的量的保護(hù)劑。
[0055]本發(fā)明的一個方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸菌細(xì) 胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對于 所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0056] (i) :2-5g蔗糖、l-3g麥芽糖糊精和0.75-2g抗壞血酸鈉。
[0057]本發(fā)明的第二方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸菌細(xì) 胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對于 所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0058] (i) :5-9g蔗糖、l-3g麥芽糖糊精和0.75-2g抗壞血酸鈉。
[0059]本發(fā)明的第三個方面涉及一種干燥組合物，其包含109_1013cfu/g組合物的乳酸菌 細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對 于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0060] (i): 3-6g蔗糖、4-8g海藻糖和0 · 0(優(yōu)選0 · 1 )-0 · 5g抗壞血酸鈉。
[0061]本發(fā)明的第四個方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸菌 細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對 于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0062] (i): 0.5-3.5g麥芽糊精、0.0(優(yōu)選0.1 )-0.5g抗壞血酸鈉、6-9g海藻糖和0.1-0.5g 改性淀粉。
[0063] 術(shù)語"改性淀粉"為技術(shù)人員所熟知，并且技術(shù)人員知曉感興趣的具體試劑是否是 改性淀粉。如技術(shù)人員所知-改性淀粉，也稱為淀粉衍生物，是通過物理處理、酶學(xué)處理或化 學(xué)處理天然淀粉制備的。本文中合適的市售改性淀粉是市售的Remy HC-P改性淀粉產(chǎn)品。 [0064]本發(fā)明的第五個方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸菌 細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對 于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0065] (i) :6-9g海藻糖、0· Ι-lg菊粉和0.5-3g水解酪蛋白。
[0066]本發(fā)明的第六個方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸菌 細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對 于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0067] (i): 0.5-3.5g麥芽糖糊精、0.0(優(yōu)選0.1 )-0.5g抗壞血酸鈉和2-5g海藻糖。
[0068]本發(fā)明的第七個方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸菌 細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對 于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0069] (i):2-5g蔗糖、1 ·5-3·5g麥芽糖糊精和0·0(優(yōu)選0· 1 )-0·5g抗壞血酸鈉。
[0070]本發(fā)明的第八個方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸菌 細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對 于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0071 ] (i):4.5-7.5g蔗糖、2.5-5.5g麥芽糖糊精和0.0(優(yōu)選0.1 )-0.5g抗壞血酸鈉。
[0072]本發(fā)明的第九個方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸菌 細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對 于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0073] (i): 2.5-5.5g麥芽糖糊精和0.0(優(yōu)選0.1 )-0.5g抗壞血酸鈉和4.5-7.5g海藻糖。
[0074]本發(fā)明的第十個方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸菌 細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對 于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0075] (i): 1 · 5-4· 5g麥芽糖糊精和0 · 0(優(yōu)選0 · 1 )-0 · 5g抗壞血酸鈉和3-6g海藻糖。
[0076]本發(fā)明的第十一個方面涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物的乳酸 菌細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相 對于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0077] (i): 0.5_3g麥芽糖糊精和0.0(優(yōu)選0.1 )-0.5g抗壞血酸鈉和l_4g海藻糖。
[0078]實驗結(jié)果已經(jīng)證明所有上述干燥組合物均具有非常良好的儲存穩(wěn)定性。
[0079] 總體上如本文所述的包含乳酸菌(LAB)細(xì)胞的組合物的具體優(yōu)選工業(yè)用途將通常 取決于所考慮細(xì)胞的具體特性。
[0080] 所述組合物可以給予人、動物或魚類用于促進(jìn)健康的目的。如果細(xì)胞具有益生性 質(zhì)這通常是最相關(guān)的，并且當(dāng)細(xì)胞是益生LAB細(xì)胞時特別相關(guān)。
[0081] 因此，本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及一種將乳酸菌(LAB)細(xì)胞給予人、動物或魚類的方 法，包括施用如本文所述的任一獨(dú)立干燥組合物方面的至少一種干燥組合物。
【附圖說明】
[0082]圖1示出在35°C的儲存溫度下在具有aw:0.3的嬰兒奶粉中的干酪乳桿菌43丨_和組 合物的儲存穩(wěn)定性。
[0083]圖2示出在35°C的儲存溫度下在具有aw:0.3的嬰兒奶粉中的6種不同的干酪乳桿 菌431?組合物的儲存穩(wěn)定性。
[0084] 圖3示出在35°C的儲存溫度下在具有aw:0.3的嬰兒奶粉中的干酪乳桿菌431?組 合物的儲存穩(wěn)定性。
[0085] 圖4示出在35°C的儲存溫度下在具有aw:0.3的嬰兒奶粉中的IGGK組合物的儲存 穩(wěn)定性。
[0086] 圖5示出在40°C的儲存溫度下在具有aw:0.3的嬰兒奶粉中的干酪乳桿菌431?組 合物的儲存穩(wěn)定性。
[0087] 圖6示出在40 °C的儲存溫度下在具有aw: 0.3的嬰兒奶粉中的LGG⑧組合物的儲存 穩(wěn)定性。
[0088] 圖7示出在35 °C的儲存溫度下在具有aw: 0.25的嬰兒奶粉中的LGCdt組合物的儲 存穩(wěn)定性。
【具體實施方式】 [0089] 干粉組合物
[0090] 技術(shù)人員理解在本文上下文中干燥組合物的含義。為了定量對其說明-如本文所 述的干粉組合物的水活度(aw)小于0.30。更優(yōu)選地-如本文所述的干粉組合物的水活度(a w) 小于0.25,甚至更優(yōu)選地小于0.20和最優(yōu)選地如本文所述的干粉組合物的水活度(aw)小 于0.15。技術(shù)人員知曉如何確定如本文所述的干燥組合物的水活度(a w)。
[0091] 技術(shù)人員知曉如何制備如本文所述的干燥組合物。如本文所述的干燥組合物的制 備涉及例如將細(xì)胞培養(yǎng)物與保護(hù)劑混合。第二步驟涉及干燥所述混合物。所述干燥可以通 過冷凍干燥、噴霧干燥、改進(jìn)的噴霧干燥和/或真空干燥來進(jìn)行。其他干燥方式也是可能的。
[0092] 在冷凍干燥或真空干燥的情況下，混合物優(yōu)選地通過本領(lǐng)域中已知的方法形成小 丸。一種方法可以是使混合物的小滴落入液氮中。形成小丸的另一種方法可以是通過擠壓。 所述小丸可以隨后使用上述干燥方法進(jìn)行干燥。優(yōu)選地，所述組合物使用本文所述的用于 制備干粉組合物的方法進(jìn)行干燥。
[0093]干燥組合物可以是粉末形式。
[0094]干燥組合物的重量（例如，稱為"g組合物"）通常將取決于不同的因素諸如組合物 的用途(例如，用于制備如下面所討論的嬰兒奶粉產(chǎn)品）。
[0095]如本文所述的干燥組合物的重量可以例如為lg-1000kg。
[0096] 例如-如果干燥組合物要用作嬰兒產(chǎn)品-則所述干燥組合物通常與奶粉和其他補(bǔ) 充劑混合以得到包含乳酸菌細(xì)胞的嬰兒奶粉產(chǎn)品。
[0097] 如技術(shù)人員已知-嬰兒奶粉產(chǎn)品的生產(chǎn)可以以相當(dāng)大的規(guī)模進(jìn)行-例如通過將1-l〇kg的如本文所述的干燥組合物與合適量的奶粉和其他補(bǔ)充劑混合。
[0098] 因此，優(yōu)選地，如本文所述的干燥組合物的重量可以為50g_10000kg，諸如例如 100g-1000kg或lkg-5000kg或100kg-1000kg。
[0099] 如在本文上下文中對于技術(shù)人員顯然是-為了在第一方面的方法的步驟(f)中獲 得具有例如l〇〇kg的重量的干粉組合物-需要在第一方面的步驟(b)中使用相應(yīng)相對高的量 的LAB細(xì)胞濃縮物和在第一方面的步驟(c)中使用相應(yīng)相對高的量的一種或多種保護(hù)劑。
[0100] 本發(fā)明的干粉組合物可以被包封，例如，在明膠膠囊中，或被配制成例如片劑，或 小袋(sachet)。如果所述組合物用于膳食補(bǔ)充劑中，則這個方面是特別相關(guān)的。
[0101] 乳酸菌細(xì)胞
[0102] 可優(yōu)選地是，如本文所述的干粉組合物包含109-1013Cfu/g組合物的乳酸菌(LAB) 細(xì)胞。
[0103] 乳酸菌(LAB)細(xì)胞可以原則上是感興趣的任何合適的LAB細(xì)胞。
[0104] 優(yōu)選地，LAB細(xì)胞是益生細(xì)胞。
[0105] 表述"益生細(xì)胞"是指這樣的一類細(xì)胞(例如，微生物），其被定義為通過改善宿主 人類或動物的胃腸微生物平衡來有益地影響宿主人類或動物的微生物食品或飼料補(bǔ)充劑。 已知的有益效應(yīng)包括由于益生生物體的耗氧和產(chǎn)酸所引起的針對有害微生物菌群的定植 抗性的提高。在研究中顯示了益生活性生物體防止?jié)撛诓≡w的過度生長并因此防止腹瀉 的功效的實例，在該研究中向在埃及旅行的旅行者給予含有有活力的益生活性生物體的膠 囊導(dǎo)致對旅行者腹瀉的39.4%保護(hù)率(Black等人1989)。對益生菌和它們在人類和動物中 的效應(yīng)的綜述可參見Fuller ,1989和1994。
[0106] 在本文上下文中，表述"乳酸菌"是指一組革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、不動的、 微需氧的或厭氧的細(xì)菌，其發(fā)酵糖(包括乳糖），產(chǎn)生酸類包括乳酸作為主要產(chǎn)生的酸、乙 酸、甲酸和丙酸。下文中說明優(yōu)選的LAB。
[01 07] 工業(yè)上最有用的乳酸菌發(fā)現(xiàn)于乳球菌屬（L a c t 〇 c 〇 c c u s )種、鏈球菌屬 (Streptococcus)種、腸球菌屬(Enterococcus)種、乳桿菌屬(Lactobacillus)種、明串珠菌 屬(Leuconostoc)種、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)種、丙酸菌(Propioni)和片球菌屬 (Pediococcus)種。因此，在優(yōu)選的實施方案中，乳酸菌選自由這些乳酸菌組成的組。
[0108]在優(yōu)選的實施方案中，乳酸菌是選自由下列組成的組中的乳酸菌：鼠李糖乳桿菌、 乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lacti s subsp . lact i s )、乳酸乳球菌乳脂亞種 (Lactococcus lactis subsp · cremoris)、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis)、腸膜明串珠 菌乳月旨亞種（Leuconostoc me sent ero ides subsp · cremoris)、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰生物突變株（Lactococcus lactis subsp · lactis biovar .diacetylactis)、干酪乳桿菌干酪亞種（Lactobacillus casei 81^8卩.〇386；〇、嗜熱鏈球菌（31：代卩1：0〇0〇〇118 1：1161'1110卩11；[1118)，腸球菌屬，諸如屎腸球菌 (Enterococcus faecum)、動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animal is)、乳雙歧桿菌 (Bifidobacterium lactis)、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)、乳酸乳桿菌 (Lactobacillus lactis)、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、發(fā)酵乳桿菌 (Lactobacillus fermentum)、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius)、德氏乳桿菌保加 利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)和嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)。在此組內(nèi)，最優(yōu)選的乳酸菌是鼠李糖乳桿菌。
[0109]所述組合物可包含乳酸菌的一種或多種菌株，所述菌株可以選自包含下列的組： Β·Β-1:2.?.(動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalis subsp lactis)BB-12?)、 DSM 15954;ATCC 29682、ATCC 27536、DSM 13692和DSM 10140、LA-5_? (嗜酸乳桿菌 LA-5? )、DSM 13241、LGG?(鼠李糖乳桿菌LGG? )、ATCC 53103、GR-1? (鼠李糖乳桿 菌GR-丨 ?)、ATCC 55826、.RC-14? (羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri) R.C-14?)、 ATCC 55845、干酪乳桿菌（L.casei)431?(類干酪乳桿菌類干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.pracasei)干酷乳桿菌 431·?)、ΑΤ(Χ 55544、F.1.9?(類干酷乳桿菌 (Lactobacillus paracasei ) F1.9?)、LMG_ 17806、Τ?-4.?:(嗜熱鏈球菌TH-4:?)、DSM 15957、PCC? (發(fā)酵乳桿菌PCC? )、匪02/31074、LP-33? (類干酪乳桿菌類干酪亞種 LP-33?:)、CCTCC M204012。
[0110] LAB培養(yǎng)物可以是"混合乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物"或"純?nèi)樗峋?LAB)培養(yǎng)物"。術(shù)語"混 合乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物"，或"LAB"培養(yǎng)物，是指包含兩種以上不同的LAB種的混合培養(yǎng)物。術(shù) 語"純?nèi)樗峋?LAB)培養(yǎng)物"是指包含僅單一 LAB種的純培養(yǎng)物。因此，在一個優(yōu)選的實施方 案中，LAB培養(yǎng)物是選自由這些培養(yǎng)物組成的組的LAB培養(yǎng)物。
[0111] LAB培養(yǎng)物可以是在與保護(hù)劑混合前經(jīng)洗滌的或未洗滌的。如果所述組合物包含 藻酸鹽諸如藻酸鈉，則經(jīng)常需要在添加保護(hù)劑之前用軟化水洗滌細(xì)胞以避免形成藻酸鈣。
[0112] 保護(hù)劑
[0113] 術(shù)語"保護(hù)劑"在本文中應(yīng)當(dāng)理解為可以有助于改善感興趣的乳酸菌細(xì)胞的儲存 穩(wěn)定性的任何試劑。關(guān)于如本文所述的干粉組合物和干燥這樣的干粉組合物的方法-術(shù)語 "保護(hù)劑"還可以被視作所述干粉組合物本身(其不是乳酸菌(LAB)細(xì)胞本身）中存在的任何 試劑。
[0114]可優(yōu)選的是，第一方面的第（ii)點(diǎn)的一種或多種保護(hù)劑的量是4g_20g，諸如5g-15g或6g-12g。
[0115] 在優(yōu)選的實施方案中-至少30% (更優(yōu)選至少50%，甚至更優(yōu)選至少70% (諸如例 如至少80%或至少90%)的第一方面的第（i i)點(diǎn)的保護(hù)劑是碳水化合物。
[0116] 優(yōu)選地，所述碳水化合物是糖類且優(yōu)選的糖類是例如蔗糖、麥芽糖糊精、海藻糖 和/或菊粉。
[0117] 在本文的工作實施例中描述了LAB組合物的干燥，其中超過80 %的保護(hù)劑是糖類， 因為所述組合物包含75.3g海藻糖+5.0g菊粉/100g存在于組合物中的所有保護(hù)劑。
[0118] 此外，下面討論了本文中其他優(yōu)選的干粉LAB組合物，其中超過70%的保護(hù)劑是糖 類。不受限于理論-據(jù)信所有這些本文所述的"超過70%的保護(hù)劑是糖類"的LAB組合物具有 非常良好的儲存穩(wěn)定性-換句話說，通過使用(如本文中所述)相對高的量的碳水化合物(諸 如例如糖類)作為保護(hù)劑，可以獲得具有商業(yè)上相關(guān)的非常良好的儲存穩(wěn)定性的干粉LAB組 合物(例如，用作嬰兒奶粉中的組分）。
[0119] 當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語"嬰兒"是指大約出生至12個月的年齡的人。在本文上下 文中，術(shù)語"嬰兒配方"是指液體或粉末狀形式的組合物，其作為人奶的替代品滿足嬰兒的 營養(yǎng)物需求。這些制劑受EU和US規(guī)章管理，所述規(guī)章規(guī)定了大量營養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)和 其他成分水平，以試圖模擬人母乳的營養(yǎng)和其他性質(zhì)。顯然，所述配方應(yīng)當(dāng)不含有任何潛在 致敏性物質(zhì)。因此，當(dāng)使用水解酪蛋白時，其應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地被水解以致超過90 %的肽具有小于 1，000道爾頓的分子量，超過97 %的具有小于2，000道爾頓的分子量。
[0120] 當(dāng)在本文中使用時，"兒童"被定義為高于約12個月齡至約12歲的人。本發(fā)明的嬰 兒奶粉組合物可以用于嬰兒配方、后續(xù)配方(f〇ll〇w-〇n formula)、成長奶（growing up milk)和特殊配方（special formula)以及用于嬰兒和兒童的營養(yǎng)產(chǎn)品以改善其腸道微菌 群同時向嬰兒或兒童提供營養(yǎng)。
[0121] 在此合適的保護(hù)劑是選自由下列組成的組的保護(hù)劑:抗壞血酸鈉、改性淀粉、水解 酪蛋白和藻酸鹽(例如藻酸鈉）。
[0122] 藻酸，也稱為藻膠(algin)或藻酸鹽，是廣泛分布在褐藻的細(xì)胞壁中的陰離子多 糖。藻酸鹽作為藻酸的鈣鹽、鎂鹽和鈉鹽存在于褐藻的細(xì)胞壁中。藻酸與單價陽離子形成水 溶性鹽但在酸化作用下沉淀。
[0123] 許多二價陽離子特別是Ca2+、Sr2+和Ba2+的藻酸鹽，在水中是不溶的并且當(dāng)NaAlg 的鈉離子被二價和三價陽離子替換時可以被制備。此性質(zhì)用于從藻類中分離藻酸。提取過 程的目的是獲得干燥的、粉末狀的藻酸鈉。鈣鹽和鎂鹽不溶于水，而鈉鹽則溶于水。
[0124]由于它們的物理和化學(xué)性質(zhì)，藻酸的單價鹽諸如hydrogen alginate(藻酸氫， HAlg)、藻酸鉀(KaAlg)和藻酸鈉(NaAlg)，已經(jīng)廣泛用于食品加工、醫(yī)藥工業(yè)中。相反，藻酸 鈣是不溶于水的、膠狀的、奶油色物質(zhì)，其可以通過向藻酸鈉水溶液中添加水性氯化鈣來生 成。
[0125] 當(dāng)所述組合物要用于嬰兒奶粉中時，優(yōu)選的是其不包含改性淀粉或多糖諸如藻酸 鈉，因為作為從藻類中提取的產(chǎn)物，藻酸鈉不被批準(zhǔn)在用于小于1歲的嬰兒的嬰兒奶粉(嬰 兒配方）中使用。因此原因，已準(zhǔn)備了許多不含藻酸鹽的組合物的比較，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如在 實施例中所證明，這些組合物表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。在含有和不含有藻酸鹽的組合物之間 已經(jīng)進(jìn)行了進(jìn)一步的比較試驗，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)就穩(wěn)定性而言，在含有或不含有藻酸鹽的組 合物之間基本上沒有差異。
[0126] 使用如上所述作為從藻類中提取的產(chǎn)物的藻酸鹽的重大缺點(diǎn)是關(guān)于粘度而言具 有很大的批次-批次間的變化，并且該產(chǎn)物可能含有細(xì)菌，意味著不得不施加一些處理，例 如熱處理以便使所述細(xì)菌失活。熱處理可以是溫度和持續(xù)時間的任何指定組合，其實現(xiàn)log 6或更多的減少(F0值等于或大于6)，即其可以是在具有加熱罩的加壓罐中的間歇熱處理， 利用直接進(jìn)入保護(hù)劑溶液中的無菌蒸汽注入/凝結(jié)（均在110-121Γ相當(dāng)長的持續(xù)時間）或 連續(xù)通過UHT-處理裝置(在高溫下短持續(xù)時間，即在132 °C 30秒）。
[0127] 此處理導(dǎo)致藻酸鹽的解聚，并且熱處理通常對含有藻酸鈉的組合物的穩(wěn)定性有負(fù) 面的影響，如實施例9中所證明。
[0128] 因此，與本領(lǐng)域中的常規(guī)教導(dǎo)在組合物中包含藻酸鹽諸如藻酸鈉用于在嚴(yán)厲條件 期間穩(wěn)定化和保護(hù)活細(xì)菌相反，出于上述原因提供不包含藻酸鹽諸如藻酸鈉的組合物是有 利的。因此，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地不包含藻酸鹽諸如藻酸鈉。
[0129] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g組合物 的乳酸菌細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù) 劑均相對于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0130] (i):6_9g 海藻糖，
[0131] 0.1-lg 菊粉和
[0132] 0.5_3g水解酪蛋白，并且其特征在于
[0133] 其不包含藻酸鹽。
[0134] 具體地，所述組合物不包含藻酸氫、藻酸鉀或藻酸鈉。
[0135] 在特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的干燥組合物包含75-80% (w/w)海藻糖、 3-10% (w/w)菊粉和15-20% (w/w)水解酪蛋白，并且不包含藻酸鹽諸如藻酸鈉。
[0136] 在本說明書和權(quán)利要求書中關(guān)于組合物和方法所述的全部公開內(nèi)容顯然地關(guān)于 上述優(yōu)選的實施方案和特別優(yōu)選的實施方案而被涵蓋在內(nèi)。具體地，本發(fā)明涉及包含根據(jù) 上述優(yōu)選實施方案和特別優(yōu)選的實施方案的組合物的嬰兒奶粉、食品或膳食補(bǔ)充劑。
[0137] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備根據(jù)本發(fā)明的干燥組合物的方法，其中制備所述干燥組合 物的方法包括以下步驟：
[0138] (a):發(fā)酵所述LAB細(xì)胞和收獲所述細(xì)胞以得到包含所述LAB細(xì)胞和水的LAB細(xì)胞濃 縮物-其中所述濃縮物包含1 〇8_l〇14cf u/g濃縮物干物質(zhì)的乳酸菌(LAB)細(xì)胞；
[0139] (b):將適當(dāng)量的一種或多種保護(hù)劑與所述LAB細(xì)胞濃縮物混合以形成漿料-其中 所述漿料包含6_9g海藻糖、Ο.Ι-lg菊粉和0.5-3g水解酪蛋白的量的保護(hù)劑并且不包含藻酸 鹽-其中所述保護(hù)劑的量相對于所述漿料中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定，并且保護(hù)劑和乳酸菌細(xì)胞 的量兩者均以衆(zhòng)料中的干物質(zhì)被測量；
[0140] (c):冷凍所述漿料以形成固體冷凍顆粒/小丸；
[0141] (d):用2kg/m2-50kg/m2的冷凍顆粒/小丸裝載托盤以在所述托盤上得到本文相關(guān) 的材料；
[0142] (e):在其中材料的溫度不達(dá)到那么高以致超過75%的所述LAB細(xì)胞失活的溫度 下，在0.7-2毫巴(mbar)的真空壓力下初次干燥所述托盤上的材料，持續(xù)一時間段直至步驟 (b)的漿料的至少90%的水被移除；以及
[0143] (f):在其中材料的溫度不達(dá)到那么高以致超過75%的所述LAB細(xì)胞失活的溫度 下，在0.01 -0.6毫巴（mbar)的真空壓力下二次干燥步驟(e)的材料，持續(xù)足以將水活度 (aw)減少至小于0.30的時間段，從而獲得所述干粉組合物，所述干粉組合物包含：
[0144] (i)109-1013cfu/g組合物的乳酸菌細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下 列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）：
[0145] 6_9g 海藻糖，
[0146] Ο.Ι-lg 菊粉和
[0147] 0.5_3g水解酪蛋白，并且其特征在于
[0148] 其不包含藻酸鹽。
[0149] 與其中組合物包含藻酸鈉的方法相比，混合步驟b)較為容易，因為漿料具有較低 的粘度，并且還較容易在步驟c)中制粒，意味著顆粒常常是均質(zhì)的并且具有適宜的尺寸，如 下面關(guān)于步驟c)的進(jìn)一步詳細(xì)解釋那樣，甚至無需研磨步驟。
[0150] 向組合物中添加其他化合物:
[0151 ]如本文所述的干燥組合物可以包含感興趣的另外的化合物。
[0152]這可以例如是維生素(例如，生育酚)或可能感興趣在最終組合物中存在的其他化 合物。此類化合物的實例可以是去濕劑諸如例如馬鈴薯淀粉。
[0153] 盡管上述干燥方法是優(yōu)選的，但如上所述存在可替代的方法。取決于待使用何種 干燥方法，添加粘度調(diào)節(jié)劑可能是必不可少的。如果例如計劃真空帶式干燥，則增加粘度可 能是必不可少的。相反地，如果計劃噴霧干燥，則降低粘度可能是必不可少的。
[0154] 粘度調(diào)節(jié)劑的合適實例是例如水(用于降低粘度）、果膠、預(yù)糊化淀粉、樹膠(例如， 阿拉伯樹膠、黃原膠、瓜爾豆膠、刺槐豆膠）、甘油(例如，丙三醇）；二醇類(例如，聚乙二醇、 丙二醇）；植物來源的蠟(例如，巴西棕櫚蠟、米糠蠟、小燭樹蠟），非植物蠟(蜂蠟）；卵磷脂； 植物纖維;脂質(zhì);和硅石(例如，二氧化硅）。
[0155] 根據(jù)本發(fā)明的組合物的用途:
[0156] 總體上如本文所述的含有細(xì)胞的組合物的具體優(yōu)選的工業(yè)用途將通常取決于所 考慮的細(xì)胞的具體特性。
[0157] 所述組合物可以給予人、動物或魚類用于促進(jìn)健康的目的。如果細(xì)胞具有益生性 質(zhì)這通常是最相關(guān)的，并且當(dāng)細(xì)胞是益生LAB細(xì)胞時特別相關(guān)。
[0158] 本發(fā)明的優(yōu)選制劑是嬰兒奶粉的形式，據(jù)此組合物與奶粉混合。如本領(lǐng)域中已知-奶粉還可以包含其他補(bǔ)充劑。
[0159] 另一用途涉及在谷類諸如堅果麥片(muesli)或其他干食品中使用如本文所述的 組合物。
[0160]因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及食品，諸如谷類、堅果麥片條、糖棒（candy bar)或巧克力棒，其摻入了根據(jù)本發(fā)明的組合物。其還可以用于計劃在飲料諸如運(yùn)動飲料 或能量飲料中混合的粉末(例如，所謂的運(yùn)動粉(sport powder))中。
[0161] 在另一方面，本發(fā)明涉及包含如本文所述的干燥組合物的膳食補(bǔ)充劑。
[0162] 下面討論更多的本文相關(guān)的合適保護(hù)劑的實例。
[0163] 在本文中使用的保護(hù)劑通常是在本領(lǐng)域中一般用作例如低溫添加劑的那些，例 如，糖類，諸如海藻糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖或葡萄糖;肌醇;或其他所謂的冷凍保護(hù) 劑，諸如聚乙二醇、二甲亞砜、甘油或右旋糖酐。優(yōu)選的保護(hù)劑是蔗糖和/或麥芽糖糊精。
[0164] 其他添加劑，例如抗氧化劑諸如抗壞血酸鹽也可以存在。為了本發(fā)明的目的，抗壞 血酸鹽可以稱為保護(hù)劑。
[0165] 如本文所討論-本文所述的用于制備干粉組合物的新方法的優(yōu)點(diǎn)是通過使用如本 文所述的方法，可以有效地干燥具有相對高的量的碳水化合物(諸如例如糖類)作為保護(hù)劑 的這種LAB組合物。
[0166] 發(fā)酵LAB細(xì)胞得到LAB細(xì)胞濃縮物-步驟(a)
[0167] 如上面所討論的-第一方面的方法的步驟(a)寫到：
[0168] "(a):發(fā)酵所述LAB細(xì)胞和收獲所述細(xì)胞以得到包含所述LAB細(xì)胞和水的LAB細(xì)胞 濃縮物-其中所述濃縮物包含1 〇8_l〇14cf u/g濃縮物干物質(zhì)的乳酸菌(LAB)細(xì)胞"
[0169] 對于技術(shù)人員來說發(fā)酵感興趣的LAB細(xì)胞以便例如大規(guī)模生產(chǎn)/生長所述LAB細(xì)胞 是常規(guī)工作。
[0170] 如本領(lǐng)域中已知的-收獲發(fā)酵的細(xì)胞通常涉及離心步驟以去除發(fā)酵培養(yǎng)基的相關(guān) 部分，從而得到LAB細(xì)胞濃縮物。
[0171] 如本領(lǐng)域中已知的-對于本文相關(guān)的LAB細(xì)胞生產(chǎn)，在此階段可以獲得具有約10% 細(xì)胞干物質(zhì)的LAB細(xì)胞濃縮物-即，所謂的10%濃縮物。則濃縮物的其余部分通常主要是水- 即，將存在約90 %的水。LAB細(xì)胞濃縮物當(dāng)然有時還可以含有較少的水-例如約50 %水。一般 地，步驟(b)中的LAB細(xì)胞濃縮物包含至少10% (諸如至少20%或至少50%)的水。在一些實 施方案中，濃縮物可以包含甚至少于10%干物質(zhì)，諸如在5-10%的范圍內(nèi)，例如約5%。
[0172]在本文上下文中，通過如本文所述的干燥方法被去除以獲得本文所述的干粉LAB 組合物的水基本上是LAB細(xì)胞濃縮物中的這種水。
[0173]在收獲細(xì)胞后-可優(yōu)選的是包括額外的洗滌步驟以便移除盡可能多的發(fā)酵培養(yǎng)基 組分/化合物本身-即以得到更"純的" LAB細(xì)胞濃縮物，其基本上僅包含LAB細(xì)胞本身。
[0174] 步驟(a)寫到："其中所述濃縮物包含108-1014cfu/g濃縮物干物質(zhì)的乳酸菌(LAB) 細(xì)胞"。術(shù)語"cfu/g干物質(zhì)"內(nèi)的術(shù)語"干物質(zhì)"應(yīng)當(dāng)如技術(shù)人員將在本文的上下文中對其理 解的那樣被理解-即，LAB濃縮物包含相對于LAB濃縮物的干物質(zhì)重量（即，不包括LAB濃縮物 中存在的液體的重量)的指定量的LAB細(xì)胞。
[0175] 如果需要，可以加入例如以固體冷凍顆粒/小丸形式冷凍LAB濃縮物的步驟，并且 LAB濃縮物可以作為冷凍濃縮物保持一段時間，然后被融化，并且該過程繼續(xù)步驟b)?？蛇x 地，該過程可以從步驟(b)開始，例如基于市售的LAB細(xì)胞濃縮物。
[0176] 將保護(hù)劑與LAB細(xì)胞濃縮物混合-步驟(b):
[0177] 如上面所討論的-第一方面的方法的步驟(b)寫到：
[0178] "(b):將適當(dāng)量的一種或多種保護(hù)劑與所述LAB細(xì)胞濃縮物混合以形成漿料-其中 所述漿料包含2g_40g的量的一種或?qū)τ诒Ｗo(hù)劑-其中所述一種或多種保護(hù)劑的量相對于所 述漿料中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定，并且一種或多種保護(hù)劑和乳酸菌細(xì)胞的量兩者均以漿料中的 干物質(zhì)被測量"。
[0179]術(shù)語"漿料"應(yīng)當(dāng)如技術(shù)人員將在本文的上下文中對其理解的那樣被理解-即，為 固體在液體中的相對稠的混懸液。
[0180] 對于技術(shù)人員來說，將合適量的保護(hù)劑與LAB細(xì)胞濃縮物混合以得到漿料中的想 要的保護(hù)劑濃度/量是常規(guī)工作。
[0181] 冷凍漿料以形成固體冷凍顆粒/小丸-步驟(c)
[0182] 如上面所討論的-第一方面的方法的步驟(c)寫到：
[0183] "(c):冷凍所述漿料以形成固體冷凍顆粒/小丸"。
[0184] 對于技術(shù)人員來說，進(jìn)行此冷凍漿料以形成固體冷凍顆粒/小丸步驟本身是常規(guī) 工作。如本領(lǐng)域中已知的-其可以利用例如液氮來完成，其中利用液氮冷凍漿料來得到固體 冷凍顆粒/小丸。
[0185] 如本文中的工作實施例中所示-本發(fā)明人測試了不同粒度的冷凍顆粒/小丸，并且 發(fā)現(xiàn)太大的顆粒不能得到令人滿意的干燥結(jié)果。因此，在優(yōu)選的實施方案中，步驟(c)中的 至少95% (更優(yōu)選至少97% )的冷凍顆粒/小丸是能夠穿過具有10mm的開口/孔最大尺寸的 篩網(wǎng)/篩的顆粒/小丸。
[0186] 更優(yōu)選地，步驟(c)中的至少95% (更優(yōu)選至少97%)的冷凍顆粒/小丸是能夠穿過 具有7.5mm的開口 /孔最大尺寸，更優(yōu)選具有5mm的開口 /孔最大尺寸和最優(yōu)選具有3mm的開 口 /孔最大尺寸的篩網(wǎng)的顆粒/小丸。
[0187] 對于技術(shù)人員來說，通過篩網(wǎng)篩分相關(guān)顆粒(在此是冷凍顆粒/小丸)是常規(guī)工作。 對于技術(shù)人員來說，測試特定的冷凍顆粒/小丸樣品是否是其中至少95% (更優(yōu)選至少 97%)的冷凍顆粒/小丸是能夠穿過具有指定的開口 /孔最大尺寸的篩網(wǎng)的顆粒/小丸的樣 品是常規(guī)工作。
[0188] 如本領(lǐng)域中已知的-可以簡單地將感興趣的特定冷凍顆粒/小丸樣品放置在合適 的篩網(wǎng)上，然后以適宜的方式移動/振動篩網(wǎng)直至沒有更多的顯著量的冷凍顆粒/小丸穿過 篩網(wǎng)-如果多于95%的冷凍顆粒/小丸已經(jīng)穿過了篩網(wǎng)，則該感興趣的特定冷凍顆粒/小丸 樣品是其中至少95%的冷凍顆粒/小丸是能夠穿過具有指定的開口 /孔最大尺寸的篩網(wǎng)的 顆粒/小丸的樣品。
[0189] 用冷凍顆粒/小丸裝載托盤-步驟(d):
[0190] 如上面所討論的-第一方面的方法的步驟(d)寫到：
[0191] "(d):用2kg/m2-50kg/m2的冷凍顆粒/小丸裝載托盤以在所述托盤上得到本文相關(guān) 的材料"。
[0192] 在優(yōu)選的實施方案中-第一方面的步驟(d)中的托盤裝載有5kg/m2-30kg/m2的冷凍 顆粒/小丸(諸如例如7kg/m 2-15kg/m2的冷凍顆粒/小丸）。
[0193] 在本文的上下文中，可以使用任何本文中合適的托盤。如已知的-有技術(shù)人員可用 的數(shù)種本文相關(guān)的合適托盤，其中這些托盤中的一些也是市售的。
[0194] 在本文上下文中如技術(shù)人員所理解的-托盤一般以下面的方式裝載冷凍顆粒/小 丸，其中在托盤中得到相對均勻/類似分布的冷凍顆粒/小丸-即，優(yōu)選地不使所有冷凍顆 粒/小丸位于例如僅托盤的一個邊緣處。
[0195] 對于例如工業(yè)相關(guān)地大規(guī)模生產(chǎn)相對大量的本文相關(guān)的干粉組合物（例如， 100kg-10000kg的干粉組合物)-在例如本文的裝載(d)中一般可優(yōu)選同時使用多于一個(諸 如例如多于10個或多于100個)托盤-即，其中在步驟(d)中多于一個(諸如例如多于10個或 多于100個)托盤裝載2kg/m 2-50kg/m2的冷凍顆粒/小丸。
[0196] 初次干燥-步驟(e):
[0197] 如上面所討論的-第一方面的方法的步驟(e)寫到：
[0198] "(e):在其中材料的溫度不達(dá)到那么高以致超過75%的所述LAB細(xì)胞失活的溫度 下，在0.7-2毫巴(mbar)的真空壓力下初次干燥所述托盤上的材料，持續(xù)一時間段直至步驟 (b)的漿料的至少90%的水被移除"。
[0199] 在本文上下文中可以使用任何本文中合適的真空干燥機(jī)設(shè)備。如已知的-有技術(shù) 人員可用的數(shù)種合適的真空干燥機(jī)設(shè)備，其中這些真空干燥機(jī)設(shè)備中的一些也是市售的。
[0200] 在優(yōu)選的實施方案中-真空干燥機(jī)設(shè)備是這樣的設(shè)備，其中該設(shè)備中的加熱是所 謂的輻照加熱。如技術(shù)人員已知的，輻照加熱被技術(shù)人員理解為不同于所謂的接觸加熱。如 技術(shù)人員已知的-可以通過例如靠近(但不直接接觸)包含待干燥材料的托盤定位加熱盤來 獲得輻照加熱。換句話說，關(guān)于初次干燥步驟（e)_在加熱盤和托盤之間存在空間（即，真 空）-即，托盤的加熱就是基于輻照加熱的。
[0201] 在優(yōu)選的實施方案中-托盤定位在兩個加熱盤之間，其中兩個加熱盤均向托盤提 供輻照加熱。
[0202] 對于例如工業(yè)相關(guān)地大規(guī)模生產(chǎn)相對大量的本文相關(guān)的干粉組合物（例如， 100kg-10000kg的干粉組合物)_在例如本文的干燥步驟(e)中一般可優(yōu)選同時使用多于一 個(諸如例如多于10個或多于1〇〇個)托盤-即，其中在步驟(e)中存在多于一個(諸如例如多 于10個或多于100個)包含待干燥材料的托盤。
[0203]簡言之，可以將此初次干燥(e)視為這樣的步驟，其中將可以被稱為"自由"水的水 (即，與可以被稱為"結(jié)合"水的水相反)移除。在本文上下文中-可以說在此步驟(e)中移除 的此"自由"水代表了在步驟(a)的LAB細(xì)胞濃縮物中存在的大部分水。還可以說此"自由"水 比"結(jié)合"水更容易移除，可以說在本發(fā)明的干燥方法的隨后二次干燥步驟(f)中該"結(jié)合" 水基本上主要被移除(參見下面對此"結(jié)合"水問題的進(jìn)一步討論）。
[0204]在此初次干燥步驟中，真空壓力為0.7-2毫巴(mbar)_這可以被視作此初次干燥步 驟(e)的必要要素。如在本文工作實施例中所討論的-本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到如果在此初次步 驟(e)中使用不同于0.7-2毫巴(mbar)范圍的真空壓力，則不能得到對如本文所述的LAB組 合物(即，具有相對高的量的保護(hù)劑)的本文令人滿意的干燥。
[0205] 簡言之，本發(fā)明人認(rèn)識到如果真空壓力低于0.7mbar，則可以說LAB濃縮物中的水 是如此的冷使得所有冷凍顆粒/小丸在此初次干燥步驟(e)的大部分時間段期間仍然是完 全冷凍的-即，可以說此步驟(e)則將是實際上100%所謂的凍干步驟-即，其中所有水通過 升華移除。本發(fā)明人認(rèn)識到為了移除實際上所有水，在此初次干燥步驟中，在本文上下文中 通過升華并不能得到令人滿意的結(jié)果。
[0206] 簡言之，本發(fā)明人認(rèn)識到如果真空壓力高于2mbar，則可以說LAB濃縮物中的水是 如此相對"熱"使得在此初次干燥步驟(e)的大部分時間段期間大部分的冷凍顆粒/小丸被 融化（即，不再冷凍）_并且本發(fā)明人認(rèn)識到對于在本文上下文中得到令人滿意的最終干燥 結(jié)果，這是不好的。
[0207] 如技術(shù)人員已知的-在2mbar壓力下，水（即，冰)的溫度為-12°C，在lmbar下水（即， 冰)的溫度為_20°C并且在0 · 7mbar壓力下，水(即，冰)的溫度為-24°C。
[0208] 特別在此初次干燥步驟（e)的開始時-一般待干燥材料具有大量的水，因為步驟 (a)的LAB濃縮物常常具有約例如90 %的水和約10 %的LAB細(xì)胞本身。
[0209] 因此，可以說，特別在此初次干燥步驟(e)的開始時，通常水的溫度將在一定程度 上控制待干燥材料的溫度。
[0210] 可以說，本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到0.7-2mbar的真空壓力范圍正是用于干燥本文相關(guān) 的LAB組合物(即，具有相對高的量的保護(hù)劑)的完美/最適范圍。
[0211]不受限于理論-此真空壓力范圍特別好的原因可能是因為在此壓力下，水的溫度 足夠得到步驟(c)的冷凍顆粒/小丸的相對有限的融化，但不存在有冷凍顆粒/小丸的太高 度的融化。不受限于理論-可以說，如果有限量的冷凍顆粒/小丸被融化（即，成為液體形 式)_則至少一些部分的水可以通過蒸發(fā)被移除。
[0212]因此，本文優(yōu)選的實施方案涉及步驟(e)中的有限（例如，至少0.5%至最大5%，更 優(yōu)選至少1%至最大4%)量的材料被融化為液體材料（即，非冷凍材料）。此外，優(yōu)選的是對 于初次干燥步驟(e)的大部分時間段(例如，至少3小時期間或至少6小時期間）是這樣的。
[0213] 技術(shù)人員通過簡單地觀察在例如冷凍顆粒/小丸的表面上存在有液體水而從視覺 上能夠確定是否步驟(e)中的有限量的材料被融化為液體材料(即，非冷凍材料）。
[0214] 如上面所討論的-在步驟(e)中寫到："在其中材料的溫度不達(dá)到那么高以致超過 75%的所述LAB細(xì)胞失活的溫度下"。
[0215] 對于技術(shù)人員來說，在步驟(e)的時間段期間連續(xù)地測量材料本身的溫度是常規(guī) 工作。一般-簡單地在步驟(e)的時間段期間使得在材料本身中存在一個或多個溫度計。
[0216]如上面所討論的-可以說特別在此初次干燥步驟(e)的開始時，通常水的溫度將在 一定程度上控制待干燥材料的溫度。
[0217]如上面所討論的-在步驟(e)中使用的0.7-2毫巴(mbar)壓力下，水（即，冰)溫度大 約為-24°C至_12°C。在此相對冷的溫度（即，大約_24°C至_12°C)下，通常沒有本文LAB細(xì)胞 的顯著失活。
[0218] 然而，在步驟(e)的時間段結(jié)束時-在此步驟(e)中例如97 %的所謂"自由"水可以 已經(jīng)被移除-即，在步驟(e)的此時間段比在步驟(e)的時間段開始時存在顯著更少的水。
[0219] 因此，可以說特別在步驟（e)的時間段的結(jié)束時，非常重要的是良好地控制對托 盤/材料可能施加的加熱-即，因此材料的溫度不會太高。
[0220] 在本文上下文中，技術(shù)人員將通常知曉什么可以被稱為感興趣的本文相關(guān)LAB的 熱穩(wěn)定性。換句話說，對于感興趣的本文相關(guān)LAB，確定材料的最大溫度應(yīng)當(dāng)為多少以便不 使太多的LAB細(xì)胞失活是常規(guī)工作。
[0221] 例如-當(dāng)?shù)谝环矫娴牡?ii)點(diǎn)的乳酸菌(LAB)細(xì)胞是乳桿菌屬細(xì)胞時-優(yōu)選的是第 一方面的步驟(e)和(f)的材料的溫度是不達(dá)到高于40°C的溫度。
[0222] 例如-當(dāng)?shù)谝环矫娴牡?ii)點(diǎn)的乳酸菌(LAB)細(xì)胞是動物雙歧桿菌乳亞種細(xì)胞時-據(jù)信在不使細(xì)胞的失活太高的情況下，所述溫度可以稍高一些-即，第一方面的步驟(e)和 (f)的材料的溫度是不達(dá)到高于例如50°C的溫度。
[0223] 如在本文上下文中明顯的是-在步驟（e)和步驟(f)中優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)盡可能少地使 LAB細(xì)胞失活。
[0224] 因此，優(yōu)選的實施方案涉及步驟(e)，其中材料的溫度不達(dá)到那么高以致多于50% 的LAB細(xì)胞失活，更優(yōu)選材料的溫度不達(dá)到那么高以致多于25%的LAB細(xì)胞失活，甚至更優(yōu) 選材料的溫度不達(dá)到那么高以致多于10%的LAB細(xì)胞失活并且最優(yōu)選材料的溫度不達(dá)到那 么高以致多于2 %的LAB細(xì)胞失活。
[0225] 在優(yōu)選的實施方案中-第一方面的步驟（e)的初次干燥在1-2毫巴（mbar)，諸如 1 · 1-1.7毫巴(mbar)的真空壓力下進(jìn)行。
[0226] 在優(yōu)選的實施方案中-在第一方面的步驟(e)的初次干燥中漿料的至少95 %的水 被移除，更優(yōu)選漿料的至少97%的水被移除和最優(yōu)選漿料的至少98%的水被移除。
[0227] 本文優(yōu)選的實施方案涉及其中第一方面的步驟(e)的時間段為3小時-60小時的時 段-更優(yōu)選5小時-36小時，甚至更優(yōu)選5小時-24小時(諸如例如7-15小時）。
[0228] 不受限于理論-據(jù)信對于本文工業(yè)相關(guān)的大規(guī)模生產(chǎn)，可能難以在少于3小時內(nèi)適 當(dāng)?shù)剡M(jìn)行初次干燥步驟(e)。不受限于理論-使用多于60小時用于干燥步驟(e)對于本文工 業(yè)相關(guān)的大規(guī)模生產(chǎn)一般將不是最適的。
[0229] 二次干燥-步驟(f):
[0230] 如上面所討論的-第一方面的方法的步驟(f)寫到：
[0231] "(f):在其中材料的溫度不達(dá)到那么高以致超過75%的所述LAB細(xì)胞失活的溫度 下，在0.01-0.6毫巴(mbar)的真空壓力下二次干燥步驟(e)的材料，持續(xù)足以將水活度(a w) 減少至小于0.30的時間段，從而獲得所述干粉組合物，所述干粉組合物包含：
[0232] (i):108-1014cfu/g組合物的乳酸菌(LAB)細(xì)胞;和
[0233] (ii)2g_40g的量的一種或多種保護(hù)劑-其中一種或多種保護(hù)劑的量相對于所述干 燥組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定。"
[0234] 如技術(shù)人員所理解-以上對于初次干燥步驟(e)所討論的許多技術(shù)問題也可以與 二次干燥步驟(f)相對應(yīng)地相關(guān)。例如-在步驟(f)中使用的真空干燥設(shè)備與步驟(e)中使用 的真空干燥設(shè)備常常相同（或非常相似）。
[0235] 簡言之，可以將此二次干燥(f)看做是這樣的步驟，其中將可以被稱為"結(jié)合"水的 水(即，與如通常在步驟(e)中被移除的可以被稱為"自由"水的水相反-參見上面的討論)移 除。如技術(shù)人員已知的-可以說"結(jié)合"水比"自由"水更難以移除-因此，與步驟(e)中相比， 在步驟(f)中使用更大的真空(較小的mbar壓力）。
[0236]本文優(yōu)選的實施方案涉及其中第一方面的步驟(f)的二次干燥在0.05-0.4毫巴 (mbar)，諸如0· 1-0.3毫巴(mbar)的真空壓力下進(jìn)行。
[0237] 在本文上下文中-約0.2mbar的壓力有時可以被稱為"全真空"。
[0238] 如上面所討論的-在步驟(e)和步驟(f)中應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地盡可能少地使LAB細(xì)胞失活。
[0239] 因此，優(yōu)選的實施方案涉及步驟(f)，其中材料的溫度不達(dá)到那么高以致多于50% 的LAB細(xì)胞失活，更優(yōu)選材料的溫度不達(dá)到那么高以致多于25%的LAB細(xì)胞失活，甚至更優(yōu) 選材料的溫度不達(dá)到那么高以致多于10%的LAB細(xì)胞失活并且最優(yōu)選材料的溫度不達(dá)到那 么高以致多于2 %的LAB細(xì)胞失活。
[0240] 如以上關(guān)于步驟(e)所討論的-當(dāng)?shù)谝环矫娴牡?ii)點(diǎn)的乳酸菌(LAB)細(xì)胞是乳桿 菌屬細(xì)胞時-優(yōu)選的是第一方面的步驟(e)和(f)的材料的溫度是不達(dá)到高于40°C的溫度。
[0241] 例如-當(dāng)?shù)谝环矫娴牡?ii)點(diǎn)的乳酸菌(LAB)細(xì)胞是動物雙歧桿菌乳亞種細(xì)胞時-據(jù)信在不使細(xì)胞的失活太高的情況下，所述溫度可以稍高一些-即，第一方面的步驟(e)和 (f)的材料的溫度是不達(dá)到高于例如50°C的溫度。
[0242] 如上面所討論的，在初次干燥步驟（e)的時間段結(jié)束時-此步驟(e)中所謂的"自 由"水的例如97%可以已經(jīng)被移除-即，在步驟(e)的結(jié)束時比在步驟(e)的時間段開始時存 在顯著更少的水。
[0243 ]就此而言-顯然在二次干燥步驟(f)期間存在相對少的水。
[0244] 因此，如果在此二次干燥步驟(f)中施加任何加熱-例如使用的加熱盤(對于例如 輻照加熱-見上)通常將被設(shè)定為非常接近期望是(待加熱)材料本身溫度的溫度的加熱溫 度。例如-如果步驟(f)中（待加熱)材料本身的溫度應(yīng)當(dāng)最大為例如37°C -則例如使用的加 熱盤將不設(shè)定為顯著高于此37°C的溫度。
[0245] 本文優(yōu)選的實施方案涉及其中第一方面的步驟(f)的時間段為3小時-60小時的時 段-更優(yōu)選5小時-36小時，甚至更優(yōu)選5小時-24小時(諸如例如7-15小時）。
[0246] 不受限于理論-據(jù)信對于本文工業(yè)相關(guān)的大規(guī)模生產(chǎn)，可能難以在少于3小時內(nèi)適 當(dāng)?shù)剡M(jìn)行初次干燥步驟(f)。不受限于理論-使用多于60小時用于干燥步驟(f)對于本文工 業(yè)相關(guān)的大規(guī)模生產(chǎn)一般將不是最適的。
[0247] 在優(yōu)選的實施方案中-步驟(f)的時間段是足以將水活度(aw)減少至小于0.25,更 優(yōu)選小于〇. 20和最優(yōu)選減少至小于0.15的時間段。
[0248] 技術(shù)人員知曉如何確定如本文所述的干燥組合物的水活度(aw)。
[0249] 其他任選步驟:
[0250] 如技術(shù)人員所理解的-如本文所討論的第一方面的干燥方法可以包括更多的任選 步驟。
[0251] 本文顯然相關(guān)的任選額外步驟將是例如適當(dāng)?shù)匕b步驟(f)中獲得的干粉組合 物。
[0252] 如本領(lǐng)域中已知的-所述包裝可以例如是瓶子、盒子、小瓶、膠囊等-優(yōu)選地所述包 裝是防水的以保持所述干粉組合物的低水活度。
[0253] 此外本文顯然相關(guān)的任選額外步驟包括步驟(f)中獲得的干粉LAB組合物用于本 文商業(yè)上相關(guān)用途的用途。
[0254] 只作為實例-商業(yè)上相關(guān)的用途可以例如是用作嬰兒奶粉，其中所述干粉LAB組合 物與奶粉混合-或用來制備乳制品。
[0255] 實施例
[0256] 材料和方法
[0257] 鼠李糖乳桿菌LGG?和類干酪乳桿菌類干酪亞種干酪乳桿菌431?的洗滌過的 濃縮物-獲自丹麥Chr. Hansen A/S
[0258] 海藻糖來自 Cargill 名稱：Treha 16400
[0259] 酶水解酪蛋白來自DMV International
[0260] 藻酸鈉來自FMC BioPolymer:Manugel?DMB
[0261] 菊粉來自 BENEO-ORAFTI: 〇rafti?GR
[0262] 麥芽糖糊精:Glucidex IT 12,來自Roquette
[0263] 抗壞血酸鈉來自Northeast Pharmaceutical group Co.，
[0264] 鹿糖來自Nordic Sugar:Granulated sugar 550
[0265] Remy HC-P(預(yù)糊化大米)淀粉，嬰兒食品級，來自Beneo-remy NV
[0266] 嬰兒奶粉是源自Mead Johnson LCC,Evansville，IN的EnfaGrow〇
[0267] 實施例1:
[0268] LAB組合物的干燥
[0269] 乳酸菌(LAB)細(xì)胞是市售的乳桿菌屬細(xì)胞LGG?:-可獲自丹麥的Chr.Hansen A/ So
[0270] 真空干燥機(jī)設(shè)備是這樣的設(shè)備，其中該設(shè)備中的加熱是所謂的輻照加熱。托盤定 位在兩個加熱盤之間，其中兩個加熱盤均向托盤提供輻照加熱。
[0271] 步驟(a):
[0272] 獲得lkg LAB細(xì)胞濃縮物-其包含大約10%細(xì)胞干物質(zhì)-即，所謂的具有約90%水 的10 %濃縮物。
[0273] 步驟(b):
[0274] 1kg保護(hù)劑混合物（該混合物包含30g藻酸鈉;50g菊粉、753g海藻糖和167g酪蛋白 水解物)與LAB細(xì)胞濃縮物混合。
[0275] 因此，獲得了漿料，所述漿料包含約10g的量的保護(hù)劑-其中保護(hù)劑的量相對于漿 料中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定，并且保護(hù)劑和乳酸菌細(xì)胞的量兩者均以漿料中的干物質(zhì)測量。
[0276] 步驟(c):
[0277] 將漿料冷凍以形成固體冷凍顆粒/小丸。
[0278] 這通過利用液氮完成。
[0279] 步驟(d):
[0280] 用10kg/m2的冷凍顆粒/小丸裝載托盤以在所述托盤上得到本文相關(guān)的材料。
[0281] 步驟(e):
[0282] 在不同的真空壓力下進(jìn)行對托盤上的材料的初次干燥，-一些在0.7-2毫巴(mbar) 的真空壓力范圍內(nèi)（例如，使用1.3mbar壓力)進(jìn)行，并且一些在此范圍之外進(jìn)行(例如，使用 2 · 5mbar壓力）。
[0283] 此步驟在其中材料的溫度不達(dá)到高于37°C的溫度下進(jìn)行。
[0284] 在此最大溫度下，顯著少于50%的LAB細(xì)胞失活。
[0285] 此步驟進(jìn)行一段時間直至步驟(b)的漿料的至少97%的水已經(jīng)被移除-這需要大 約12小時。
[0286] 步驟(f):
[0287 ]在0.2mbar的真空壓力下進(jìn)行步驟(e)的材料的二次干燥。
[0288]關(guān)于步驟(e)_此步驟也在其中材料的溫度不達(dá)到高于37°C的溫度下進(jìn)行。此步驟 進(jìn)行約12小時的時間段。
[0289]結(jié)果：
[0290]藍(lán)
[0291] 在兩種不同的壓力下的水活度和加工存活率(process survival)
[0292]
[0293] ~從表1看出在2.5mbar下干火喿的產(chǎn)品內(nèi)，水活^高于優(yōu)選值(〈0 . ?δ)，而在1.3mba^ 下干燥的樣品具有優(yōu)選的水活度。此外在1.3mbar下干燥的樣品的加工存活率高于在 2.5mbar下干燥的樣品。
[0294] 塾
[0295] 在不同的溫度下的水活度和加工存活率
[0296]

[0297] 從表2看出當(dāng)干燥溫度太高時（70°C)，水活度以及加工存活率均在不能接受的范 圍內(nèi)，而干燥溫度為50或60°C時水活度和加工存活率均沒有差異。在兩種情況下，值均在可 接受的范圍內(nèi)。
[0298] 對于此實施例-可以說本文變化的主要參數(shù)在初次干燥步驟(e)中-其中使用了不 同的真空壓力-一些在0 · 7-2毫巴(mbar)的真空壓力范圍內(nèi)（例如，使用1 · 3mbar壓力)進(jìn)行， 并且一些在此范圍之外進(jìn)行(例如，使用2.5mbar壓力）。
[0299]實驗結(jié)果實質(zhì)上證明當(dāng)使用在0.7_2mbar的范圍之外的真空壓力時沒有獲得對 LAB組合物的本文令人滿意的干燥。因前面所解釋的原因，壓力選擇為稍稍高于制劑的轉(zhuǎn)變 溫度。在實施例1中使用的制劑的轉(zhuǎn)變溫度為約-33°C。在2.5mbar下，溫度為約-10.5 °C，其 大大高于該轉(zhuǎn)變溫度。因此表1中的結(jié)果證明1.3mbar較為合適。
[0300] 當(dāng)真空壓力在0.7-2毫巴(mbar)的范圍內(nèi)（例如1.3mbar壓力）時，則能夠進(jìn)行適當(dāng) 的和有效的干燥以得到水活度U)為小于0.15的干燥配方組合物。
[0301] 結(jié)論：
[0302] 此實施例1的結(jié)果實質(zhì)上證明僅通過在步驟(e)中在0.7_2mbar的真空壓力范圍內(nèi) 工作就得到了本文令人滿意的用于干燥本文相關(guān)的包含相對高的量的保護(hù)劑的LAB組合物 的方法。
[0303] 實施例2:
[0304] 步驟(c)的冷凍顆粒/小丸的粒度
[0305] 基本上如實施例1中所述進(jìn)行實驗-但其中步驟（c)中的真空壓力保持恒定于約 1 · 3mbar壓力。
[0306] 在此實驗中，主要變量為步驟(c)的冷凍顆粒/小丸的粒度。
[0307] 進(jìn)行實驗，其中步驟(c)中的至少97%的冷凍顆粒/小丸是能夠穿過具有不同尺寸 的開口 /孔最大尺寸的篩網(wǎng)的顆粒/小丸。
[0308] 結(jié)果：
[0309] 實驗結(jié)果實質(zhì)上證明當(dāng)顆粒/小丸的尺寸大于10mm時，則不能獲得最佳的干燥結(jié) 果。
[0310]但當(dāng)顆粒/小丸的尺寸小于5mm時，則獲得了非常良好和有效的干燥。
[0311] 結(jié)論：
[0312] 此實施例2的結(jié)果實質(zhì)上證明本文中優(yōu)選的是步驟(c)中的至少95% (更優(yōu)選至少 97 % )的冷凍顆粒/小丸是能夠穿過具有10mm的開口 /孔最大尺寸(優(yōu)選具有5mm的開口 /孔 最大尺寸)的篩網(wǎng)的顆粒/小丸。
[0313] 實施例3:
[0314] 其他LAB組合物的干燥
[0315] 基本上重復(fù)實施例1，但使用其他LAB細(xì)胞和其他保護(hù)劑。還評價了在0.9/0.2mbar 的壓力以及32°C和37°C的加熱溫度下的干燥(對于含有和不含有藻酸鹽的制劑)并且對于 兩種溫度，干燥產(chǎn)物的水活度在干燥24小時后〈0.15。
[0316]不含藻酸鹽的制劑和含有蔗糖的制劑作為#7進(jìn)行實驗并且得到具有水活度〈0.15 和為約50 %的加工存活率的干燥產(chǎn)物。蔗糖制劑得到具有水活度〈0.3的干燥產(chǎn)物，但通過 增加干燥時間，水活度可以低的更多。
[0317]對于步驟(b)，在所有實驗中獲得了漿料，所述漿料包含約6g_15g的量的保護(hù)劑-其中保護(hù)劑的量相對于漿料中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定，并且保護(hù)劑和乳酸菌細(xì)胞的量兩者均以 漿料中的干物質(zhì)測量。
[0318] 對于所有實驗-至少50%的使用的保護(hù)劑是糖類。
[0319] 結(jié)論：
[0320]此實施例3的結(jié)果實質(zhì)上證明了與實施例1中相同的結(jié)論-即，僅通過在步驟(e)中 在0.7-2mbar的真空壓力范圍內(nèi)工作就得到了本文令人滿意的用于干燥本文相關(guān)的包含相 對高的量的保護(hù)劑的LAB組合物的方法。通過確定組合物的轉(zhuǎn)變溫度并將其與如上所解釋 的水蒸汽壓力表相關(guān)聯(lián)來選擇適合于各組合物的確切真空壓力范圍。
[0321] 可以說，此實施例3確認(rèn)了對不同LAB組合物的此結(jié)論，所述LAB組合物的特征可以 是包含相對高的量的作為保護(hù)劑的糖類。
[0322] 實施例4
[0323]制備不含藻酸鹽的制劑
[0324] 向一份LGG?濃縮物添加兩份軟化水并將所述濃縮物離心回最初的體積（約 1.27X1011活細(xì)胞/g)。下面使用的細(xì)胞濃縮物具有約10%細(xì)胞干物質(zhì)-即，所謂的10%濃縮 物。
[0325] 制劑1:向100g洗滌過的濃縮物添加30g蔗糖+17.5g麥芽糖糊精(Glucidex IT 12) +13g抗壞血酸鈉。將該混合物攪拌直至添加劑溶解。之后將該混合物真空干燥。
[0326]制劑2:向100g洗滌過的濃縮物添加70g蔗糖+17.5g麥芽糖糊精(Glucidex IT 12) +13g抗壞血酸鈉。將該混合物攪拌直至添加劑溶解。之后將該混合物真空干燥。
[0327] 制劑3:向100g洗滌過的濃縮物添加 37.4g蔗糖+60g海藻糖+2.6g抗壞血酸鈉。將該 混合物攪拌直至添加劑溶解。之后將該混合物真空干燥。
[0328] 參考1(參考制劑）：向100g洗滌過的濃縮物添加6g蔗糖+ 3.5g麥芽糖糊精 (Glucidex IT 12)+2.6g抗壞血酸鈉。將該混合物攪拌直至添加劑溶解。之后將該混合物真 空干燥。
[0329] 如果混合物在帶式真空干燥機(jī)中干燥，則可能必需添加小量的膠凝劑例如果膠以 得到適宜的粘度。
[0330] 實施例5
[0331] 在30°C在開口袋子中和在嬰兒奶粉中對不含藻酸鹽的；LGG?制劑的測試
[0332] 在儲存于30°C和30%RH的開口袋中以及在混合入具有0.3的水活度的嬰兒奶粉中 時測試產(chǎn)品的穩(wěn)定性。參見表3和表4中的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。使用含有如上面實施例4中所概述的 制劑1中的添加劑的量的20%的LGG⑩作為參考。將粉末濕潤以獲得〇. 27-0.30的水活度。
[0333] ^3
[0334] 在儲存于30 °C /30 % RH的開口袋子中的儲存。
[0335]
[0337] 樣品通過流式細(xì)胞儀測量(活細(xì)胞/g)。
[0338] 結(jié)論：
[0339] 從表3看出在參考1中發(fā)現(xiàn)最高的％活細(xì)胞損失。通過將保護(hù)劑的量以5倍增加，穩(wěn) 定性顯著增加(比較制劑1和參考1)。制劑2和3也證明了增加的穩(wěn)定性。
[0340] ^4
[0341] 在30°C在具有aw:0.3的Enfagrow中的儲存穩(wěn)定性。
[0342]
[0343] 在儲存前袋子用他吹掃并密封。
[0344] 結(jié)論：
[0345] 用制劑1-3制備的嬰兒奶粉具有比參考1更好的穩(wěn)定性。
[0346] 實施例6
[0347] 在35 °C對嬰兒奶粉中的不含藻酸鹽的類干酪乳桿菌類干酪亞種干酪乳桿菌 431?制劑的測試
[0348] 向一份類干酪乳桿菌類干酪亞種干酪乳桿菌431?濃縮物(LC 431)添加兩份軟化 水并將所述濃縮物離心回最初的體積(約1.27X1011活細(xì)胞/g)。下面使用的細(xì)胞濃縮物具有 約10 %細(xì)胞干物質(zhì)-即，所謂的10 %濃縮物。
[0349]制劑1LC 431:向10(^洗滌過的濃縮物添加30g蔗糖+17.5g麥芽糖糊精(Glucidex IT 12 ) + 13g抗壞血酸鈉。將該混合物攪拌直至添加劑溶解。之后將該混合物在液氮中制粒，然 后將其真空干燥。
[0350]將該混合物添加至嬰兒奶粉并且在儲存于30%RH和35°C的具有0.3的水活度的嬰 兒奶粉中測試產(chǎn)品的穩(wěn)定性。參見表3中的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。使用在上面實施例4中所概述的參 考1中含有LC 431的嬰兒奶粉作為參考。
[0351]莖
[0352]在35 °C在具有aw: 0.3的嬰兒奶粉中的儲存穩(wěn)定性 [0353]
[0354]在儲存前袋子用他吹掃并密封。
[0355] 結(jié)論：
[0356] 從表5和圖1看出，同樣對于干酪乳桿菌431?且在35°C的儲存溫度下，在參考1中 發(fā)現(xiàn)最高的％活細(xì)胞損失。同樣對于干酪乳桿菌43丨?,通過將保護(hù)劑的量以5倍增加，穩(wěn)定 性顯著增加。
[0357] 實施例7
[0358]在35°C對嬰兒奶粉中的不含藻酸鹽的6種不同的類干酪乳桿菌類干酪亞種干酪乳 桿菌431?制劑的測試
[0359]向一份干酪乳桿菌431?濃縮物添加兩份軟化水并將所述濃縮物離心回最初的體 積(約1.27X1011活細(xì)胞/g)。下面使用的細(xì)胞濃縮物具有約10%細(xì)胞干物質(zhì)-即，所謂的10% 濃縮物。將該混合物攪拌直至添加劑溶解。之后將該混合物在液氮中制粒，然后將其真空干 燥。
[0360]組合物1:向1000g洗滌過的濃縮物添加753g海藻糖+191g麥芽糖糊精+26g抗壞血 酸鈉+30g Remy HC-P。
[0361] 組合物2:向1000g洗滌過的濃縮物添加753g海藻糖+50g菊粉+167g水解酪蛋白。
[0362] 組合物3 :向1000g洗滌過的濃縮物添加366g海藻糖+213g麥芽糖糊精+26g抗壞血 酸鈉。
[0363] 組合物6:向1000g洗滌過的濃縮物添加615g海藻糖+358g麥芽糖糊精+26g抗壞血 酸鈉。
[0364] 組合物7 :向1000g洗滌過的濃縮物添加459g海藻糖+267g麥芽糖糊精+26g抗壞血 酸鈉。
[0365] 組合物8:向lOOOg洗滌過的濃縮物添加213g海藻糖+124g麥芽糖糊精+26g抗壞血 酸鈉。
[0366] 將各種組合物添加至嬰兒奶粉并且在用N2吹掃的密封袋子中在儲存于30%RH和 35°C的具有0.3的水活度的嬰兒奶粉中測試產(chǎn)品的穩(wěn)定性。參見表4和圖2中的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。 使用在上面實施例4中所述的參考1中含有干酪乳桿菌431?的嬰兒奶粉用作參考。
[0367] 塾
[0368]在具有aw:0.3的嬰兒奶粉中在35°C下的儲存穩(wěn)定性(對數(shù)活細(xì)胞/g)
[0369]
[0370] ~' '
' ' ' ' '
[0371] 從表6和圖2看出，對于干酪乳桿菌431?且在35°C的儲存溫度下，在參考1中發(fā)現(xiàn) 最高的％活細(xì)胞損失。所有測試的組合物且特別地組合物2證明了基本上提高的穩(wěn)定性。
[0372] 實施例8
[0373] 對于類干酪乳桿菌類干酪亞種（LC 431)和對于LGG?，比較含有和不含有藻酸 鹽的組合物
[0374] 如上所述制備LGG和類干酪乳桿菌類干酪亞種(LC 431)的10%濃縮物并將其加入 至組合物2或組合物2_(見下）。使用兩種不同的LGG?濃縮物和兩種不同的干酪乳桿菌 431?濃縮物以便測試可重復(fù)性。此外，制備兩種不同的制劑，兩種制劑之間的差異為組合 物2不包含藻酸鹽，而組合物_包含30g藻酸鈉/kg洗滌過的濃縮物。將混合物攪拌直至添 加劑溶解并在液氮中冷凍。之后將該混合物真空干燥。
[0375] 組合物2_:向lOOOg洗滌過的濃縮物添加753g海藻糖+50g菊粉+167g水解酪蛋白 +30g藻酸鈉。
[0376] ^7a
[0377] 在密封的袋子中在具有&|: 0.3的嬰兒奶粉中在35°C儲存后的儲存穩(wěn)定性數(shù)據(jù) (log(CFU/g)
[0378]

[0379] ^7b
[0380] 在密封的袋子中在具有&|: 0.3的嬰兒奶粉中在40°C儲存后的儲存穩(wěn)定性數(shù)據(jù) (log(CFU/g)
[0381]
[0382] 結(jié)論：
[0383] 從表7a和7b以及圖3-6,證明關(guān)于穩(wěn)定性在含有或不含有藻酸鈉的組合物之間基 本上沒有差異。
[0384] 實施例9
[0385] 對含有和不含有藻酸鹽的3LGG?組合物的熱處理
[0386] 如上面實施例8中所述制備LGG?的10%濃縮物并將其加入至組合物2或組合物 2_中。由于熱處理與生產(chǎn)規(guī)模產(chǎn)品相關(guān)，將兩種組合物進(jìn)行熱處理以比較含有或不含有 藻酸鹽的組合物的穩(wěn)定性。使用在上面實施例4中所述的參考1中含有LGG?的嬰兒奶粉 作為參考。
[0387] ^8
[0388] 在密封的袋子中在具有&|: 0.25的嬰兒奶粉中在35°C儲存后的儲存穩(wěn)定性數(shù)據(jù) (log(CFU/g)
[0389]
[0390] 結(jié)論：
[0391] 從表8和圖7,看出對于含有藻酸鈉的組合物，熱處理對穩(wěn)定性具有負(fù)面影響。
【主權(quán)項】
1. 一種干燥組合物，其包含109-1013cfu/g所述組合物的乳酸菌細(xì)胞，其中所述組合物 的特征在于其還包含下列量的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對于所述組合物中l(wèi)g乳酸 菌細(xì)胞確定）： 6-9g海藻糖， Ο.Ι-lg菊粉和 0.5-3g水解酪蛋白，并且 所述組合物不包含藻酸鹽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干燥組合物，其包含75-80% (w/w)海藻糖、3-10% (w/w)菊粉 和15-20% (w/w)水解酪蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的干燥組合物，其中所述乳酸菌是選自由下列組成的組的至 少一個乳酸菌的種：乳球菌屬(Lactococcus)種、鏈球菌屬（Streptococcus)種、腸球菌屬 (Enterococcus)種、乳桿菌屬(Lactobacillus)種、明串珠菌屬(Leuconos toe)種、雙歧桿菌 屬(Bifidobacterium)種、丙酸菌(Prop ioni)和片球菌屬(Pediococcus)種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的干燥組合物，其中所述乳酸菌是選自由下列組成的組的至少 一種乳酸菌：鼠李糖乳桿菌（Lac tobac i 11 us rhamnosus )、乳酸乳球菌乳酸亞種 (Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris)、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis)、腸膜明串珠菌乳脂亞種 (Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰生物突變株（Lactococcus lactis subsp · lactis biovar .diacetylactis)、干酪乳桿菌干酪亞種（Lactobacillus casei 81^8卩.〇386；〇、嗜熱鏈球菌（31：代卩1：0〇0〇〇118 1：1161'1110卩11；[1118)、腸球菌屬，諸如屎腸球菌 (Enterococcus faecum)、動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animal is)、乳雙歧桿菌 (Bifidobacterium lactis)、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)、乳酸乳桿菌 (Lactobacillus lactis)、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、發(fā)酵乳桿菌 (Lactobacillus fermentum)、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius)、德氏乳桿菌保加 利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)和嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的干燥組合物，其中所述乳酸菌是選自由下列組成的組的至少 一種乳酸菌：保藏為DSM 15954、ATCC 27536和DSM 10140的動物雙歧桿菌乳亞種 (Bifidobacterium animalis subsp lactis)，保藏為DSM 13241 的嗜酸乳桿菌，保藏為 ATCC 53103的鼠李糖乳桿菌，保藏為ATCC 55826的鼠李糖乳桿菌，保藏為ATCC 55845的羅 伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)，保藏為ATCC 55544的類干酪乳桿菌類干酪亞種 (lactobacillus paracasei subsp.pracasei)，保藏為LMG-17806的類干酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei)，保藏為DSM 15957的嗜熱鏈球菌，保藏為NM02/31074的發(fā)酵 乳桿菌，保藏為CCTCC M204012的類干酪乳桿菌類干酪亞種。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的干燥組合物，其中所述干燥組合物的重量為50g-1000kg,諸如例如 100g-1000kg 或 lkg-1000kg。7. -種嬰兒奶粉，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的組合物。8. -種食品，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的組合物。9. 一種膳食補(bǔ)充劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合物。10. -種制備根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的干燥組合物的方法，其中制備所述干燥 組合物的方法包括以下步驟： (a) :發(fā)酵LAB細(xì)胞和收獲所述細(xì)胞以得到包含所述LAB細(xì)胞和水的LAB細(xì)胞濃縮物-其 中所述濃縮物包含l〇8_l〇 14cfu/g濃縮物干物質(zhì)的乳酸菌(LAB)細(xì)胞； (b) :將適當(dāng)量的一種或多種保護(hù)劑與所述LAB細(xì)胞濃縮物混合以形成漿料-其中所述 漿料包含6-9g海藻糖、Ο.Ι-lg菊粉和0.5-3g水解酪蛋白的量的保護(hù)劑并且不包含藻酸鹽-其中保護(hù)劑的量相對于所述漿料中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定，并且保護(hù)劑和乳酸菌細(xì)胞的量兩者 均以漿料中的干物質(zhì)測量； (c) :冷凍所述漿料以形成固體冷凍顆粒/小丸； (d) :用2kg/m2-50kg/m2的冷凍顆粒/小丸裝載托盤以在所述托盤上得到本文相關(guān)的材 料； (e) :在其中材料的溫度不達(dá)到那么高以致超過75%的所述LAB細(xì)胞失活的溫度下，在 0.7-2毫巴(mbar)的真空壓力下初次干燥所述托盤上的材料，持續(xù)一時間段直至步驟(b)的 漿料的至少90%的水被移除；以及 (f) :在其中材料的溫度不達(dá)到那么高以致超過75%的所述LAB細(xì)胞失活的溫度下，在 0.01-0.6毫巴(mbar)的真空壓力下二次干燥步驟(e)的材料，持續(xù)足以將水分活性(a w)減 少至小于0.30的時間段，從而獲得所述干燥組合物，所述干燥組合物包含： 109-1013cfu/g所述組合物的乳酸菌細(xì)胞，其中所述組合物的特征在于其還包含下列量 的保護(hù)劑（以下所有量的保護(hù)劑均相對于所述組合物中l(wèi)g乳酸菌細(xì)胞確定）： 6_9g海藻糖， Ο.Ι-lg菊粉和 0.5-3g水解酪蛋白，并且 所述組合物不包含藻酸鹽。11. 權(quán)利要求1 〇所述的方法，其中： 在權(quán)利要求10的步驟(e)中，所述材料的溫度不達(dá)到那么高以致多于10%的所述LAB細(xì) 胞失活；以及 在權(quán)利要求10的步驟(f)中，所述材料的溫度不達(dá)到那么高以致多于10%的所述LAB細(xì) 胞失活。12. 權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述組合物包含75-80 % (w/w)海藻糖、 3-10% (w/w)菊粉和15-20% (w/w)水解酪蛋白。
【文檔編號】A23G1/42GK105996051SQ201610312935
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2012年6月30日
【發(fā)明人】比吉特·伊德, 雅各布·布倫克·斯文森
【申請人】科.漢森有限公司