楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法，以楊樹內(nèi)生真菌球毛殼為供試菌株，利用捷克八溶劑系統(tǒng)紙色譜方法對該內(nèi)生菌的抗生物質(zhì)進行理化性質(zhì)初步分析;用高效液相色譜法檢測分析該菌粗提液的活性成分及對楊樹腐爛病菌的抑菌效果;對抗生物質(zhì)液體培養(yǎng)的主要動力學(xué)指標(biāo)進行分析。為楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的使用提供了理論依據(jù)。
【專利說明】楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及球毛殼產(chǎn)生抗生物質(zhì)檢測領(lǐng)域，具體為一種楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]毛殼菌通常存在于土壤和有機肥中，是子囊菌中最大的屬之一，它可以有效降解纖維素和有機物，并對土壤中的其他微生物產(chǎn)生拮抗作用，因此，毛殼菌成為植物病原菌的生物防治菌并被廣泛應(yīng)用。球毛殼菌(Chaetomium globosum)和螺卷毛殼菌(C.cochl1des)對多種植物病原菌有明顯的抑制作用，作用機制主要表現(xiàn)為重寄生和產(chǎn)生
毛殼素(chaetomin )等抗生素。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明針對以上不足之處，提供了一種楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，檢測方法簡單。
[0004]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法，A、鑒別:將楊樹內(nèi)生菌球毛殼的萃取濃縮液滴在紙層析板上，在捷克八溶劑系統(tǒng)中進行層析試驗，測定得到萃取濃縮液活性斑點的Rf值，然后做出紙層析色譜圖，所述捷克八溶劑系統(tǒng)(V /V)包括:a、水飽和的正丁醇；b、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2 %對甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水(2:1:1) ; e、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2%六氫吡啶；f、以正丁醇飽和的0.5 mol/L、pH 7磷酸緩沖液；g、正丁醇飽和的水，內(nèi)含2%對甲苯磺酸；h、苯:甲醇(4:1)，本系統(tǒng)所用濾紙先用0.5 mol/L、pH 7磷酸緩沖液處理后晾干；8)甲醇:水(3:1)，水內(nèi)含3% NaCl ；
B、檢測:采用pH紙層析和高效液相色譜兩種檢測方法:
A、pH紙層析檢測:取新華I號層析濾紙，將所述新華I號層析濾紙分別用pH2.2，3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的緩沖溶液處理干燥，將球毛殼抑菌活性物質(zhì)點于距離濾紙底端0.3-1 cm處，點樣量為3-8yL，在二氯甲烷和甲醇的展層溶劑中進行上行展層，展層距離為10-20cm，重復(fù)3次；室溫展層結(jié)束后，取出濾紙條在無菌操作臺上晾干，然后采用平板生物顯影法測其抑菌活性物質(zhì)的展層距離，根據(jù)抑菌圈的位置確定活性物質(zhì)在不同溶劑中的展層距離，做出紙層析色譜圖；
B、高效液相色譜檢測將球毛殼抑菌物質(zhì)用少量甲醇溶解，經(jīng)微孔有機濾膜過濾后，用高效液相色譜儀Agilent 1200分析,高效液相色譜的條件為:色譜柱ZorbaxeclipseXDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流動相為甲醇:水的體積比為65: 35，等度洗脫，流速0.5_2mL/min;進樣量10-30 μ L;柱溫為25 V ;紫外檢測波長為254 nm。
[0005]優(yōu)選的:采用pH紙層析和高效液相色譜兩種檢測方法:
A、pH紙層析檢測:取新華I號層析濾紙，將所述新華I號層析濾紙分別用pH 2.2，
3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的緩沖溶液處理干燥，將球毛殼抑菌活性物質(zhì)點于距離濾紙底端0.5cm處，點樣量為5 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展層溶劑中進行上行展層，展層距離為15 cm，重復(fù)3次；室溫展層結(jié)束后，取出濾紙條在無菌操作臺上晾干，然后采用平板生物顯影法測其抑菌活性物質(zhì)的展層距離，根據(jù)抑菌圈的位置確定活性物質(zhì)在不同溶劑中的展層距離，做出紙層析色譜圖；
B、高效液相色譜檢測:將球毛殼抑菌物質(zhì)用少量甲醇溶解，經(jīng)微孔有機濾膜過濾后，用高效液相色譜儀Agilent 1200分析,高效液相色譜的條件為:色譜柱ZorbaxeclipseXDB-C18，150 mm X 4.6 mm，流動相為甲醇:水的體積比為65: 35，等度洗脫，流速I mL/min;進樣量20 UL;柱溫為25 V ;紫外檢測波長為254 nm。
[0006]所述微孔有機濾膜孔徑為0.22 μ m。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:檢測方法簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，為以后楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的應(yīng)用提供了有利的理論依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1所示是楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)在捷克八溶劑系統(tǒng)下的紙層析色譜圖；
圖2所示是紙層析色譜圖；
圖3所示是高效液相色譜圖。

【具體實施方式】
[0009]實施例1
一種楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法，(I)鑒別:將楊樹內(nèi)生菌球毛殼的萃取濃縮液滴在紙層析板上，在捷克八溶劑系統(tǒng)中進行層析試驗，捷克八溶劑系統(tǒng)(V /V)包括:a、水飽和的正丁醇；b、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2 %對甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水(2:1:1); e、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2%六氫吡啶；f、以正丁醇飽和的0.5 mol/L、pH 7磷酸緩沖液；g、正丁醇飽和的水，內(nèi)含2%對甲苯磺酸；h、苯:甲醇(4: 1)，本系統(tǒng)所用濾紙先用0.5 mol/L、pH 7磷酸緩沖液處理后晾干；8)甲醇:水(3: 1)，水內(nèi)含3% NaCl ;測定得到萃取濃縮液活性斑點的Rf值，然后做出紙層析色譜圖，如圖1所示:活性物質(zhì)在第1，2，3，4，7，8溶劑系統(tǒng)中的Rf值較大，說明球毛殼抗生物質(zhì)是一種極性較弱的活性物質(zhì)。在第5，6種溶劑系統(tǒng)中的Rf約為O。成為倒船帆形。參照經(jīng)典的各類抗生素紙層析圖譜，這個圖譜特征與第5類(非水溶性I型抗生素)抗生素的紙層析色譜圖特征相近，故把該抗生物質(zhì)初步歸為金色抗霉素類抗生素。
[0010](2)檢測:A、pH紙層析檢測:取新華I號層析濾紙，將所述新華I號層析濾紙分別用pH 2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0，10.0的緩沖溶液處理干燥，將球毛殼抑菌活性物質(zhì)點于距離濾紙底端0.5cm處，點樣量為5 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展層溶劑中進行上行展層，展層距離為15 cm，重復(fù)3次；室溫展層結(jié)束后，取出濾紙條在無菌操作臺上晾干，然后采用平板生物顯影法測其抑菌活性物質(zhì)的展層距離，根據(jù)抑菌圈的位置確定活性物質(zhì)在不同溶劑中的展層距離，做出紙層析色譜圖如圖2所示，球毛殼抗生物質(zhì)的Rf值顯示一定規(guī)律性的變化不論pH值有何變化，其Rf值始終變化不大，故與原點呈大致平行線，根據(jù)上述圖形特征可把球毛殼抗生物質(zhì)歸為中性抗生素類。但相對來看，球毛殼抗生物質(zhì)在pH 6.0時Rf最大,考慮pH對抗菌物質(zhì)的影響,可選擇pH 6.0作為萃取的最適pH。
[0011]B、高效液相色譜檢測:將球毛殼抑菌物質(zhì)用少量甲醇溶解，經(jīng)孔徑為0.22 μ m的微孔有機濾膜過濾后，用高效液相色譜儀Agilent 1200分析，高效液相色譜的條件為:色譜柱Zorbaxeclipse XDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流動相為甲醇:水的體積比為65: 35，等度洗脫，流速I mL/min ;進樣量20 yL;柱溫為25 °C ;紫外檢測波長為254 nm ;球毛殼抑菌物質(zhì)粗提液的高效液相色譜分析結(jié)果如圖3顯示，分別在1.585，2.512，7.566，
11.600 min處出現(xiàn)4個顯著的吸收峰。
[0012]實施例2
一種楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法，(I)鑒別:將楊樹內(nèi)生菌球毛殼的萃取濃縮液滴在紙層析板上，在捷克八溶劑系統(tǒng)中進行層析試驗，捷克八溶劑系統(tǒng)(V /V)包括:a、水飽和的正丁醇；b、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2 %對甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水(2:1:1); e、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2%六氫吡啶；f、以正丁醇飽和的0.5 mol/L、pH 7磷酸緩沖液；g、正丁醇飽和的水，內(nèi)含2%對甲苯磺酸；h、苯:甲醇(4: 1)，本系統(tǒng)所用濾紙先用0.5 mol/L、pH 7磷酸緩沖液處理后晾干；8)甲醇:水(3: 1)，水內(nèi)含3% NaCl ;測定得到萃取濃縮液活性斑點的Rf值，然后做出紙層析色譜圖，如圖1所示:活性物質(zhì)在第1，2，3，4，7，8溶劑系統(tǒng)中的Rf值較大，說明球毛殼抗生物質(zhì)是一種極性較弱的活性物質(zhì)。在第5，6種溶劑系統(tǒng)中的Rf約為O。成為倒船帆形。參照經(jīng)典的各類抗生素紙層析圖譜，這個圖譜特征與第5類(非水溶性I型抗生素)抗生素的紙層析色譜圖特征相近，故把該抗生物質(zhì)初步歸為金色抗霉素類抗生素。
[0013](2)檢測:A、pH紙層析檢測:取新華I號層析濾紙，將所述新華I號層析濾紙分別用pH 2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0，10.0的緩沖溶液處理干燥，將球毛殼抑菌活性物質(zhì)點于距離濾紙底端0.3cm處，點樣量為3 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展層溶劑中進行上行展層，展層距離為150cm，重復(fù)3次；室溫展層結(jié)束后，取出濾紙條在無菌操作臺上晾干，然后采用平板生物顯影法測其抑菌活性物質(zhì)的展層距離，根據(jù)抑菌圈的位置確定活性物質(zhì)在不同溶劑中的展層距離，做出紙層析色譜圖如圖2所示，球毛殼抗生物質(zhì)的Rf值顯示一定規(guī)律性的變化不論pH值有何變化，其Rf值始終變化不大，故與原點呈大致平行線，根據(jù)上述圖形特征可把球毛殼抗生物質(zhì)歸為中性抗生素類。但相對來看，球毛殼抗生物質(zhì)在pH 6.0時Rf最大,考慮pH對抗菌物質(zhì)的影響,可選擇pH 6.0作為萃取的最適pH。
[0014]B、高效液相色譜檢測:將球毛殼抑菌物質(zhì)用少量甲醇溶解，經(jīng)孔徑為0.22 μ m的微孔有機濾膜過濾后，用高效液相色譜儀Agilent 1200分析，高效液相色譜的條件為:色譜柱Zorbaxeclipse XDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流動相為甲醇:水的體積比為65: 35，等度洗脫，流速0.5 mL/min ;進樣量1yL;柱溫為25 V ;紫外檢測波長為254 nm ；球毛殼抑菌物質(zhì)粗提液的高效液相色譜分析結(jié)果如圖3顯示，分別在1.585,2.512,7.566,11.600 min處出現(xiàn)4個顯著的吸收峰。
[0015]實施例3
一種楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法，(I)鑒別:將楊樹內(nèi)生菌球毛殼的萃取濃縮液滴在紙層析板上，在捷克八溶劑系統(tǒng)中進行層析試驗，捷克八溶劑系統(tǒng)(V /V)包括:a、水飽和的正丁醇；b、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2 %對甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水(2:1:1); e、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2%六氫吡啶；f、以正丁醇飽和的0.5 mol/L、pH 7磷酸緩沖液；g、正丁醇飽和的水，內(nèi)含2%對甲苯磺酸；h、苯:甲醇(4: 1)，本系統(tǒng)所用濾紙先用0.5 mol/L、pH 7磷酸緩沖液處理后晾干；8)甲醇:水(3: 1)，水內(nèi)含3% NaCl ;測定得到萃取濃縮液活性斑點的Rf值，然后做出紙層析色譜圖，如圖1所示:活性物質(zhì)在第1，2，3，4，7，8溶劑系統(tǒng)中的Rf值較大，說明球毛殼抗生物質(zhì)是一種極性較弱的活性物質(zhì)。在第5，6種溶劑系統(tǒng)中的Rf約為O。成為倒船帆形。參照經(jīng)典的各類抗生素紙層析圖譜，這個圖譜特征與第5類(非水溶性I型抗生素)抗生素的紙層析色譜圖特征相近，故把該抗生物質(zhì)初步歸為金色抗霉素類抗生素。
[0016](2)檢測:A、pH紙層析檢測:取新華I號層析濾紙，將所述新華I號層析濾紙分別用pH 2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0，10.0的緩沖溶液處理干燥，將球毛殼抑菌活性物質(zhì)點于距離濾紙底端Icm處，點樣量為8 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展層溶劑中進行上行展層，展層距離為20 cm，重復(fù)3次；室溫展層結(jié)束后，取出濾紙條在無菌操作臺上晾干，然后采用平板生物顯影法測其抑菌活性物質(zhì)的展層距離，根據(jù)抑菌圈的位置確定活性物質(zhì)在不同溶劑中的展層距離，做出紙層析色譜圖如圖2所示，球毛殼抗生物質(zhì)的Rf值顯示一定規(guī)律性的變化不論pH值有何變化，其Rf值始終變化不大，故與原點呈大致平行線，根據(jù)上述圖形特征可把球毛殼抗生物質(zhì)歸為中性抗生素類。但相對來看，球毛殼抗生物質(zhì)在pH 6.0時Rf最大,考慮pH對抗菌物質(zhì)的影響,可選擇pH 6.0作為萃取的最適pH。
[0017]B、高效液相色譜檢測:將球毛殼抑菌物質(zhì)用少量甲醇溶解，經(jīng)孔徑為0.22 μ m的微孔有機濾膜過濾后，用高效液相色譜儀Agilent 1200分析，高效液相色譜的條件為:色譜柱Zorbaxeclipse XDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流動相為甲醇:水的體積比為65: 35，等度洗脫，流速I mL/min ;進樣量30 μ L;柱溫為25 V ;紫外檢測波長為254 nm ;球毛殼抑菌物質(zhì)粗提液的高效液相色譜分析結(jié)果如圖3顯示，分別在1.585，2.512，7.566，
11.600 min處出現(xiàn)4個顯著的吸收峰。
【權(quán)利要求】
1.一種楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法，其特征在于: 包含有如下步驟: A、鑒別:將楊樹內(nèi)生菌球毛殼的萃取濃縮液滴在紙層析板上，在捷克八溶劑系統(tǒng)中進行層析試驗，測定得到萃取濃縮液活性斑點的Rf值，然后做出紙層析色譜圖，所述捷克八溶劑系統(tǒng)(V /V)包括:a、水飽和的正丁醇；b、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2 %對甲苯磺酸；C、正丁醇:乙酸:水體積比為:2:1:1; e、水飽和的正丁醇，內(nèi)含2%六氫吡啶；f、以正丁醇飽和的0.5 mol/L、pH7磷酸緩沖液；g、正丁醇飽和的水，內(nèi)含2%對甲苯磺酸；h、苯:甲醇體積比為4:1，本系統(tǒng)所用濾紙先用0.5 mol/L、pH 7磷酸緩沖液處理后晾干；8)甲醇:水體積比為3: 1，水內(nèi)含3% NaCl ； B、檢測:采用pH紙層析和高效液相色譜兩種檢測方法: A、pH紙層析檢測:取新華I號層析濾紙，將所述新華I號層析濾紙分別用pH2.2，3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的緩沖溶液處理干燥，將球毛殼抑菌活性物質(zhì)點于距離濾紙底端0.3-1 cm處，點樣量為3-8yL，在二氯甲烷和甲醇的展層溶劑中進行上行展層，展層距離為10-20cm，重復(fù)3次；室溫展層結(jié)束后，取出濾紙條在無菌操作臺上晾干，然后采用平板生物顯影法測其抑菌活性物質(zhì)的展層距離，根據(jù)抑菌圈的位置確定活性物質(zhì)在不同溶劑中的展層距離，做出紙層析色譜圖； B、高效液相色譜檢測將球毛殼抑菌物質(zhì)用少量甲醇溶解，經(jīng)微孔有機濾膜過濾后，用高效液相色譜儀Agilent 1200分析,高效液相色譜的條件為:色譜柱ZorbaxeclipseXDB-C18,150 mm X 4.6 mm，流動相為甲醇:水的體積比為65: 35，等度洗脫，流速0.5_2mL/min;進樣量10-30 μ L;柱溫為25 V ;紫外檢測波長為254 nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法，其特征在于:采用PH紙層析和高效液相色譜兩種檢測方法: A、pH紙層析檢測:取新華I號層析濾紙，將所述新華I號層析濾紙分別用PH2.2，3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的緩沖溶液處理干燥，將球毛殼抑菌活性物質(zhì)點于距離濾紙底端0.5cm處，點樣量為5 μ L，在二氯甲烷和甲醇的展層溶劑中進行上行展層，展層距離為15 cm，重復(fù)3次；室溫展層結(jié)束后，取出濾紙條在無菌操作臺上晾干，然后采用平板生物顯影法測其抑菌活性物質(zhì)的展層距離，根據(jù)抑菌圈的位置確定活性物質(zhì)在不同溶劑中的展層距離，做出紙層析色譜圖； B、高效液相色譜檢測將球毛殼抑菌物質(zhì)用少量甲醇溶解，經(jīng)微孔有機濾膜過濾后，用高效液相色譜儀Agilent 1200分析,高效液相色譜的條件為:色譜柱ZorbaxeclipseXDB-C18，150 mm X 4.6 mm，流動相為甲醇:水的體積比為65: 35，等度洗脫，流速I mL/min ;進樣量20 UL;柱溫為25 V ;紫外檢測波長為254 nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的楊樹內(nèi)生菌球毛殼抗生物質(zhì)的鑒別與檢測方法，其特征在于:所述微孔有機濾膜孔徑為0.22 μ m。
【文檔編號】G01N30/06GK104345109SQ201310324448
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】張厚東 申請人:張厚東