一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可以用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，包括：通過靜電紡絲法制備聚乙烯醇/聚乙烯亞胺(PVA/PEI)納米纖維并用戊二醛蒸氣交聯(lián)處理，隨后通過碳化二亞胺(EDC)/羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯(lián)反應制備LA-PEG-COOH并活化其表面羧基3h，加入到PVA/PEI納米纖維膜中，搖床反應3d，再加入三乙胺和乙酸酐將納米纖維膜表面剩余的氨基全部乙?；幚?，最后洗滌、干燥，即得乳糖酸功能化納米纖維。本發(fā)明原料價格低廉，制備工藝簡單，捕獲癌細胞所需時間短、特異性強，有望在癌細胞檢測領(lǐng)域獲得應用。
【專利說明】一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于靶向捕獲癌細胞納米材料的制備領(lǐng)域，特別涉及一種用于捕獲肝癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]癌癥已成為影響人體健康的罪魁禍首，對癌癥的早期診斷和治療成為各國生物醫(yī)學領(lǐng)域研究者的關(guān)注對象。早在1869年,Ashworth首次提出了循環(huán)腫瘤細胞(circulatingtumor cell, CTC)的概念。CTC是指自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞，通過遷移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶，最終導致癌癥。有研究表明很多腫瘤在一個毫米的情況下在血液里已經(jīng)可以查到循環(huán)腫瘤細胞，傳統(tǒng)方法采用密度梯度離心法、膜濾過法、熒光細胞分選法及免疫磁珠分離法對血液中癌細胞進行捕獲并檢測。但是，腫瘤患者血液中CTC含量極少，約每16?17個白細胞中才會發(fā)現(xiàn)一個，這些方法容易造成癌細胞丟失，檢測靈敏度差。
[0003]納米材料由于其尺寸較小(1-1OOnm)，具有特殊的光學、電子學和磁學等性質(zhì)。這些性質(zhì)使納米材料能夠有效地應用于各種醫(yī)學研究，例如藥物傳遞、癌癥的靶向診斷和治療、分子手術(shù)和醫(yī)學成像。2011年，Chen等人制備了直徑范圍在50-100nm的硅納米線陣列作為基底材料，并在表面固定細胞親和的核酸適配體，結(jié)果證明納米結(jié)構(gòu)可以很好地促進其與細胞間的相互作用，大大提高了捕獲效果。
[0004]靜電紡絲是一種有效地制備具有高比表面積的納米或微米級纖維的生產(chǎn)技術(shù)，該方法具有以下特點:制備過程簡易、纖維種類多樣；所制得的納米纖維具有極大的比表面積，能提供大量的細胞接觸位點，使單位體積內(nèi)捕獲細胞的數(shù)量增加；大量研究表明納米纖維易進行表面修飾，并且可以負載生物活性分子，如蛋白質(zhì)、核酸、糖類及生長因子等；同時，納米纖維能夠很好地模擬天然細胞外基質(zhì)(ECM)，為細胞的粘附、增殖及生理功能提供良好的微環(huán)境。
[0005]為了進一步提高靜電紡納米纖維的使用性能，拓寬其應用領(lǐng)域，功能納米纖維逐漸成為人們的研究重點，這主要可以通過對原有納米纖維進行表面修飾，具體方法如層層自組裝法、等離子體法、濕化學法以及同軸靜電紡絲法等。通過改變納米纖維表面的化學組成和結(jié)構(gòu)，而使一些表面性質(zhì)發(fā)生改變。目前，抗體、多肽、E-選擇素等細胞配體已被功能化修飾至納米纖維表面，并應用于癌細胞的特異性捕獲。Zha等通過物理方法功能化固定抗體在膽固醇琥珀酸硅烷納米纖維表面用于癌細胞的分離與檢測[Zha ZB, Cohn C，Dai ZF, etal.Nanofibrous lipid membranes capable of funct1nally immobilizing antibodiesand capturing specific cells.Adv Mater.2011 ；23:3435-40.]。
[0006]聚乙烯醇(PVA)具有優(yōu)異的生物可降解性、生物相容性，在外科用縫合線、體內(nèi)植入材料、藥物載體及組織工程支架方面有著廣泛的應用。PVA是一種半晶狀聚合物，具備較高的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。PVA無毒，對動物體沒有負面影響，與皮膚接觸不會造成任何損傷。聚乙烯亞胺(PEI)表面含有大量氨基，表面易修飾，且與PVA混紡可很容易實現(xiàn)表面交聯(lián)，提高其水穩(wěn)定性，目前正受到越來越廣泛的關(guān)注。
[0007]乳糖酸屬于寡糖醛糖酸，多糖通過醚鍵化學連接到醛糖酸上，在體內(nèi)可以酶促水解從而形成半乳糖和葡萄糖酸。哺乳動物肝癌細胞表面含有大量的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)，研究表明，其與含有半乳糖的配體可特異性結(jié)合，除此之外，ASGPR可促進半乳糖配體或半乳糖配體修飾的共聚物有效地被癌細胞內(nèi)吞。Guo等人將乳糖酸通過化學反應共價結(jié)合修飾到第五代樹狀大分子表面，結(jié)果顯示所連接的乳糖酸小分子可以有效地祀向人肝癌細胞[Guo R, YaoY, Cheng G, et al.Synthesis of glycoconjugatedpoly(amindoamine)dendrimers for targeting human liver cancer cells.RSCAdv.2012 ；2:99-102.]。Κ.M.Kamruzzaman等人將乳糖酸修飾至磁性納米顆粒表面作為肝癌診斷的MR成像對比劑。當將其注入兔子體內(nèi)，磁共振成像顯示通過注入乳糖酸修飾的磁性納米顆粒，肝癌細胞的顏色明顯變黑，而其他器官并沒有變化，這說明該材料可以選擇性地聚集在肝癌細胞中[Kamruzzaman SK, Ha YS, Kim SJ, et al.Surface modificat1nof magnetite nanoparticles using lactob1nic acid and their interact1n withhepatocytes.B1materials.2007 ；28:710-6.]。
[0008]因此，將靜電紡納米纖維與細胞捕捉靶向基團進行連接，有望制備一種短時間內(nèi)即具有增強的靶向特異性捕獲癌細胞的材料，實現(xiàn)血液中癌細胞的分離與癌癥早期檢測。
[0009]檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻和專利結(jié)果表明:用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，尚未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于捕獲肝癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，該方法原料價格低廉，制備工藝簡單，捕獲癌細胞所需時間短、特異性強，有望在癌細胞檢測領(lǐng)域獲得應用。
[0011]本發(fā)明的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，包括:
[0012](I)通過碳化二亞胺EDC/羥基琥珀酰亞胺NHS偶聯(lián)反應制備LA-PEG-C00H ；
[0013](2)通過靜電紡絲法制備聚乙烯醇/聚乙烯亞胺PVA/PEI納米纖維并用戊二醛蒸氣交聯(lián)處理；
[0014](3)活化步驟(I)得到的LA-PEG-C00H表面的羧基3h，加入到PVA/PEI納米纖維膜中，搖床反應3d，再加入三乙胺和乙酸酐，最后洗滌、干燥，即得乳糖酸功能化納米纖維LA-PEG-PVA/PE1-Ac，其中，LA-PEG-C00H與PVA/PEI納米纖維所含氨基的摩爾比為1: 10。
[0015]所述步驟⑴中偶聯(lián)反應工藝為:以pH = 6.0的PBS緩沖液為溶劑，首先以摩爾比LA: EDC: NHS = I: I: I活化乳糖酸LA的羧基，磁力攪拌3h ;隨后將其逐滴加入到NH2-PEg-COOH的緩沖液中，LA與NH2-PEg-COOH的摩爾比為1.5: I，反應3d ;最后將上述反應體系轉(zhuǎn)移到截留分子量為500的透析袋在純水中透析3d，冷凍，干燥，制得LA-PEG-C00H粉末。
[0016]所述NH2-PEg-COOH 的 Mw 為 2000。
[0017]所述步驟(2)中靜電紡絲工藝條件為:紡絲液PVA/PEI的總質(zhì)量百分比濃度為12wt%，其中PVA與PEI的質(zhì)量比為3: 1，溶劑為水；電壓18.6kV，流速0.3mL/h ;接收距離為25cm ;環(huán)境濕度40-50%。
[0018]所述步驟⑵中PVA的分子量Mw為88000，PEI的Mw為25000。
[0019]所述步驟(2)中PVA/PEI納米纖維用25%戊二醛蒸氣真空交聯(lián)處理18h，得到水穩(wěn)定性良好的納米纖維。
[0020]所述步驟(3)中活化LA-PEG-C00H表面的羧基時LA-PEG-C00H: EDC: NHS的摩爾比為1:5:5。
[0021]所述步驟(3)中三乙胺:乙酸酐:PVA/PEI納米纖維所含氨基總摩爾數(shù)的摩爾比為 5: 5:1。
[0022]所述步驟(3)中洗滌為用去離子水洗滌3-5次。
[0023]所述步驟(3)中干燥為真空干燥，干燥時間為12_24h。
[0024]所述步驟(3)中得到的乳糖酸功能化納米纖維LA-PEG-PVA/PE1-Ac應用于表面表達去唾液酸糖蛋白受體的肝癌細胞的特異性捕獲。
[0025]本發(fā)明基于乳糖酸功能化靜電紡納米纖維，通過培養(yǎng)去唾液酸糖蛋白受體高表達的人肝癌細胞0fepG2)及不表達的人宮頸癌細胞(Hela)在所制備材料及對照材料(不含有LA)上培養(yǎng)，對產(chǎn)品靶向捕獲癌細胞性能進行評價。
[0026]通過核磁共振(NMR)對LA-PEG-C00H的化學基團進行表征。借助掃描電鏡(SEM)對戊二醛交聯(lián)前后的納米纖維和靶向分子修飾后的纖維形貌進行表征，利用傅里葉變換-紅外光譜(FTIR)對其化學結(jié)構(gòu)進行表征。通過紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)對纖維的溶血率進行表征。最后，通過在材料上培養(yǎng)細胞，借助共聚焦顯微鏡(CLSM)及細胞計數(shù)器，研究材料對癌細胞的特異捕獲性能。
[0027]和對照的未經(jīng)靶向分子乳糖酸功能化納米纖維捕獲癌細胞的效果相比，本發(fā)明制備的材料能夠顯著地提高對人肝癌細胞(HepG2)的捕獲能力，因此本發(fā)明制備的靶向分子乳糖酸功能化納米纖維能夠作為新型材料用于癌細胞的特異性捕獲。
[0028]核磁共振(NMR)、掃描電鏡圖(SEM)、傅里葉變換-紅外光譜(FTIR)、紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)、HepG2細胞及Hela細胞捕獲定量試驗、HepG2細胞捕獲定性試驗(激光共聚焦顯微鏡CLSM)結(jié)果分別如下:
[0029](I)核磁共振(1H NMR)測試結(jié)果
[0030]1H NMR圖譜用于表征乳糖酸與聚乙二醇的結(jié)合效率。參見說明書附圖1:3.9ppm處為LA的特征峰，由a表示。3.4?3.6ppm處為NH2-PEG-C00H中亞甲基的特征峰，由b表示。觀察LA的結(jié)構(gòu)，還存在4個LA的質(zhì)子峰。計算得LA和NH2-PEG-C00H的摩爾比為0.79，證明LA-PEG-C00H已成功合成。
[0031](2)掃描電鏡圖(SEM)結(jié)果
[0032]SEM圖用于表征納米纖維的形貌和直徑大小，參見說明書附圖2。所得到的PVA/PEI納米纖維形貌規(guī)整，表面光滑，平均直徑為439nm。經(jīng)過戊二醛蒸氣交聯(lián)后，纖維平均直徑有所增加，為525nm，而形貌仍然保持良好。同時，交聯(lián)后纖維膜顏色由白變粉，這主要是因為PEI上的氨基與戊二醛上的醛基發(fā)生縮醛反應。
[0033]參見說明書附圖4，將LA-PEG-C00H和對照材料mPEG_C00H修飾到交聯(lián)后的PVA/PEI納米纖維表面后，納米纖維形貌稍有卷曲，但仍然保持多孔結(jié)構(gòu)，平均直徑略有增加，分別為579nm和583nm，這主要是因為纖維在溶液中反應使其部分溶脹所致。
[0034](3)傅里葉變換-紅外光譜(FTIR)結(jié)果
[0035]FTIR結(jié)果表明，戊二醛已經(jīng)成功交聯(lián)了 PVA/PEI納米纖維，且LA-PEG-C00H和對照材料mPEG-COOH成功修飾到戊二醛交聯(lián)后的PVA/PEI納米纖維表面。參見說明書附圖3。3350CHT1處是PVA羥基的特征峰，交聯(lián)后的峰變寬變強，這主要是與PEI上的氨基、戊二醛的醛基的相互作用造成的。2940CHT1處是-CH2-的特征峰。1650CHT1處是氨基N-H鍵的特征峰，從該峰中可以發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后的納米纖維上面仍保留有部分氨基，有利于后續(xù)進一步功能化修飾納米纖維。ieOOcnT1處是交聯(lián)前后的PVA/PEI納米纖維主要的不同之處，這是交聯(lián)后的納米纖維的的新峰，這表示了 C = N鍵的生成，意味著PEI的部分氨基與戊二醛的醛基結(jié)合，進一步說明了交聯(lián)的成功。
[0036]經(jīng)過LA-PEG-C00H和對照材料mPEG_C00H修飾后，在1620CHT1處均出現(xiàn)新的吸收峰，其為伯酰胺的特征峰，表明LA-PEG-PVA/PE1-Ac及mPEG-PVA/PEI_Ac納米纖維的成功制備。
[0037](4)紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)測定纖維溶血率
[0038]UV-Vis表征經(jīng)過LA-PEG-C00H和對照材料mPEG-COOH修飾后的纖維材料的血液相容性，測試結(jié)果參見說明書附圖5所示。在400-800nm范圍內(nèi)，對照H2O中上清液的吸光值明顯較高，這表明血紅蛋白含量較高，即紅細胞在水中完全漲破，出現(xiàn)嚴重的溶血現(xiàn)象，但是在LA-PEG-PVA/PE1-Ac、mPEG-PVA/PE1-Ac功能化納米纖維以及對照PBS中，上清液吸光值很低，說明未發(fā)生紅細胞漲破。從插圖中也可以看出，Eppendorf管H2O組中紅細胞基本上被全部破壞，而PBS和實驗材料組不存在明顯的溶血現(xiàn)象。通過計算得知，經(jīng)過LA-PEG-C00H和對照材料mPEG-COOH修飾后的纖維材料的溶血率分別為1.66%和3.94%，均小于5%，證明所制備材料血液相容性良好。
[0039](5) HepG2細胞及Hela細胞捕獲定量試驗結(jié)果
[0040]以高表達去唾液酸糖蛋白受體的人肝癌細胞0fepG2)及不表達去唾液酸糖蛋白受體的人子宮頸癌細胞(Hela)兩種模型細胞來定量檢驗兩種材料LA-PEG-C00H和mPEG-COOH功能化納米纖維特異性捕獲細胞的效果。參見說明書附圖6。試驗結(jié)果表明，對于H印G2細胞而言，細胞捕獲效率均隨著時間的增加而提高。靶向材料與非靶向材料表現(xiàn)出明顯差異。這種優(yōu)勢主要歸因于LA介導的靶向捕獲。對于Hela細胞而言，無論是LA-PEG-PVA/PE1-Ac，還是mPEG-PVA/PE1-Ac，其捕獲細胞效率同樣隨著時間的增加而提高，但是，靶向材料與非靶向材料間并沒有表現(xiàn)出明顯的差別。這可能是因為隨著時間的延長，細胞會非特異性粘附在納米纖維表面。
[0041 ] (6) HepG2細胞捕獲定性試驗結(jié)果
[0042]以具有去唾液酸糖蛋白受體高表達的人肝癌細胞(HepG2)為模型細胞來定性檢驗兩種材料LA-PEG-C00H和mPEG-COOH功能化納米纖維捕獲H印G2細胞的效果。參見說明書附圖7。PI標記的細胞均呈現(xiàn)紅色熒光，與定量分析結(jié)果一致，LA-PEG-PVA/PE1-Ac (圖7(a))在各個時間點捕獲癌細胞的數(shù)量明顯多于mPEG-PVA/PE1-Ac (圖7(b))納米纖維。
[0043]本發(fā)明采用靜電紡絲法制備PVA/PEI納米纖維，充分利用納米纖維與細胞表面成分(如微絨毛及絲狀偽足)及細胞外基質(zhì)具有相類似的結(jié)構(gòu)，可促進細胞在其表面的粘附及增值；同時，納米纖維比表面積大、孔隙率高，可提供足夠的細胞接觸位點；并且納米纖維易于表面修飾的優(yōu)勢。結(jié)合靶向分子的與細胞間的特異結(jié)合能力，可達到短時間內(nèi)特異性捕獲癌細胞的目的。
[0044]有益效果
[0045](I)本方法制備的靶向分子乳糖酸功能化納米纖維材料具有良好的形貌、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及血液相容性；
[0046](2)本發(fā)明制備的癌細胞捕獲材料具有原料價格低廉，制備工藝簡單，捕獲癌細胞所需時間短、特異性強等優(yōu)點，在血液中癌細胞分離與癌癥早期檢測方面具有很好的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1為本發(fā)明制備的LA-PEG-C00H的核磁共振氫譜圖；
[0048]圖2為本發(fā)明制備的PVA/PEI納米纖維(a)，戊二醛交聯(lián)后的PVA/PEI納米纖維(b)的形貌及直徑分布
[0049]圖3為本發(fā)明制備PVA/PEI納米纖維、戊二醛交聯(lián)后納米纖維、LA-PEG-C00H和mPEG-COOH功能化納米纖維以及LA-PEG-C00H的紅外圖譜；
[0050]圖4為本發(fā)明制備的LA-PEG-C00H(a)和對照材料mPEG_C00H(b)修飾后的納米纖維的掃描電鏡圖及其直徑分布；
[0051]圖5為H20、PBS及本發(fā)明制備的LA-PEG-C00H和mPEG-COOH功能化納米纖維在人紅細胞懸液中處理2h后的紫外吸收圖譜(插圖為反映其溶血現(xiàn)象的數(shù)碼照片)；
[0052]圖6為本發(fā)明制備的LA-PEG-C00H和mPEG-COOH功能化納米纖維在不同時間內(nèi)捕獲H印G2細胞(a)及Hela細胞(b)的效率；
[0053]圖7為本發(fā)明制備的LA-PEG-C00H(a)和mPEG_C00H(b)功能化納米纖維對H印G2
細胞捕獲的共聚焦顯微鏡圖片。

【具體實施方式】
[0054]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0055]實施例1
[0056]首先配置pH = 6的PBS緩沖液(0.2M的磷酸氫二鈉2.46mL和0.2M的磷酸二氫鈉17.54mL,加180mL水稀釋10倍)，作為LA-PEG-C00H合成的反應溶劑。稱取NH2-PEG-C00H202.4mg，溶于 7mL 的 PBS 中。以摩爾比 NH2-PEG-C00H: LA = I: 1.5 計算所需LA的質(zhì)量為54.39mg，溶于5mL PBS中。以摩爾比LA: EDC: NHS = I: I: I計算所需的EDC和NHS分別為30.48mg和18.30mg,分別溶于ImL PBS中。通過EDC和NHS活化LA中的羧基，反應時間為3h?；罨然?h后的LA，加入到NH2-PEg-COOH中，在磁力攪拌器上混合反應3d。
[0057]反應結(jié)束后，將反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至截留分子量為500的透析袋中，在蒸餾水中透析3d (6 X 2L)。然后進行冷凍干燥處理，得到LA-PEG-C00H反應產(chǎn)物。
[0058]NMR結(jié)果顯示(圖1), 3.9ppm處為LA的特征峰，由a表示。3.4?3.6ppm處為NH2-PEg-COOH中亞甲基的特征峰，由b表示。觀察LA的結(jié)構(gòu)，還存在4個LA的質(zhì)子峰。計算得LA和NH2-PEg-COOH的摩爾比為0.79，證明LA-PEG-C00H已成功合成。
[0059]實施例2
[0060]稱取9.68732g PVA，將其溶解在71.04g超純水中，用玻璃棒緩慢攪拌約30min直至PVA粉末完全溶脹，隨后放置在磁力攪拌器上80°C水浴加熱攪拌3h，得到均勻的濃度為12被％的PVA溶液，冷卻至室溫存儲在4°C冰箱待用。稱取15g已配置好的12wt%的PVA紡絲液，其中PVA的量為1.8g，根據(jù)設(shè)定混合溶液中PVA與PEI的質(zhì)量比為3:1，稱取0.6gPEI加入到15gl2wt%的PVA紡絲液中，繼續(xù)加入4.4g水，渦旋混合儀混合后超聲處理30min使其分散均勻，磁力攪拌過夜，得到紡絲液中PVA/PEI的總質(zhì)量百分比濃度為12wt%。采用靜電紡絲法制備PVA/PEI納米纖維，所采用紡絲工藝條件為:紡絲的電壓18.6kV ;流速0.3mL/h ;接收距離為25cm ;環(huán)境濕度40-50%。
[0061]SEM結(jié)果顯示所得到的PVA/PEI納米纖維形貌規(guī)整，表面光滑，平均直徑為439nm(圖 2(a))。
[0062]實施例3
[0063]將實施例2制備的PVA/PEI納米纖維氈套在盛有25 %的戊二醛溶液的培養(yǎng)皿上方，將兩者一起放入干燥器中，抽真空交聯(lián)18h。
[0064]SEM結(jié)果顯示，經(jīng)過戊二醛蒸氣交聯(lián)后，纖維平均直徑有所增加，為525nm，而形貌仍然保持良好。同時，交聯(lián)后纖維膜顏色由白變粉，這主要是因為PEI上的氨基與戊二醛上的醛基發(fā)生縮醛反應(圖2(b))。FTIR結(jié)果表明，戊二醛已成功交聯(lián)了納米纖維(圖3)。
[0065]實施例4
[0066]納米纖維中質(zhì)量比PVA: PEI = 3: 1，所以在131.7mg的納米纖維膜中，PEI的質(zhì)量為32.93mg，可以參與酰胺化反應的氨基為0.615mol。以摩爾比羧基:氨基=I: 10計算，所需的LA-PEG-C00H為0.0615mol，質(zhì)量為140.79mg。用EDC和NHS活化羧基的方法對LA-PEG-C00H中的羧基進行活化，以摩爾比LA-PEG-C00H: EDC: NHS = I: 5: 5計算，EDC的量為58.95mg, NHS的量為45.67mg,分別溶于1mL水中，緩慢逐滴加入到含有140.79mg LA-PEG-C00H的1mL水溶液中，從而以總體積為30mL的反應體系進行活化反應。3小時后，將30mL的LA-PEG-C00H反應液加到PVA/PEI納米纖維膜的培養(yǎng)皿中，搖床反應3d。
[0067]以5倍過量進行乙?；幚恚緦嶒炛腥野返拿芏葹?.727g/mL，計算所需的體積為428 μ L，攪拌30-60min，乙酸酐的密度為1.08g/mL,計算所需的體積為290.67 μ L，反應12-24h，對纖維表面氨基進行乙?；幚恚灾泻屠w維表面氨基。
[0068]掃描電鏡結(jié)果表明LA-PEG-C00H功能化納米纖維表面后，纖維的形貌發(fā)生卷曲，并且平均直徑略有增加，為579nm(圖4 (a))，這主要是因為纖維在溶液中反應使其部分溶脹所致。FTIR(圖3)表明LA-PEG-C00H已成功修飾到納米纖維表面。
[0069]實施例5
[0070]取肝素鋰穩(wěn)定的健康成年人全血5mL,離心3min (轉(zhuǎn)速為3000r/min),用PBS洗漆沉淀3次，得紅細胞。用PBS按照1: 35的比例配置成人紅細胞懸液，于4°C冰箱中備用。對照組將0.2mL人紅細胞懸液分別溶于0.8mLPBS中和0.8mL蒸餾水中。然后，將所配置的人紅細胞懸濁液再稀釋5倍，按照纖維氈質(zhì)量與稀釋5倍后人紅細胞懸液體積之比為2mg/mL將LA-PEG-PVA/PE1-Ac及mPEG-PVA/PEI_Ac納米纖維浸入稀釋5倍后人紅細胞懸液中，取4個平行樣，在37°C環(huán)境下孵育2h。然后，將兩個對照組及浸泡過纖維氈的人紅細胞懸液離心Imin (100rpm),取上清液并用Lamada 25型紫外分光光度計測試上清液在400-800nm范圍內(nèi)的吸光值。
[0071]UV-Vis表征結(jié)果顯示(圖5)，在陽性對照組H2O中出現(xiàn)了嚴重的溶血現(xiàn)象，但是在LA-PEG-PVA/PE1-Ac、mPEG-PVA/PE1-Ac功能化納米纖維以及陰性對照組PBS中，未發(fā)生紅細胞漲破。通過計算得知，經(jīng)過LA-PEG-C00H和對照材料mPEG-COOH修飾后的纖維材料的溶血率分別為1.66%和3.94%，均小于5%，證明所制備材料血液相容性良好。
[0072]實施例6
[0073]以具有去唾液酸糖蛋白受體高表達的人肝癌細胞(HepG2)為模型細胞來定量檢驗實施例4制備的LA-PEG-C00H功能化納米纖維及對比例I制備的mPEG-COOH功能化納米纖維特異性捕獲H印G2細胞的效果。IfepG2細胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清(FBS)及I %雙抗(青-鏈霉素)，并培養(yǎng)于37°C、5% C02的恒溫培養(yǎng)箱，每2天或3天更換一次培養(yǎng)液。將LA-PEG-PVA/PE1-Ac及mPEG-PVA/PE 1-Ac納米纖維剪成圓形(Φ = 14mm)，放入24孔培養(yǎng)板，用鋼環(huán)固定。隨后加入ImL 75%酒精浸泡，并同時紫外照射殺菌2h。吸出酒精，用PBS溶液浸泡漂洗3次，每次20分鐘。最后用400 μ L純的DMEM培養(yǎng)基浸泡，放入恒溫培養(yǎng)箱過夜。
[0074]取培養(yǎng)好的HepG2細胞接種于24孔培養(yǎng)板，按照15個/孔的密度接種，每孔體積400 μ L，“8”字形搖勻。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后(20min、40min、60min、120min、240min)，吸取上清液，用PBS將纖維氈清洗三遍，并與上清液混合，用細胞計數(shù)器測定該培養(yǎng)液中剩余細胞的個數(shù)，每個時間點設(shè)置4個平行孔。計算得知兩種材料對肝癌細胞的捕獲效率。
[0075]細胞計數(shù)試驗結(jié)果表明(圖6 (a))，細胞捕獲效率均隨著時間的增加而提高。靶向材料與非靶向材料表現(xiàn)出明顯差異。這種優(yōu)勢主要歸因于LA介導的靶向捕獲作用。
[0076]實施例7
[0077]以人肝癌細胞0fepG2)為模型細胞來定性檢驗實施例4制備的LA-PEG-C00H功能化納米纖維及對比例I制備的mPEG-COOH功能化納米纖維特異性捕獲H印G2細胞的效果。如實施例6所示，在纖維氈上培養(yǎng)H印G2細胞一定時間后(20min、40min、60min、120min、240min)，用PBS緩沖溶液洗滌3遍，并用2.5%的戊二醛溶液在4°C條件下固定15min。取20yL碘化丙啶(lmg/mL)在37°C條件下染色15min。采用共聚焦顯微鏡(10X)觀察細胞在納米纖維表面的分布。
[0078]激光共聚焦結(jié)果表明(圖7)，PI標記的細胞均呈現(xiàn)紅色熒光，與定量分析結(jié)果一致，LA-PEG-PVA/PE1-Ac (圖7(a))在各個時間點捕獲癌細胞的數(shù)量明顯多于mPEG-PVA/PE1-Ac(圖7(b))納米纖維。
[0079]對比例I
[0080]納米纖維中質(zhì)量比PVA: PEI = 3: 1，所以在126.1mg的納米纖維膜中，PEI的質(zhì)量為31.525mg，可以參與酰胺化反應的氨基為0.5889mol。以摩爾比羧基:氨基=I: 10計算，所需的mPEG-COOH為0.059mol，質(zhì)量為118mg。用EDC和NHS活化羧基的方法對mPEG-COOH中的羧基進行活化，以摩爾比mPEG-COOH: EDC: NHS = I: 5: 5計算，EDC的量為56.55mg, NHS的量為33.95mg分別溶于1mL水中，緩慢逐滴加入到含有118mgmPEG-COOH的1ml水溶液中，從而以總體積為30mL的反應體系進行活化反應。3h后，將30mL的mPEG-COOH反應液加到PVA/PEI納米纖維膜的培養(yǎng)皿中，搖床反應3d。
[0081]以5倍過量進行乙?；幚恚緦嶒炛腥野返拿芏葹?.727g/mL，計算所需的體積為409.8 μ L,乙酸酐的密度為1.08g/mL,計算所需的體積為278.34 μ L。其操作過程為，先加入三乙胺，攪拌30-60min，再加入乙酸酐，反應12-24h，使納米纖維表面的氨基全部乙酰化。
[0082]掃描電鏡結(jié)果表明mPEG-COOH功能化納米纖維表面后，纖維的形貌發(fā)生卷曲，并且平均直徑略有增加，為583nm(圖4 (b))，這主要是因為纖維在溶液中反應使其部分溶脹所致。FTIR(圖3)表明mPEG-COOH已成功修飾到納米纖維表面。
[0083]對比例2
[0084]以不表達去唾液酸糖蛋白受體的人子宮頸癌細胞(Hela)為模型細胞來檢驗實施例4制備的LA-PEG-C00H功能化納米纖維及對比例I制備的mPEG-COOH功能化納米纖維捕獲不含靶向配體的Hela細胞的效果。材料處理方法同實施例6。所用培養(yǎng)基為DMEM。
[0085]細胞計數(shù)試驗結(jié)果表明(圖6 (b))，無論是LA-PEG-PVA/PE1-Ac還是mPEG-PVA/PE1-Ac納米纖維，其捕獲細胞效率同樣隨著時間的增加而提高，但是，靶向材料與非靶向材料間并沒有表現(xiàn)出明顯的差別。這可能是因為隨著時間的延長，細胞會非特異性粘附在納米纖維表面。
【權(quán)利要求】
1.一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，包括: (1)通過碳化二亞胺EDC/羥基琥珀酰亞胺NHS偶聯(lián)反應制備LA-PEG-COOH； (2)通過靜電紡絲法制備聚乙烯醇/聚乙烯亞胺PVA/PEI納米纖維并用戊二醛蒸氣交聯(lián)處理； (3)活化步驟(I)得到的LA-PEG-C00H表面的羧基3h，加入到PVA/PEI納米纖維膜中，搖床反應3d，再加入三乙胺和乙酸酐，最后洗滌、干燥，即得乳糖酸功能化納米纖維LA-PEG-PVA/PE1-Ac，其中，LA-PEG-C00H與PVA/PEI納米纖維所含氨基的摩爾比為1: 10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中偶聯(lián)反應工藝為:以pH = 6.0的PBS緩沖液為溶劑，首先以摩爾比LA: EDC: NHS= I: I: I活化乳糖酸LA的羧基，磁力攪拌3h ;隨后將其逐滴加入到NH2-PEg-COOH的緩沖液中，LA與NH2-PEg-COOH的摩爾比為1.5: I，反應3d ;最后將上述反應體系轉(zhuǎn)移到截留分子量為500的透析袋在純水中透析3d，冷凍，干燥，制得LA-PEG-C00H粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述NH2-PEg-COOH的Mw為2000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中靜電紡絲工藝條件為:紡絲液PVA/PEI的總質(zhì)量百分比濃度為12wt%，其中PVA與PEI的質(zhì)量比為3: 1，溶劑為水；電壓18.6kV，流速0.3mL/h ;接收距離為25cm ;環(huán)境濕度40-50%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟⑵中PVA的分子量Mw為88000，PEI的Mw為25000。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中PVA/PEI納米纖維用25%戊二醛蒸氣真空交聯(lián)處理18h，得到水穩(wěn)定性良好的納米纖維。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中活化LA-PEG-C00H表面的羧基時LA-PEG-COOH: EDC: NHS的摩爾比為1: 5: 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中三乙胺:乙酸酐:PVA/PEI納米纖維所含氨基總摩爾數(shù)的摩爾比為5:5:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中洗滌為用去離子水洗滌3-5次。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中干燥為真空干燥，干燥時間為12-24h。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于捕獲癌細胞的乳糖酸功能化納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中得到的乳糖酸功能化納米纖維LA-PEG-PVA/PE1-Ac應用于表面表達去唾液酸糖蛋白受體的肝癌細胞的特異性捕獲。
【文檔編號】D01F8/16GK104264479SQ201410452530
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】史向陽, 趙毅麗, 范章余 申請人:東華大學