一種突變的多聚半乳糖醛酸酶pg63t341y及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種突變的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y及 其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前果蔬汁加工中研究最多應(yīng)用最為廣泛的是果膠解聚酶中的多聚半乳糖醒酸 酶（polygalac化ronase)，多聚半乳糖醒酸酶屬于糖巧水解酶第28家族（G肥8)，作用于果 膠質(zhì)時(shí)能隨機(jī)地從多聚半乳糖醒酸鏈內(nèi)部消解a-1，4-糖巧鍵，產(chǎn)生聚合度為10~14的 寡聚半乳糖醒酸，或從寡聚半乳糖醒酸鏈的非還原末端消除單個(gè)半乳糖醒酸，產(chǎn)生聚合度 逐步降低的寡聚半乳糖醒酸鏈和半乳糖醒酸單體。多聚半乳糖醒酸酶的水解作用可使其果 汁溶液的粘度顯著下降，對(duì)果膠有強(qiáng)烈的解聚降粘作用。因此多聚半乳糖醒酸酶是目前商 品化復(fù)合果膠酶系中的主要應(yīng)用酶種。本研究室長(zhǎng)期進(jìn)行各種糖巧水解酶的開(kāi)發(fā)和酶學(xué)性 質(zhì)研究及改良并在國(guó)內(nèi)率先開(kāi)展了食品果汁酶的研究，在近期的研究中獲得一個(gè)來(lái)自青霉 Penicilliumsp.CGMCC1669的酸性多聚半乳糖醒酸酶PG63,其最適抑值都與蘋(píng)果汁天然 抑值3. 5 -致且在低溫范圍內(nèi)都能保持穩(wěn)定的活性，單酶應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果表明它性質(zhì)優(yōu)良， 能達(dá)到商業(yè)復(fù)合酶的水平。
[0003] 與其他研究歷史較長(zhǎng)的糖巧水解酶家族不同，雖然已經(jīng)注冊(cè)的多聚半乳糖醒酸酶 序列很多，但真正進(jìn)行相關(guān)研究的并不多。已有的研究主要集中在原酶純化及性質(zhì)確定、基 因克隆及序列分析、異源表達(dá)和植物組織表達(dá)模式分析等。因此，獲取具有高催化效率的果 膠酶是當(dāng)前的研發(fā)趨勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種突變的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y。 陽(yáng)0化]本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述突變的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y的編碼 基因。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述突變的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y的 基因工程方法。
[0009] 本發(fā)明W來(lái)源于Penicilliumsp.CGMCC1669的多聚半乳糖醒酸酶PG63作為 母本，經(jīng)理性設(shè)計(jì)和分子生物學(xué)技術(shù)而獲得的催化效率提高的多聚半乳糖醒酸酶突變體 PG63T341Y。設(shè)及到的氨基酸突變點(diǎn)為化r341Tyr。改造后的多聚半乳糖醒酸酶PG63T341Y 催化效率較原酶提高了 17倍。
[0010] 所述突變體氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示（對(duì)多聚半乳糖醒酸酶PG63的304 位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，T虹341Tyr)。
[0014] 本發(fā)明還是提供一種制備所述多聚半乳糖醒酸酶突變體的方法，其技術(shù)方案如 下：
[0015] 1)采用over-lap PCR的方法擴(kuò)增所述突變體序列片段；
[0016] 2)將上述突變體序列片段克隆到表達(dá)載體pPIC化上，重組載體命名 pPIC化-PG63T341Y;將本發(fā)明的多聚半乳糖醒酸酶突變體基因插入到表達(dá)載體合適的限制 性酶切位點(diǎn)之間，使其核巧酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最 優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將多聚半乳糖醒酸酶基因插入到質(zhì)粒PPIC化上的SnaBI和Not I 限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC化-PG63T341Y。
[0017] 3)將突變體重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得突變株，優(yōu)選所述菌株為大腸 桿菌、酵母菌（畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞等）、芽抱桿菌或乳酸桿菌， 優(yōu)選將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，得到重組菌株GSl 15/PG63T341Y。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種制備所述突變體的方法，包括W下步驟：
[0019] 1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0020] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組多聚半乳糖醒酸酶表達(dá)；
[0021] 3)回收并純化所表達(dá)的突變酶。
[0022] 本發(fā)明還提供了上述突變體的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高催化效率 的、適合于在食品、飼料工業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用的突變多聚半乳糖醒酸酶。本發(fā)明的突變酶最適 pH(pH3. 5-4. 0)與最適溫度（40-50°C)均與原酶保持相當(dāng)?shù)幕钚苑秶?，催化效率提?倍， 能很好的滿足食品、飼料工業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用的需求，有著非常廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 試驗(yàn)材料和試劑
[00巧]1、菌株及載體：表達(dá)宿主PichiapastorisGS115,表達(dá)質(zhì)粒載體pPIC化為本實(shí)驗(yàn) 室保存。
[0026] 2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購(gòu)自化rmentas公司，連接酶購(gòu)自Promaga公司， 多聚半乳糖醒酸購(gòu)自Sigma公司。其它都為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭ň蓮钠胀ㄉ噭┕举?gòu) 買得到）。
[0027] 3、培養(yǎng)基： 陽(yáng)02引（I)LB培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物，1 %蛋白腺，1 %化Cl,pH7.0
[0029] 似Yro培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白腺，2%葡萄糖
[0030] (3)MD固體培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1.5%瓊脂糖，1.34%YNB'O. 00004%Biotin 陽(yáng)的1] (4)MM固體培養(yǎng)基：1.5%瓊脂糖，1.：34%YNB，0. 00004%Biotin，0. 5% 甲醇 陽(yáng)03引 （5)BMGY培養(yǎng)基：1 %酵母提取物，2 %蛋白腺，1 %甘油（V/V)，1. 34 %YNB， 0. 00004%Biotin
[0033] (6)BMMY培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白腺，1.:34% YNB，0. 00004%Biotin, 0.5% 甲醇（V/V)
[0034] 4、本實(shí)施例中未做詳細(xì)具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（第=版）J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行。
[0035] 實(shí)施例1本發(fā)明中所述突變體所設(shè)及的具體定點(diǎn)突變方法如下：
[0036]對(duì)多聚半乳糖醒酸酶PG63燈Uan et al.，2011)進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)為第 95位組氨酸突變?yōu)榻j(luò)氨酸。通過(guò)over lapPCR的方法引入突變位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn) 證，獲得突變基因PG63T341Y。設(shè)計(jì)所用引物如表1所示：
[0037] 表1.所述突變體PG63T341Y特異性引物
[0039]實(shí)施例2所述突變體的制備。
[0040] 將表達(dá)載體pPIC化進(jìn)行雙酶切（SnaBI+NotI)，同時(shí)將編碼所述突變體的基 因PG63T341Y雙酶切（SnaBI+NotI)，切好的編碼成熟所述突變體的基因片段（去除信 號(hào)膚片段）與表達(dá)載體pPIC化連接，獲得含有所述突變體基因PG63T341Y的重組質(zhì)粒 pPIC化-PG63T341Y并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl15,獲得重組酵母菌株GSl15/PG63T341Y。
[0041] W同樣的方法，構(gòu)建包含信號(hào)膚序列的重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化宿主。
[0042] 取含有重組質(zhì)粒的GSl15菌株，接種于300血BMGY培養(yǎng)基的ILS角瓶中，置于 30°C，220巧m搖床培養(yǎng)4她；后將培養(yǎng)液3000g離屯、5min，棄上清，沉淀用IOOmL含有0. 5% 甲醇的BMMY培養(yǎng)基重懸，并再次置于30°C，220巧m條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔1化補(bǔ)加0. 5血 甲醇，使菌液中的甲醇濃度保持在0. 5%，同時(shí)取上清用于酶活性檢測(cè)。
[0043] 實(shí)施例3所述突變體和野生型的活性分析 W44] -、DNS法：具體方法如下：在給定的抑、溫度條件下，1血的反應(yīng)體系包括100yL 適當(dāng)?shù)南♂屆敢海?00yL底物，反應(yīng)lOmin，加入1. 5血DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后 540nm測(cè)定OD值。1個(gè)酶活單位扣）定義為在給定的條件下，每分鐘分解多聚半乳糖醒酸 生成Iymol0-(+)-半乳糖醒酸所需的酶量。
[0045] 二、所述突變體和野生型的性質(zhì)測(cè)定
[0046] 1、所述突變體和野生型的最適抑測(cè)定方法如下：
[0047] 將實(shí)施例2純化的突變酶和野生型在不同的抑下進(jìn)行酶促反應(yīng)W測(cè)定其最適抑。 底物多聚半乳糖醒酸用不同抑的0.Imol/L巧樣酸-憐酸氨二鋼緩沖液中50°C下進(jìn)行多聚 半乳糖醒酸酶活力測(cè)定。結(jié)果表明，所述突變體和野生型的最適反應(yīng)抑相近，為3. 5-4. 0， 且在抑2. 5-7. 0范圍內(nèi)有相同的作用趨勢(shì)。
[0048] 2、所述突變體和野生型的最適溫度測(cè)定方法如下：
[0049] 所述突變體和野生型的最適溫度的測(cè)定為在0.1mol/L巧樣酸-憐酸氨二鋼緩沖 液（pH4.0)緩沖液體系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果表明，所 述突變體與野生型最適溫度相近，為40-50°C，且在0-80°C下有相同的作用趨勢(shì)。
[0050] 3、重組高催化效率多聚半乳糖醒酸酶突變體和野生型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定方法如 下：
[0051] 參照李寧的方法（李寧，2009)，測(cè)定反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)時(shí)間。確定測(cè)定Km及Vmax的 反應(yīng)時(shí)間為5min。用不同濃度的多聚半乳糖醒酸（1. 〇,〇. 5,0. 4,0. 3,0. 2,0. 1和0. 05% ) 為底物，在最適條件（溫度、pH)下測(cè)定酶活性，計(jì)算出相應(yīng)的反應(yīng)速度，利用GraFit7軟件 計(jì)算Km及Vmax值。
[0052]W多聚半乳糖醒酸為底物時(shí)，重組高催化效率多聚半乳糖醒酸酶突變體和野生型 在40°C、pH4. 0下動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：
[0053]
[0054] 改造后突變體PG63T341Y的催化效率化。。,/1〇較野生酶提高17倍，能很好的滿足 食品、飼料工業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用的需求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種突變的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。2. 多聚半乳糖醛酸酶突變體基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述突變的多聚半乳 糖醛酸酶PG63T341Y。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多聚半乳糖醛酸酶突變體基因，其特征在于，所述基因的核 苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。4. 包含權(quán)利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突變體基因的重組載體。5. 包含權(quán)利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突變體基因的重組載體pPIC9r。6. 包含權(quán)利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突變體基因的重組菌株。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為大腸桿菌、酵母菌、 芽孢桿菌或乳酸桿菌。8. 制備權(quán)利要求1所述突變的多聚半乳糖醛酸酶PG63T34IY的方法，其特征在于，包含 以下步驟： ① 用包含權(quán)利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶突變體基因的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，制 備獲得重組菌株； ② 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)突變酶表達(dá)； ③ 將表達(dá)后的突變酶回收并采用親和層析制備突變酶。9. 權(quán)利要求1所述突變的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y的用途。10. 權(quán)利要求1所述突變的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y的用途作為添加劑在食品或 動(dòng)物飼料領(lǐng)域的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種突變的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y及其編碼基因，涉及基因工程和遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明以來(lái)源于Penicillium？sp.CGMCC？1669的多聚半乳糖醛酸酶PG63作為母本，經(jīng)理性設(shè)計(jì)和分子生物學(xué)技術(shù)而獲得的催化效率提高的多聚半乳糖醛酸酶突變體PG63T341Y。涉及到的氨基酸突變點(diǎn)為Thr341Tyr。改造后的多聚半乳糖醛酸酶PG63T341Y催化效率較原酶提高了17倍。
【IPC分類】C12N15/56, C12N1/21, C12N1/19, C12N15/81, C12N9/26
【公開(kāi)號(hào)】CN105219751
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510742027
【發(fā)明人】姚斌, 羅會(huì)穎, 涂濤, 王亞茹, 孟昆, 王苑, 黃火清, 石鵬君, 柏映國(guó), 蘇小運(yùn)
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所
【公開(kāi)日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2015年11月4日