一種展示重組貓致敏原rFel d 1蛋白的免疫增強型病毒樣顆粒、其表達載體及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種展示重組貓致敏原rFel d 1蛋白的 免疫增強型病毒樣顆粒、其表達載體及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 研究已經(jīng)證實，F(xiàn)el d 1是貓體內(nèi)最主要的變應(yīng)原，是誘發(fā)貓過敏癥的罪魅禍首， 用化1 d 1代替貓毛皮提取物對貓過敏癥進行診斷被學(xué)者們所認可。因此，F(xiàn)el d 1適合 作為貓過敏反應(yīng)的標志物。但是，現(xiàn)有研究獲得的體外表達重組的rFel d 1在體外診斷貓 過敏癥的靈敏度不高。
[0003] 因此，有必要提供一種能夠提高體外診斷貓過敏癥靈敏度的方案。
[0004] 乙肝病毒核屯、抗原化巧atitisBcore,皿C)是乙肝病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在細 菌、酵母菌及哺乳動物細胞內(nèi)均能高效表達、自動裝配成球形顆粒，并可插入外源短膚，同 時保持外源膚或表位正確構(gòu)象，有強免疫原性。目前還未有報道將重組貓致敏原rFel d 1 蛋白展示到乙肝病毒核屯、顆粒表面，并將所得融合蛋白免疫貓來提高貓體內(nèi)化1 d 1特異 性IgG水平的成功案例。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種展示重組貓致敏原rFel d 1蛋白的免疫增 強型病毒樣顆粒、其表達載體及其制備與應(yīng)用。
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供了一種展示重組貓致敏原rFel d 1蛋白的免疫增強型病毒 樣顆粒，構(gòu)成該顆粒的蛋白質(zhì)亞基為乙肝病毒核屯、抗原與氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的多 膚的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列為所述SEQ ID N0:1的多膚序列插入乙肝 病毒核屯、抗原第78-81位氨基酸之間，并替換掉所述乙肝病毒核屯、抗原第79-80位的氨基 酸序列所得。
[0007] 如本發(fā)明所述的，是將氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的多膚替換到掉乙肝病毒核屯、 抗原原始序列第79-80位氨基酸之間的序列?？蒞理解的是，本發(fā)明技術(shù)人員將目標氨基 酸殘基插入乙肝病毒核屯、抗原原始序列的方式即可W是直接增加目標氨基酸殘基，也可W 將乙肝病毒核屯、抗原上的部分氨基酸殘基用目標氨基酸殘基替換。
[0008] 在本發(fā)明一實施方式中，所述SEQ ID NO: 1的的多膚序列的編碼基因為SEQ ID NO:2所示核巧酸序列。
[0009] 如本發(fā)明所述的，所述乙肝病毒核屯、抗原為乙肝病毒核屯、抗原全長或其片段，包 括主要免疫顯性區(qū)域和次要免疫顯性區(qū)域，至少包括乙肝病毒核屯、抗原全長的第1-149位 氨基酸殘基W形成病毒樣顆粒。乙肝病毒核屯、抗原全長183個氨基酸，其序列如SEQ ID N0:3所示，研究表明，為了能形成病毒樣顆粒，至少應(yīng)當保留乙肝病毒核屯、抗原的前149位 氨基酸殘基，第149位之后可保留原有的全部或部分殘基，相比全長乙肝病毒核屯、抗原，省 略149位W后氨基酸殘基并不影響其自我裝配。如本發(fā)明實施例具體列舉的，至少保留了 乙肝病毒核屯、抗原全長SEQ ID NO:3的第1-149位氨基酸殘基就能產(chǎn)生病毒樣顆粒。
[0010] 在本發(fā)明一實施方式中，所述乙肝病毒核屯、抗原全長SEQ ID NO:3的第1-149位 氨基酸殘基的編碼基因為SEQ ID N0:4所示核巧酸序列。
[0011] 在本發(fā)明一實施方式中，可在所述SEQ ID N0:1的多膚一側(cè)或兩側(cè)增設(shè)柔性 氨基酸短膚。如實施例具體列舉的，在所述SEQ ID N0:1的多膚的兩側(cè)均連接了序列 為：GGGGSGGGG(SEQ ID N0:5)的柔性氨基酸短膚。
[0012] 在本發(fā)明一實施方式中，所述GGGGSGGGG柔性氨基酸短膚的編碼基因為SEQ ID NO:6所示核巧酸序列。
[0013] 可W理解的是，為了便于實驗室純化，所述融合蛋白還可連接有用于純化的蛋白 質(zhì)標簽，如c-myc, flag, HA, GST或GFP標簽，又如實施例具體列舉的，His標簽，所述化S標 簽連接在所述融合蛋白的C端。
[0014] 第二方面，本發(fā)明提供了一種表達產(chǎn)生如第一方面所述的展示重組貓致敏原rFel d 1蛋白的免疫增強型病毒樣顆粒的表達載體，其中，所述表達載體的多克隆位點插入有編 碼如第一方面所述融合蛋白的基因。
[0015] 如本發(fā)明所述的，所述表達載體可W選自但不限于原核表達載體如大腸桿菌或芽 抱桿菌的表達載體，真核表達載體如酵母菌表達載體，哺乳動物細胞病毒如腺病毒、植物細 胞病毒、動物細胞表達載體、植物細胞表達載體、隧菌體、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他表達載體?？?之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可W用。具體的，如大腸桿菌表達載 體祀T28a(+)。
[0016] 第S方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的展示重組貓致敏原rFel d 1蛋白 的免疫增強型病毒樣顆粒的制備方法，為將如第二方面所述的表達載體導(dǎo)入合適的宿主， 在適合表達所述展示重組貓致敏原rFel d 1蛋白的免疫增強型病毒樣顆粒的條件下培養(yǎng) 所述宿主，再從培養(yǎng)物中分離出所述免疫增強型病毒樣顆粒。
[0017] 第四方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的展示重組貓致敏原rFel d 1蛋白 的免疫增強型病毒樣顆?；蛉绲诙矫嫠龅谋磉_載體在制備免疫治療、免疫預(yù)防或免疫 診斷用藥物或試劑中的用途。
[0018] 第五方面，本發(fā)明提供了一種增強重組貓致敏原rFel d 1蛋白免疫原性的疫苗， 所述疫苗的主要有效成分為如第一方面所述的展示重組貓致敏原rFel d 1蛋白的免疫增 強型病毒樣顆粒。
[0019] 在本發(fā)明一實施方式中，所述疫苗中還可包括藥學(xué)上可接受的輔料。
[0020] 第六方面，本發(fā)明提供了如第五方面所述疫苗在制備減少或抑制貓體內(nèi)化1 d 1 變應(yīng)原產(chǎn)生的藥物中的用途。
[0021] 第屯方面，本發(fā)明提供了一種刺激貓的免疫系統(tǒng)對于自身化1 d 1抗原產(chǎn)生免疫 應(yīng)答的方法，為經(jīng)合適的方式將如第五方面所述疫苗免疫貓，從而得到抗自身化1 d 1抗原 的抗血清或抗體。
[0022] 在本發(fā)明一實施方式中，所述抗自身化1 d 1抗原的抗血清中包括IgG抗體。
[0023] 在本發(fā)明一實施方式中，所述將如第五方面所述疫苗免疫貓的方式為肌肉注射或 皮下注射或腹腔注射。
[0024] 本發(fā)明提供的一種展示重組貓致敏原巧el d I蛋白的免疫增強型病毒樣顆粒、其 表達載體及其制備與應(yīng)用具有如下有益效果：本發(fā)明成功表達并純化出了乙肝病毒核屯、抗 原（皿cAg)與巧el d 1融合表達的皿cAg-rFeld 1融合蛋白，所述皿cAg-rFeld 1融合 蛋白呈現(xiàn)出病毒顆粒樣結(jié)構(gòu)。
[00巧]本發(fā)明提供的皿cAg-rFel d 1融合蛋白可顯著提高巧el d 1的免疫原性，進而 提高體外重組表達的巧el d 1在體外診斷貓過敏癥應(yīng)用中的檢測夷敏度。
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