專利名稱：香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆。
背景技術(shù)：
香蕉鐮刀菌枯萎病又稱香蕉巴拿馬病、黃葉病，是由鐮刀菌侵染引起維管束壞死的土傳性病害，病原菌為尖鐮孢霉古巴?；蚚Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen](FOC).病原菌從受傷的根莖侵入，通過寄主維管束向莖上發(fā)展，并進一步向假葉部蔓延。當植株枯死后，病原菌隨殘體遺留在土壤中，隨著水流或帶菌的農(nóng)具在蕉園內(nèi)再進行自然傳播，其厚垣孢子可在土壤中存活8～10年。由于該菌存活期長，傳播迅速，尚未有防止該病的特效藥物，因此一旦在香蕉產(chǎn)地發(fā)病，很可能大面積爆發(fā)將造成重大損失。
尖鐮刀菌古巴專化型有4個生理小種，1號小種(racel)感染香蕉的栽培種“大蜜哈”[Grosmichel(AAA)]及龍牙蕉(MusaAAB)，矮蕉[Dwarfcavendish(AAA)]較抗病，該小種呈世界分布，在中國大陸已有記錄；2號小種(race2)在中美洲，僅感染三倍體雜種梭香蕉[Bluggoe(AAB)]，不侵染“大蜜哈”；3號小種(race3)感染野生的羯尾蕉屬(Heliconia)；4號小種(race4)能感染幾乎所有的香蕉種類，如Cevendish、“大蜜哈”、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉，毀滅性最大，在全世界范圍內(nèi)尚末找到有效的抵抗4號小種的香蕉品種。
香蕉枯萎病侵染時間長，沒有有效的農(nóng)藥和防治措施，品種抗病性成為一個重要的控病方法。但是，由于對病害的侵染過程缺乏深入的研究，目前未見有關(guān)香蕉枯萎病的致病性研究報道，對病菌的致病因子沒有足夠的認識，抗病品種的選取很難取得理想的進展。植物病原菌可產(chǎn)生一系列的果膠酶，許多研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶與病原菌的毒力和致病性高度相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶PGC1基因及其克隆。從香蕉枯萎病菌的致病性內(nèi)切半乳糖醛酸酶是作為病菌的檢疫檢測的新指標，以及用于篩選和培育新的香蕉抗病品種。
一種香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因，其核苷酸序列，PGC1cDNA的全長序列如下cttcaacaac tctttgcatc ctcttgtctt tgtctcacac gaatatcaca atg gtt 56cga aac atc gct att gcg gct ttg ctg cca gct gcc ttt gct tca acg 104ctg cct cga gat ccc tgc agc gtg act gac tac tcc ggc ctc gcc acc 152gcc gtc tca tct tgc aca aac att gtg ctc aac ggt ttc caa gtc ccc 200act ggc aag gct ctt gat cta tcc aag ctc aag gac ggc gca acc gtt 248acc ttc aag ggc aag acc acg ttt gcc act act gcc gat aac gac ttt 296gat cct atc gtc att agc gga aat ggc atc act ata act ggt gca tct 344ggc cat gtc att gat ggt aac ggc ccg gcg tac tgg gat ggc gaa ggt 392tct aac aac aag aaa aac cca aag ccc gac cat ttc atc gtt gtc aag 440aag act acc ggc aac tca aag atc aca aac ctg aac atc cag aac tgg 488ccc gtt cac tgc ttc gac atc aca ggc agt tca caa ttg acc atc tca 536ggg ctc att ctt gat aac aga ctt ggc gac aag ccc aat gcc aag agc 584ggt agc ttg ccc gct gcg cac aac agc gac ggt ttc gac atc ccg tcc 632agt gac cac gtt act ctg gat aac att cat gtt tat aac cag gat gac 680tgt gtt gct gtc act tcg ggt aca aac atc atc gtc tcc aac atg tac 728tgc tcc ggt ggt cat ggt ctt agc att gga tct gtt ggc ggc aag agc 776aac aat gtc gtc aat ggt gtt cag ttc ttg gat tcg cag att gtt aac 824agt gag aat gga tgc cgc atc aag tcc aac tct ggc aca act ggc acg 872att gag aac gcc acg tac caa aac att gcc ctt acc aac atc agc aaa 920tat ggt gtc gat gtc cag cag gac tat ctc aac ggt ggc cct act gga 968aag ccc acc aac gga gtc aag atc agc ggt atc aag ttc atc aag gtc 1016act ggt aca gtg gct agc tct gct caa gat tgg tat att ctg tgt ggc 1064gat ggt agc tgc tct gga ttc act ttc tct gga aac gcc atc act ggt 1112ggt ggc aag act agc agc tgc aac tat cct acc aac act tgc cct agc 1160aag gtc aaa gcg gga cga tca cca ctc cat gtt cac aaa gct aga acc 1208cag tca aag agt ggt ctt acg gtt gtt gcg tgg aat tgc tgc ggc gga 1256
cag ttg tgagcttggg tctatagtag tatttgtccg atagtcacta ggcttatctt 1312agcaatacac tttatttatc gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1372aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa1426推測的PGC1的氨基酸序列如下Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala1 5 10 15Ser Thr Leu Pro Arg Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu2025 30Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile ValLeu Asn Gly Phe Gln35 40 45Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala50 55 60Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn65 70 75 80Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly85 90 95Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly100 105 110Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val115 120 125Val Lys Lys Thr Thr Gly Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln130 135 140Asn Trp Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr145 150 155 160Ile Ser Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala165 170 175Lys Ser Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile180 185 190Pro Ser Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln195 200 205Asp Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn
210 215 220Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly225 230 235 240Lys Ser Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile245 250 255Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr260 265 270Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile275 280 285Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro290 295 300Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile305 310 315 320Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr lle Leu325 330 335Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile340 345 350Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys355 360 365Pro Ser Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala370 375 380Arg Thr Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys385 390 395 400Gly Gly Gln Leu其中 Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser CysThr Asn Ile Val為已知PGC1蛋白N端測序部分，Asp為PGC1成熟蛋白N端編碼氨基酸。
本發(fā)明的香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因克隆，根據(jù)已測的PGC1蛋白N末端編碼序列設(shè)計引物，以香蕉枯萎病菌4號生理小種菌株總RNA為模板，采用RT-PCR方法，合成cDNA的第一條鏈，5’RACE和3’RACE的方法克隆PGC1 cDNA的全長序列，推測出PGC1的氨基酸序列。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果本發(fā)明純化的多聚半乳糖醛酸酶PGC1是香蕉枯萎病菌4號生理小種的關(guān)鍵致病因子之一，獲得的PGC1基因cDNA序列，可以作為區(qū)分FOC1號和4號小種的依據(jù)。將PGC1基因轉(zhuǎn)化到真核微生物中，所表達的PGC1可以作為免疫蛋白抗原制作動物血清，作病原菌檢測使用。同時，真核微生物表達產(chǎn)物可以代替病原菌作耙標物，廣泛篩選對PGC1有效的抗病基因，供香蕉抗枯萎病轉(zhuǎn)基因育種使用。


圖1為Sephacryl S-100凝膠過濾柱層析圖。
圖2為Sephacryl S-100凝膠過濾柱層析收集各管的PG活性變化曲線。
圖3為Sepharose SP XL 16/10強陽離子交換柱層析圖。
圖4為Sepharose SP XL 16/10強陽離子交換柱層析收集各管的PG活性變化曲線。
圖5為Sepharose CM弱陽離子交換柱層析圖。
圖6為Sepharose CM弱陽離子交換柱層析收集各管的PG活性變化曲線。
圖7為純化PGC1的IEF-PAGE電泳圖譜。
其中71為粗酶液PG同工酶染色；72為經(jīng)Sepharose CM Hitrap收集的PGC1酶染色；73為經(jīng)Sepharose CM Hitrap收集的PGCl酶蛋白銀染；74為標準等電點(pI3.5-9.5)。
圖8為各純化PGC1步驟的SDS-PAGE電泳銀染圖譜。
其中81為Sepharose SP XL 16/10收集酶液；82為Sephacryl S-10016/10收集酶液；83為粗酶液；84為Sepharose CM Hitrap收集酶液；85為低分子量蛋白標準。
圖9為3’端racePCR產(chǎn)物電泳。
91為第一輪RT-PCR產(chǎn)物；92為第二輪nest-PCR產(chǎn)物圖10為5’端racePCR產(chǎn)物電泳。
1為第一輪RT-PCR產(chǎn)物；2為第二輪nest-PCR產(chǎn)物具體實施方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
根據(jù)PGC1酶蛋白的N-端的22個氨基酸設(shè)計簡并引物PGA1，PGA2。以香蕉枯萎病菌4號生理小種菌株總RNA為模板，采用RT-PCR方法，退火溫度47.9℃，與反向錨定引物Oligo(T)20進行PCR擴增，RT-PCR擴增產(chǎn)物，用PGA2和Oligo(T)20進行巢式PCR擴增，在54℃退火溫度得到了特異性很強的1200bp單一條帶RPGC1。將該片段送上海聯(lián)合基因公司克隆、測序后，發(fā)現(xiàn)RPGC1全長1222bp，序列分析后發(fā)現(xiàn)包含PGC1蛋白質(zhì)N-端的部分序列SGLAYAVSSCYNI。在PGC1片斷中還包括一個終止密碼子TGA。在終止密碼子下游還包含一個長69bp的3’端非編碼區(qū)，其中包括聚腺苷酸化的信號-TTTATTT-，以及一個含72個腺苷酸的poly(A)。由此證實得到的片段為PGC1基因的3’端的片段。
為了得到PGC1的全長DNA基因片段，根據(jù)RPGC1的序列設(shè)計引物，采用TaKaRa的5’Full RACE core set試劑盒進行5’片段的擴增。以PGB3為引物反轉(zhuǎn)錄總RNA，通過PGA3和PGLS1進行擴增得到一條800bp的條帶，用PGLS2與PGA3進行巢式PCR擴增，在退火溫度內(nèi)得到了特異性很強的750bp單一條帶LPGC1。目的片段克隆、測序后發(fā)現(xiàn)它全長758nt。序列分析后發(fā)現(xiàn)，除掉它與RPGC1重疊片段后，還包含120nt序列，LPGC1中包含N-端全部已測出的22個氨基酸序列和1個起始密碼子AUG。起始密碼子前有50nt的5’端非編碼區(qū)。從序列分析結(jié)果可以證實，片段為PGC1基因的5’末端片段。
PGA15’TGCWSCGTSACTGACTACTCYGGC 3’PGA25’CTCGCYACCGCYGTCTCATCYTG 3’PGB25’CCAGAGTTGGACTTGATG 3’PGA35’GTTACCTTCAAGGGCAAGACC 3’PGLS15’ACAATGTITGTGCAAGATGAGAC 3’PGLS25’GGCCGGAGTAGTCAGTCACTGAG 3’可獲全長cDNA序列并推測氨基酸序列。
本發(fā)明中液體培養(yǎng)基NH4HNO31.0g、KCl0.2g、FeSO40.01g、KH 2PO40.2g、ZnSO40.01g、蒸餾水1000mL。Sigma公司產(chǎn)柑桔果膠5g，羧甲基纖維素鈉5g，液體培養(yǎng)基pH值5.0后，于121℃、15磅下滅菌20min。
PG酶活性的測定用pH5.0的0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制0.5％的果膠酸溶液，取1mL果膠酸溶液與0.5mL稀釋100倍的酶液混合，于45℃水浴鍋中反應(yīng)30min，立即加入DNS試劑0.5mL中止反應(yīng)，再加入蒸餾水至5mL。在Bakeman分光光度計520nm波長處測定反應(yīng)混合物的O.D值。測定后，取樣品的O.D值平均值在標準曲線查出相應(yīng)的糖量。對照除加入的PG酶液沸煮10min的失活酶液外，其余操作同上。多聚半乳糖醛酸酶的酶活單位為45℃下每mg酶每分鐘催化低物釋放1μmolD-半乳糖醛酸量(μmol/mg*min)。
酶蛋白濃度測定按Bradforf方法，用考馬斯亮蘭G250顯色，在595nm下比色測定，用牛血蛋白清作標準曲線。
根據(jù)已測的PGC1蛋白N末端編碼序列設(shè)計引物，克隆PGC1 cDNA的全長序列，推測出PGC1的氨基酸的序列。具體操作過程如下首先，提取純化香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶，其工藝步驟是-20℃低溫保藏的香蕉枯萎病菌4號生理小種菌株(由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供)活化，接種在加有香石竹葉片的PDA平板上，25℃培養(yǎng)7天，用0.7cm打孔器在菌落邊緣打下菌片，每個250mL三角瓶盛誘導(dǎo)果膠酶液體培養(yǎng)基100mL，加4個菌片，25℃下，110rpm振蕩培養(yǎng)10天。在4℃，16000g下離心20min，取上清液。然后用Millipore公司的Amicon 8400超濾濃縮系統(tǒng)，內(nèi)含10kDa超濾膜，濃縮約200倍，測多聚半乳糖醛酸酶活性和蛋白含量，保存于-20℃冰箱中備用。
采用Amersham Biosciences的全自動蛋白層析系統(tǒng)AKTA purify HPLC，預(yù)先用內(nèi)含0.15mol/L NaCl，pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液，平衡120mL的Sephacry S-10016/10凝膠柱，上述粗酶液上樣量為2mL，用凝膠柱平衡緩沖液洗脫1.5倍柱體積，流速2.5mL/min，收集4mL/管。檢測洗脫液在OD280的吸光值，可見兩個蛋白峰A和B，如圖1所示。測各管收集液的PG活性表明，15-48收集管中存在PG活性，如圖2所示。合并每次層析收集的酶活性大于粗酶液活性25％洗脫液，用Millipore公司的10kDa超濾離心管濃縮脫鹽，獲得組分BI，測濃縮液酶活性及蛋白含量。
BI每次上樣2mL于20mL的Sepharose SP XL 16/10強陽離子交換層析柱中，預(yù)先用pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液平衡柱，用pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液配置的0.75mol/L NaCl溶液進行線性梯度洗脫30倍體積，流速4mL/min，收集梯度洗脫部分，4mL/管。經(jīng)過Sepharose SP XL 16/10強陽離子交換柱層析后，可見一明顯的蛋白洗脫峰C，如圖3所示。PG活性檢測表明，從60-74收集管存在PG活性，如圖4所示。合并每次層析收集的酶活性大于BI活性25％洗脫液，經(jīng)10kDa超濾離心管濃縮脫鹽，獲得組分CI，測濃縮液酶活性及蛋白含量。
CI每次上樣0.5mL于1mL的Sepharose FF CM弱陽離子交換層析柱，用pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液配置的0.75mol/L NaCl溶液進行線性梯度洗脫30倍柱體積，流速1mL/min，收集0.5mL/管，OD280檢測為一對稱的蛋白洗脫峰D，如圖5所示，39-54收集管的有PG活性，如圖6所示，收集梯度洗脫峰，合并數(shù)次層析的收集洗脫液，經(jīng)10kDa超濾離心管濃縮脫鹽，獲得組分DI，進行IEF-PAGE同工酶電泳染色只檢測到PGC1，如圖7所示，SDS-PAGE電泳顯示DI為一條蛋白帶，如圖8所示，即為達電泳純的多聚半乳糖醛酸酶PGC1。
各純化步驟組分析表明，純化的PGC1酶活性為260.52Units mg-1.min-1，與培養(yǎng)液相比較純化了51.59倍，見表1。
表1PGC1純化表

超薄層IEF-PAGE電泳后，以標準等電點電泳遷移率作標準曲線的，從曲線中查出PGC1的等電點約為7.85，如圖7所示。
用SDS-PAGE電泳，以標準分子量對數(shù)為縱坐標，遷移率為橫坐標作直線回歸圖，以回歸方程y＝3.1554x2-38.239x+131.33(R＝0.997)計算出PGC1的相對分子量為42.3kDa，如圖8所示。
由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院協(xié)助測定的PGC1酶蛋白N-末端序列為Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr ArgIle Val。
香蕉枯萎病菌4號生理小種菌株，低溫保存菌株接種在加有香石竹葉片的PDA平板培養(yǎng)基上，25～28℃培養(yǎng)3～4天，過濾除去菌絲，提取病菌總RNA，于-70℃保存。
低溫保藏的病菌菌株經(jīng)活化在液體培養(yǎng)基NH4HNO31.0g、KCl 0.2g、FeSO40.01g、KH2PO40.2g、ZnSO40.01g、蒸餾水1000mL。Sigma公司產(chǎn)柑桔果膠5g，羧甲基纖維素鈉5g，培養(yǎng)4天，用2層普通濾紙以布氏漏斗濾出菌絲，經(jīng)雙蒸水(ddH2O)充分洗滌，真空泵抽干水分。改進OMEGA公司的真菌RNA抽提純化試劑盒E.Z.NA FungaL RNA Kit方法提取總RNA。其過程為首先將抽濾收獲的菌體放入研缽中，加液氮速凍后研磨成粉末，取約10-20mg粉末轉(zhuǎn)移到用液氮預(yù)冷的1.5mL離心管中，向離心管中加入600cRNA裂解液RFL和12μLβ-巰基乙醇快速混勻，振蕩10秒，使菌絲粉末完全溶解。然后加入140μL RNA抽提液SP，顛倒混合數(shù)秒鐘，冰浴15分鐘，室溫離心10000g，10min，吸取上清，再加入140μL RNA抽提液SP，重復(fù)抽提一次，以完全除去除菌絲體中的蛋白質(zhì)和多糖。接著吸取上清，加入等體積異丙醇，室溫離心10000g，10min，棄上清，離心管倒置于干凈濾紙上，流干其中的液體。加350μL 65℃預(yù)熱RB緩沖液，350μL溶解RNA沉淀，加入350μL75％的無水乙醇，劇烈振蕩混勻。再將混勻的樣品移入HiBind RNAspin吸附柱中，放入2mL離心管中，室溫離心10000g，30sec，取出吸附柱，倒掉離心管中的濾液。吸附柱中加入750μL洗脫緩沖液I，室溫離心10000g，30sec，取出吸附柱，倒掉離心管中的濾液。吸附柱中加入500μL洗脫緩沖液II，室溫離心10000g，30sec，取出吸附柱，倒掉離心管中的濾液，重復(fù)一次。最后加入30μL去離子甲酰胺溶液，放入新的1.5mL離心管中，室溫離心10000g，1min，所獲洗脫液即為提取的RNA。
測得的PGC1酶蛋白N-末端序列，在GenBank中查找同源序列，根據(jù)同源序列的氨基酸密碼子的偏好性，同時也考慮香蕉枯萎病菌密碼子本身的偏好性，利用Omiga 2.0軟件設(shè)計兩條上游簡并引物PGA1和PGA2，進行3’RACE(RNA3’端快速擴增)。
PGA15’TGCWSCGTSACTGACTACTCYGGC 3’PGA25’CTCGCYACCGCYGTCTCATCYTG 3’首先合成cDNA的第一鏈，在200μLPCR管中配制下列反應(yīng)液1μL總RNA，4μL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mM的dNTPs(脫氧核苷三磷酸)2μL，40units/μL的RNase Inhibitor(RNA酶抑制劑)0.5μL，20μm的Oligo(dT)20Primer2.5μL，5μ/μL的AMV反轉(zhuǎn)達錄酶2μL，加DEPC(焦碳酸二乙酯)處理ddH2O至總體積20μL?；旌暇鶆蚝笤谑覝胤胖?0min后移于42℃恒溫槽中。42℃保溫1h，在冰水中冷卻2min。然后以PGA1和Oligo(dT)20進行第一輪RT-PCR，在冰上準備下列反應(yīng)物1μL cDNA模板，5units/μL的Pfu Taq 0.25μL，含Mg2+的10×Pfu緩沖液2.5μL，25mM的dNTPs4μL，20μm的上游引物PGA10.5μL，20μm的下游引物Oligo(dT)200.5μL，加入滅菌ddH2O至總體積25μL?；靹蚝笤贖ybraid express梯度PCR儀上，進行擴增94℃，3min預(yù)變性；94℃，45sec變性；47.9℃，40sec退火；72℃，1∶30min延伸；35個重復(fù)循環(huán)，最后72℃，延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
然后將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍用于第二輪巢式PCR擴增。巢式PCR的反應(yīng)體系為1μL第一輪擴增DNA，5units/μL的Ex Taq 0.25μL，含Mg2+的10×Pfu緩沖液2.5μL，25mM的dNTPs4μL，20μm的上游引物PGA20.5μL，20μm的下游引物Oligo(dT)200.5μL，加入滅菌ddH2O至總體積25μL。混勻后在Hybraid express梯度PCR儀上，進行擴增94℃，3min預(yù)變性；94℃，45sec變性；54℃，45sec退火；72℃，130min延伸；35個重復(fù)循環(huán)，最后72℃，延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后在1％瓊脂糖凝膠電泳檢測到一條1200bp的特異DNA條帶RPGC1(圖9)，用上海申能博彩生物有限公司的凝膠回收試劑盒回收，送上海聯(lián)合基因公司測序。將該片段克隆、測序后，發(fā)現(xiàn)RPGC1全長1222bp(表1)，序列分析后發(fā)現(xiàn)，包含PGC1蛋白質(zhì)N-端的部分序列。在PGC1片斷中還包括一個終止密碼子TGA。在終止密碼子下游還包含一個長69bp的3非編碼區(qū)，其中包括聚腺苷酸化的信號-TTTATTT-，以及一個含72個腺苷酸的poly(A)。由此證實得到的片段為PGC1基因的3’端的片段。
PGB2以已知RPGC1序列設(shè)計5’端磷酸化引物PGB2起始cDNA鏈的合成，進行5’端RACE。將單鏈cDNA環(huán)化，設(shè)計兩對序列特異性引物擴增環(huán)化的單鏈cDNA，PGA3和PGAL1為第一輪擴增引物，PGA3和PGLS2為第二輪擴增引物。首先配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液1μL總RNA，4μL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mM的dNTPs 2μL，40units/μL的RNase Inhibitor 0.5μL，20μm的PGB2Primer(引物)2.5μL，5μ/μL的AMV反轉(zhuǎn)達錄酶2μL，加DEPC處理ddH2O至總體積45μL?；旌暇鶆蚝笤谑覝胤胖?0min后移于42℃恒溫槽中。42℃保溫1h，在冰水中冷卻2min。
然后將PGB2反轉(zhuǎn)錄的15μL的cDNA加入的5×Hybrid RNA Degeneration緩沖液(5倍RNA連接緩沖液)5μL，加水至75μL，再加入1μL RNase H，30℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后加入100μL的滅菌蒸餾水，500μL的100％乙醇均勻混合后在-20℃放置30分鐘，進行乙醇沉淀。用的70％乙醇，清洗沉淀兩次后將沉淀干燥處理。
在乙醇沉淀的單鏈cDNA中加入5×RNA Ligation buffe 8μL，40％PEG(聚乙二醇)#6000 20μL，T4 RNA Ligase 1μL，溶解乙醇沉淀的DNA，加滅菌ddH2O至反應(yīng)總體積45μL，16℃，過夜(反應(yīng)15～18h)。取反應(yīng)液為RT-PCR的模板進行反應(yīng)，按如下準備反應(yīng)混合液1μL cDNA模板，5units/μL的Pfu Taq 0.25μL，含Mg2+的10×Pfu緩沖液2.5μL，25mM的dNTPs4μL，20μm的上游引物PGLS1 0.5μL，20μm的下游引PGA3 0.5μL，加入滅菌ddH2O至總體積25μL?；靹蚝笤贖ybraid express梯度PCR儀上，進行擴增94℃，3min預(yù)變性；94℃，45sec變性；56℃，45sec退火；72℃，1min延伸；35個重復(fù)循環(huán)，最后72℃，延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。取1μL第一輪擴增DNA，5units/μL的Ex Taq0.25μL，含Mg2+的10×Pfu緩沖液2.5μL，25mM的dNTPs4μL，20μm的上游引物PGLS2 0.5μL，20μm的下游引物PGA3 0.5μL，加入滅菌ddH2O至總體積25μL?；靹蚝笤贖ybraid express梯度PCR儀上，進行擴增94℃，3min預(yù)變性；94℃，45sec變性；56℃，45sec退火；72℃，1min延伸；35個重復(fù)循環(huán)，最后72℃，延伸10min。
PGB25’CCAGAGTTGGACTTGATG 3’PGA35’GTTACCTTCAAGGGCAAGACC 3’PGLS15’ACAATGTTTGTGCAAGATGAGAC 3’PGLS25’GGCCGGAGTAGTCAGTCACTGAG 3’通過PGA3和PGLS1進行擴增得到一條800bp的條帶，用PGLS2與PGA3進行巢式PCR擴增，在退火溫度內(nèi)得到了特異性很強的750bp單一條帶LPGC1(圖10)。目的片段克隆、測序后發(fā)現(xiàn)它全長758nt。序列分析后發(fā)現(xiàn)，除掉它與RPGC1重疊片段后，還包含120nt序列(表1)，LPGC1中包含N-端全部已測出的22個氨基酸序列(表1下劃線部分)和1個起始密碼子AUG。起始密碼子前有50nt的5’端非編碼區(qū)。從序列分析結(jié)果可以證實，片段為PGC1基因的5’末端片段。將LPGC1和RPGC1從起始密碼子到終止密碼子的部分合并，得到PGC1cDNA序列。
利用將所獲的PGC1cDNA片段推測的氨基酸的序列，PGC1 cDNA的全長序列為1215個核苷酸組成，編碼產(chǎn)物N端21個氨基酸殘基構(gòu)成信號肽序列和383個氨基酸的PGC1的成熟蛋白，使用DNA Star軟件推測PGC1成熟蛋白的分子量和等電點，推測的成熟蛋白分子量是39.8kDa，等電點7.74。與通過SDS-PAGE和等電聚焦測定的分子量和等電點相吻合。確定該cDNA序列是PGC1蛋白的編碼基因。
表1PGC1蛋白的編碼基因cDNA 1 CT 23TCA ACA ACT CTT TGC ATC CTC TTG TCT TTG TCT CAC ACG AAT ATC 4748 ACA ATG GTT CGA AAC ATC GCT ATT GCG GCT TTG CTG CCA GCT GCC 92AAl Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala 1493 TTT GCT TCA ACG CTG CCT CGA GAT CCC TGC AGC GTG ACT GAC TAC 13715 Phe Ala Ser Thr Leu Pro Arg Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr29138 TCC GGC CTC GCC ACC GCC GTC TCA TCT TGC ACA AAC ATT GTG CTC 18230Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile ValLeu 44183 AAC GGT TTC CAA GTC CCC ACT GGC AAG GCT CTT GAT CTA TCC AAG 22745 Asn Gly Phe Gln Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys 59228 CTC AAG GAC GGC GCA ACC GTT ACC TTC AAG GGC AAG ACC ACG TTT 27260 Leu Lys Asp Gly Ala Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe 74273 GCC ACT ACT GCC GAT AAC GAC TTT GAT CCT ATC GTC ATT AGC GGA 31775 Ala Thr Thr Ala Asp Asn Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly 89318 AAT GGC ATC ACT ATA ACT GGT GCA TCT GGC CAT GTC ATT GAT GGT 36290 Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly 104363 AAC GGC CCG GCG TAC TGG GAT GGC GAA GGT TCT AAC AAC AAG AAA 407105 Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys 119408 AAC CCA AAG CCC GAC CAT TTC ATC GTT GTC AAG AAG ACT ACC GGC 452120 Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val Val Lys Lys Thr Thr Gly 134453 AAC TCA AAG ATC ACA AAC CTG AAC ATC CAG AAC TGG CCC GTT CAC 497135 Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln Asn Trp Pro Val His 149498 TGC TTC GAC ATC ACA GGC AGT TCA CAA TTG ACC ATC TCA GGG CTC 542150 Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr Ile Ser Gly Leu 164543 ATT CTT GAT AAC AGA CTT GGC GAC AAG CCC AAT GCC AAG AGC GGT 587165 Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala Lys Ser Gly 179588 AGC TTG CCC GCT GCG CAC AAC AGC GAC GGT TTC GAC ATC CCG TCC 632180 Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile Pro Ser 194633 AGT GAC CAC GTT ACT CTG GAT AAC ATT CAT GTT TAT AAC CAG GAT 677195 Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln Asp 209678 GAC TGT GTT GCT GTC ACT TCG GGT ACA AAC ATC ATC GTC TCC AAC 722210 Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn 224723 ATG TAC TGC TCC GGT GGT CAT GGT CTT AGC ATT GGA TCT GTT GGC 767225 Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly 239768 GGC AAG AGC AAC AAT GTC GTC AAT GGT GTT CAG TTC TTG GAT TCG 812240 Gly Lys Ser Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser 254813 CAG ATT GTT AAC AGT GAG AAT GGA TGC CGC ATC AAG TCC AAC TCT 857255 Gln Ile Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser 269858 GGC ACA ACT GGC ACG ATT GAG AAC GCC ACG TAC CAA AAC ATT GCC 902270 Gly Thr Thr Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala 284903 CTT ACC AAC ATC AGC AAA TAT GGT GTC GAT GTC CAG CAG GAC TAT 947285 Leu Thr Asn Ile Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr 299948 CTC AAC GGT GGC CCT ACT GGA AAG CCC ACC AAC GGA GTC AAG ATC 992300 Leu Asn Gly Gly Pro Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile 313993 AGC GGT ATC AAG TTC ATC AAG GTC ACT GGT ACA GTG GCT AGC TCT 1037315 Ser Gly Ile Lys Phe Ile Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser 3291038 GCT CAA GAT TGG TAT ATT CTG TGT GGC GAT GGT AGC TGC TCT GGA 1082330 Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly 3441083 TTC ACT TTC TCT GGA AAC GCC ATC ACT GGT GGT GGC AAG ACT AGC 1127345 Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser 3591128 AGC TGC AAC TAT CCT ACC AAC ACT TGC CCT AGC AAG GTC AAA GCG 1172360 Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys Pro Ser Lys Val Lys Ala 374
1173 GGA CGA TCA CCA CTC CAT GTT CAC AAA GCT AGA ACC CAG TCA AAG 1217375 Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala Arg Thr Gln Ser Lys 3891218 AGT GGT CTT ACG GTT GTT GCG TGG AAT TGC TGC GGC GGA CAG TTG 1262390 Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys Gly Gly Gln Leu1263 TGA GCT TGG GTC TAT AGT AGT ATT TGT CCG ATA GTC ACT AGG CTT 1307★1308 ATC TTA GCA ATA CAC TTT ATT TAT CGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA13521353 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA13971398 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA 1426注斜體部分為推測的氨基酸序列，一為已知PGC1蛋白N端測序部分， 為PGC1成熟蛋白N端編碼氨基酸。
香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆.ST25SEQUENCE LISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1426<212>DNA<213>Fusarium oxysporum f.sp.cubense<220>
<221>CDS<222>(51)..(1262)<400>1cttcaacaac tctttgcatc ctcttgtctt tgtctcacac gaatatcaca atg gtt 56Met Val1cga aac atc gct att gcg gct ttg ctg cca gct gcc ttt gct tca acg 104Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala Ser Thr5 10 15ctg cct cga gat ccc tgc agc gtg act gac tac tcc ggc ctc gcc acc 152Leu Pro Arg Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr20 25 30gcc gtc tca tct tgc aca aac att gtg ctc aac ggt ttc caa gtc ccc 200Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu Asn Gly Phe Gln Val Pro35 40 45 50act ggc aag gct ctt gat cta tcc aag ctc aag gac ggc gca acc gtt 248Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala Thr Val55 60 65
acc ttc aag ggc aag acc acg ttt gcc act act gcc gat aac gac ttt 296Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn Asp Phe70 75 80gat cct atc gtc att agc gga aat ggc atc act ata act ggt gca tct 344Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly Ala Ser85 90 95ggc cat gtc att gat ggt aac ggc ccg gcg tac tgg gat ggc gaa ggt 392Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly Glu Gly100 105 110tct aac aac aag aaa aac cca aag ccc gac cat ttc atc gtt gtc aag 440Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val Val Lys115 120 125 130aag act acc ggc aac tca aag atc aca aac ctg aac atc cag aac tgg 488Lys Thr Thr Gly Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln Asn Trp135 140 145ccc gtt cac tgc ttc gac atc aca ggc agt tca caa ttg acc atc tca 536Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr Ile Ser150 155 160ggg ctc att ctt gat aac aga ctt ggc gac aag ccc aat gcc aag agc 584Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala Lys Ser165 170 175ggt agc ttg ccc gct gcg cac aac agc gac ggt ttc gac atc ccg tcc 632Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile Pro Ser180 185 190agt gac cac gtt act ctg gat aac att cat gtt tat aac cag gat gac 680Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln Asp Asp195 200 205 210tgt gtt gct gtc act tcg ggt aca aac atc atc gtc tcc aac atg tac 728Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn Met Tyr215 220 225
tgc tcc ggt ggt cat ggt ctt agc att gga tct gtt ggc ggc aag agc 776Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly Lys Ser230 235 240aac aat gtc gtc aat ggt gtt cag ttc ttg gat tcg cag att gtt aac 824Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile Val Asn245 250 255agt gag aat gga tgc cgc atc aag tcc aac tct ggc aca act ggc acg 872Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr Gly Thr260 265 270att gag aac gcc acg tac caa aac att gcc ctt acc aac atc agc aaa 920Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile Ser Lys275 280 285 290tat ggt gtc gat gtc cag cag gac tat ctc aac ggt ggc cct act gga 968Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro Thr Gly295 300 305aag ccc acc aac gga gtc aag atc agc ggt atc aag ttc atc aag gtc 1016Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile Lys Val310 315 320act ggt aca gtg gct agc tct gct caa gat tgg tat att ctg tgt ggc 1064Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu Cys Gly325 330 335gat ggt agc tgc tct gga ttc act ttc tct gga aac gcc atc act ggt 1112Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile Thr Gly340 345 350ggt ggc aag act agc agc tgc aac tat cct acc aac act tgc cct agc 1160Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys Pro Ser355 360 365 370aag gtc aaa gcg gga cga tca cca ctc cat gtt cac aaa gct aga acc 1208Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala Arg Thr375 380 385
cag tca aag agt ggt ctt acg gtt gtt gcg tgg aat tgc tgc ggc gga 1256Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys Gly Gly390 395 400cag ttg tgagcttggg tctatagtag tatttgtccg atagtcacta ggcttatctt 1312Gln Leuagcaatacac tttatttatc gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1372aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1426<210>2<21l>404<212>PRT<213>Fusarium oxysporum f.sp.cubense<400>2Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala1 5 10 15Ser Thr Leu Pro Arg Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu20 25 30Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu Asn Gly Phe Gln35 40 45Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala50 55 60Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn65 70 75 80Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly85 90 95Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly100 105 110Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val115 120 125
Val Lys Lys Thr Thr Gly Ash Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln130 135 140Asn Trp Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr145 150 155 160Ile Ser Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala165 170 175Lys Ser Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile180 185 190Pro Ser Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln195 200 205Asp Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn210 215 220Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly225 230 235 240Lys Ser Asn Ash Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile245 250 255Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr260 265 270Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile275 280 285Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro290 295 300Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile305 310 315 320Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu325 330 335Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile340 345 350Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys355 360 365
Pro Ser Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala370 375 380Arg Thr Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys385 390 395 400Gly Gly Gln Leu
權(quán)利要求
1.一種香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因，其核苷酸序列，PGC1cDNA的全長序列如下cttcaacaac tctttgcatc ctcttgtctt tgtctcacac gaatatcaca atg gtt 56cga aac atc gct att gcg gct ttg ctg cca gct gcc ttt gct tca acg104ctg cct cga gat ccc tgc agc gtg act gac tac tcc ggc ctc gcc acc152gcc gtc tca tct tgc aca aac att gtg ctc aac ggt ttc caa gtc ccc200act ggc aag gct ctt gat cta tcc aag ctc aag gac ggc gca acc gtt248acc ttc aag ggc aag acc acg ttt gcc act act gcc gat aac gac ttt296gat cct atc gtc att agc gga aat ggc atc act ata act ggt gca tct344ggc cat gtc att gat ggt aac ggc ccg gcg tac tgg gat ggc gaa ggt392tct aac aac aag aaa aac cca aag ccc gac cat ttc atc gtt gtc aag440aag act acc ggc aac tca aag atc aca aac ctg aac atc cag aac tgg488ccc gtt cac tgc ttc gac atc aca ggc agt tca caa ttg acc atc tca536ggg ctc att ctt gat aac aga ctt ggc gac aag ccc aat gcc aag agc584ggt agc ttg ccc gct gcg cac aac agc gac ggt ttc gac atc ccg tcc632agt gac cac gtt act ctg gat aac att cat gtt tat aac cag gat gac680tgt gtt gct gtc act tcg ggt aca aac atc atc gtc tcc aac atg tac728tgc tcc ggt ggt cat ggt ctt agc att gga tct gtt ggc ggc aag agc776aac aat gtc gtc aat ggt gtt cag ttc ttg gat tcg cag att gtt aac824agt gag aat gga tgc cgc atc aag tcc aac tct ggc aca act ggc acg872att gag aac gcc acg tac caa aac att gcc ctt acc aac atc agc aaa920tat ggt gtc gat gtc cag cag gac tat ctc aac ggt ggc cct act gga968aag ccc acc aac gga gtc aag atc agc ggt atc aag ttc atc aag gtc1016act ggt aca gtg gct agc tct gct caa gat tgg tat att ctg tgt ggc1064gat ggt agc tgc tct gga ttc act ttc tct gga aac gcc atc act ggt1112ggt ggc aag act agc agc tgc aac tat cct acc aac act tgc cct agc1160aag gtc aaa gcg gga cga tca cca ctc cat gtt cac aaa gct aga acc1208cag tca aag agt ggt ctt acg gtt gtt gcg tgg aat tgc tgc ggc gga1256cag ttg tgagcttggg tctatagtag tatttgtccg atagtcacta ggcttatctt 1312agcaatacac tttatttatc gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1372aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1426其PGC1的氨基酸序列如下Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala1510 15Ser Thr Leu Pro Arg Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu20 25 30Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile ValLeu Asn Gly Phe Gln3540 45Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala5055 60Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn65 7075 80Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly8590 95Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly100 105 110Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val115 120 125Val Lys Lys Thr Thr Gly Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln130 135 140Asn Trp Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr145 150 155 160Ile Ser Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala165 170 175Lys Ser Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile180 185 190Pro Ser Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln195 200 205Asp Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Ash210 215 220Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly225 230 235 240Lys Ser Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile245 250 255Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr260 265 270Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile275 280 285Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro290 295 300Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile305 310 315 320Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu325 330 335Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile340 345 350Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys355 360 365Pro Ser Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala370 375 380Arg Thr Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys385 390 395 400Gly Gly Gln Leu其中 Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser CysThr Asn Ile Val為已知PGC1蛋白N端測序部分， 為PGC1成熟蛋白N端編碼氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因克隆，其特征在于，根據(jù)已測的PGC1蛋白N末端編碼序列設(shè)計引物，以香蕉枯萎病菌4號生理小種菌株總RNA為模板，采用RT-PCR方法，合成cDNA的第一條鏈，5’RACE和3’RACE的方法克隆PGC1 cDNA的全長序列，推測出PGC1的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因，本發(fā)明還公開了一種香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因克隆，根據(jù)已測的PGC1蛋白N末端編碼序列設(shè)計引物，以香蕉枯萎病菌4號生理小種菌株總RNA為模板，采用RT－PCR方法，合成cDNA的第一條鏈，5’RACE和3’RACE的方法克隆PGC1 cDNA的全長序列，推測出PGC1的氨基酸序列。本發(fā)明獲得的PGC1基因cDNA序列，可以作為區(qū)分FOC1號和4號小種的依據(jù)；將PGC1基因轉(zhuǎn)化到真核微生物中，所表達的PGC1可以作為免疫蛋白抗原制作動物血清，作病原菌檢測使用；真核微生物表達產(chǎn)物可以代替病原菌作靶標物，廣泛篩選對PGC1有效的抗病基因，供香蕉抗枯萎病轉(zhuǎn)基因育種使用。
文檔編號C12N15/56GK1693464SQ20051003329
公開日2005年11月9日 申請日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日
發(fā)明者王振中, 王琪 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)