專利名稱：巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與利用酵母宿主系統(tǒng)和表達(dá)載體的重組生物技術(shù)領(lǐng)域有關(guān)系。一方面它涉及含有部分或全部巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID NO1)的新的DNA片段;再一方面它涉及含有來(lái)源于巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID NO1)的DNA片段的某些新載體;還有一個(gè)方面是它涉及到利用含有巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID NO1)片段的載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;再一個(gè)方面是它涉及利用上述的DNA片段來(lái)促進(jìn)異源蛋白質(zhì)在酵母中的表達(dá)和(或)分泌的問(wèn)題。
由于近年來(lái)重組DNA生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)有可能靠微生物來(lái)生產(chǎn)各種有用的多肽。諸如人生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞干擾素、人胰島素和人胰島素原等許多多肽都已經(jīng)由許多種微生物產(chǎn)生。繼續(xù)應(yīng)用現(xiàn)有的技術(shù)可望生產(chǎn)出其它各種各樣有用的多肽產(chǎn)物。
凡是擅長(zhǎng)于重組DNA技術(shù)的人對(duì)于這個(gè)領(lǐng)域所使用的基本技術(shù)都是熟悉的。目前，慣用的重組DNA技術(shù)所必要的一些基本部分包括(但不限于)(1)編碼一個(gè)或多個(gè)所需多肽的基因以及與該基因在宿主生物中表達(dá)所需要的在功能上相連接的適宜的控制序列;
(2)能夠?qū)⒃摶虿迦肫渲械妮d體;
(3)能夠被攜帶該基因的載體所轉(zhuǎn)化的適宜的宿主生物;
(4)如果想要使該異源蛋白質(zhì)分泌，則還需有一種能夠引導(dǎo)該異源蛋白質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑而后又從該細(xì)胞泌出的信號(hào)序列;
(5)轉(zhuǎn)化系統(tǒng);以及(6)選擇轉(zhuǎn)化體的方法。
可對(duì)重組基因的構(gòu)建物進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得該重組蛋白通過(guò)宿主的分泌途徑并被分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中。由于以下原因，使得分泌成為重組表達(dá)的一種好的模式。首先，某些異源蛋白對(duì)宿主生物具有毒性作用。當(dāng)這類異源基因產(chǎn)物被分泌而不在宿主中積累時(shí)，可能很少干擾正常的細(xì)胞功能。其次，某些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時(shí)并沒(méi)有活性，而在泌出后才具有活性。第三，產(chǎn)物分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中無(wú)需為了收回產(chǎn)物而破碎宿主細(xì)胞。當(dāng)產(chǎn)物處在培養(yǎng)基中時(shí)很容易純化并且有效地降低了成本。第四，由于重組產(chǎn)物處在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，從而還能夠連續(xù)收獲所要的產(chǎn)物而反復(fù)使用培養(yǎng)基。
大部分分泌蛋白最初是以前體或蛋白質(zhì)原的形式在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，它含有被稱作信號(hào)肽的附著的氨基末端延伸部分。信號(hào)肽在將附著的多肽轉(zhuǎn)移進(jìn)和(或)通過(guò)細(xì)胞諸界膜時(shí)發(fā)揮重要作用。然后該信號(hào)肽在分泌過(guò)程中或分泌之后被信號(hào)肽酶以蛋白質(zhì)水解方式斷裂，產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
通過(guò)將異源DNA編碼序列與編碼信號(hào)肽的DNA連接起來(lái)的辦法可以達(dá)到異源或外源蛋白的分泌。最好是把編碼該信號(hào)肽的信號(hào)序列分離出來(lái)，這將有利于分泌過(guò)程的進(jìn)行。
信號(hào)序列在創(chuàng)造表達(dá)載體時(shí)是非常有用的。利用這種載體便有可能轉(zhuǎn)化相容的宿主細(xì)胞，使它們產(chǎn)生和分泌異源基因產(chǎn)物。已經(jīng)有一些用于從酵母宿主中成功地分泌重組蛋白的引導(dǎo)序列的例子，包括來(lái)源于釀酒酵母的α-配合因子、a-配合因子以及殺傷毒素基因的引導(dǎo)序列。目前還未有從甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母(如巴斯德畢赤酵母)中分離信號(hào)序列的報(bào)道。
方便的是，這類載體中用以調(diào)節(jié)異源基因產(chǎn)物表達(dá)的啟動(dòng)子也許就是與信號(hào)序列天然相聯(lián)的啟動(dòng)子。如果與信號(hào)序列天然相聯(lián)的啟動(dòng)子能實(shí)現(xiàn)高水平的DNA轉(zhuǎn)錄并對(duì)外源環(huán)境刺激物作出反應(yīng)的話就更加有利。這類啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例就是巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶(PHO1)基因的5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2，它在培養(yǎng)基缺乏磷酸鹽時(shí)實(shí)現(xiàn)高度轉(zhuǎn)錄，而在培養(yǎng)基中存在磷酸鹽時(shí)則被阻遏。
用重組DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主，使其在巴斯德畢赤酵母基因組的精確位置上整合，這種處理常常得到令人滿意的結(jié)果。連接于巴斯德畢赤酵母PHO1基因側(cè)面的5′-和3′-序列，亦即被分別稱作可插入的第一和第二DNA片段，被用在表達(dá)載體中以引導(dǎo)重組序列在PHO1座位的整合。有能力在PHO1座位整合重組DNA是有利的，這至少有兩個(gè)理由一是有利于在PHO1座位或另一畢赤酵母座位上具有多拷貝的相同或不同表達(dá)盒的巴斯德畢赤酵母表達(dá)菌株的發(fā)育，二是有利于一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒只在PHO1座位穩(wěn)定整合，就巴斯德畢赤酵母菌株宿主來(lái)說(shuō)，其中主要基因或影響甲醇代謝途徑的基因被插入失活是很討厭的。
有些細(xì)胞，當(dāng)其中的PHO1基因被插入失活時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)喪失酸性磷酸酶活性的現(xiàn)象。通過(guò)將細(xì)胞涂布在低磷酸鹽指示劑平板上并讓菌落生長(zhǎng)過(guò)夜，便可篩選出顯示PHO1基因被插入失活的pho-表現(xiàn)型。PHO1基因遭到插入失活的菌落為白色，而具有完整的PHO1基因的菌落為綠色。這種比色篩選法提供了一種迅速而簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，它能夠檢測(cè)出表達(dá)盒已正確地整合于PHO1座位上從而將原有的基因破壞了的細(xì)胞。
因此，如果能夠分離出有助于宿主細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的信號(hào)序列，對(duì)DNA生物技術(shù)無(wú)疑會(huì)是一個(gè)重大的貢獻(xiàn)。
另外，分離出能夠?qū)崿F(xiàn)DNA高水平轉(zhuǎn)錄并對(duì)外源環(huán)境刺激作出反應(yīng)的5′-調(diào)節(jié)區(qū)大概會(huì)有好處。就目前已知的本領(lǐng)域的技術(shù)說(shuō)，以前還沒(méi)有分離出過(guò)一種5′-調(diào)節(jié)區(qū)，在缺乏磷酸鹽的培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)高水平轉(zhuǎn)錄，而且可以被用于巴斯德畢赤酵母的高效率的發(fā)酵生產(chǎn)。
分離出酸性磷酸酶(AP)結(jié)構(gòu)基因也將是有好處的。
提供包含酸性磷酸酶基因片斷的新載體大概也是有益的。
分離出3′-轉(zhuǎn)錄終止序列會(huì)更好。
提供直接整合于巴斯德畢赤酵母PHO1座位的整合載體也總是有益的。
提供鑒定插入失活基因的方法又多一分好處。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供有助于從細(xì)胞中分泌蛋白質(zhì)的信號(hào)序列。
本發(fā)明的目的之二是提供在無(wú)磷酸鹽的條件下轉(zhuǎn)錄的5′-調(diào)節(jié)區(qū)。
本發(fā)明的目的之三是提供巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶結(jié)構(gòu)基因的DNA序列(SEQ ID NO4)。
本發(fā)明的目的之四是提供一些新的載體，它們包含至少編碼一種多肽的異源DNA序列以及與它連接而使其成為可操縱的調(diào)節(jié)區(qū)和(或)信號(hào)序列，并提供誘導(dǎo)該調(diào)節(jié)區(qū)以促進(jìn)異源DNA序列表達(dá)的方法。
本發(fā)明的目的之五是提供出自酸性磷酸酶基因的3′-轉(zhuǎn)錄終止序列。
本發(fā)明的目的之六是提供直接整合于巴斯德畢赤酵母PHO1座位的整合載體。
本發(fā)明的目的之七是提供一種鑒定插入失活成分的方法。
以下的說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)將逐步闡明本發(fā)明的其它的方面、目的及優(yōu)點(diǎn)。
按照本發(fā)明必將得到一種新的DNA片段，它包含有助于從細(xì)胞向外分泌蛋白質(zhì)的巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因的信號(hào)序列(SEQ ID NO3)。
本發(fā)明還提供一種包含巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)的新的DNA片段。
本發(fā)明另外又提供了一種包含巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶(AP)結(jié)構(gòu)基因DNA序列(SEQ ID NO4)的新的DNA片段。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供了一些新的載體，它包含編碼至少一種多肽的異源DNA序列以及與它連接使其成為可操縱的調(diào)節(jié)區(qū)和(或)信號(hào)序列，而且提供誘導(dǎo)該調(diào)節(jié)區(qū)以促進(jìn)該異源DNA序列表達(dá)的方法。
另一方面本發(fā)明提供一些新的DNA載體，它們包含來(lái)自巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因的3′-轉(zhuǎn)錄終止序列(SEQ ID NO5)。
本發(fā)明還提供由載體直接整合于巴斯德畢赤酵母PHO1座位的一些整合載體。
本發(fā)明還提供了鑒定插入失活成分的方法。


圖1示巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID NO1)的限制性酶切圖譜。
本發(fā)明提供了一種包含酸性磷酸酶基因(SEQ ID NO1)的新的分離DNA片段，它包括取自巴斯德畢赤酵母的啟動(dòng)子(或5′-調(diào)節(jié)區(qū))、信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止符號(hào)及其側(cè)翼序列。
酸性磷酸酶(AP)是巴斯德畢赤酵母和其它酵母在缺乏無(wú)機(jī)磷酸鹽條件下分泌的胞外酶。所分泌的酸性磷酸酶催化有機(jī)底物從中分離出磷酸鹽來(lái)，以便細(xì)胞利用這種磷酸鹽來(lái)維持生長(zhǎng)和存活。
已從數(shù)個(gè)酵母種中分離出編碼酸性磷酸酶的基因并對(duì)其進(jìn)行過(guò)研究，已確定酸性磷酸酶基因表達(dá)的可調(diào)節(jié)特性位于酸性磷酸酶啟動(dòng)子單元。在培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)磷酸鹽濃度較低的條件下，酸性磷酸酶啟動(dòng)子(或5′調(diào)節(jié)區(qū))“啟動(dòng)”，酸性磷酸酶基因被轉(zhuǎn)錄，而接著被翻譯成酸性磷酸酶。新合成的酸性磷酸酶從有機(jī)底物中釋放出磷酸鹽而供細(xì)胞利用。磷酸鹽濃度的增加反過(guò)來(lái)又調(diào)節(jié)酸性磷酸酶啟動(dòng)子，結(jié)果導(dǎo)致酸性磷酸酶基因轉(zhuǎn)錄的下降，伴隨著對(duì)酸性磷酸酶蛋白需求的減少。因此，低濃度和高濃度的磷酸鹽分別能夠誘導(dǎo)和阻遏酸性磷酸酶啟動(dòng)子。巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶啟動(dòng)子的鑒定和分離非常重要。在這類酵母種中分析過(guò)酸性磷酸酶的表達(dá)過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同種類中對(duì)這一過(guò)程的調(diào)節(jié)是不相同的，因此，可以預(yù)料在巴斯德畢赤酵母中所觀察到的對(duì)酸性磷酸酶表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)節(jié)將取決于所能得到的同源啟動(dòng)子序列及其可以利用的程度。
鑒定和分離巴斯德畢赤酵母PHO1基因信號(hào)序列(SEQ ID NO3)的重要意義在于除了它是第一個(gè)從巴斯德畢赤酵母基因中分離出的信號(hào)序列之外，它還是第一個(gè)從甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母分離出的信號(hào)序列。已發(fā)現(xiàn)該信號(hào)序列在引導(dǎo)異源蛋白質(zhì)(如tPA或轉(zhuǎn)化酶)從巴斯德畢赤酵母分泌方面等同于或優(yōu)于天然的基因信號(hào)序列，如來(lái)自tPA(組織纖維蛋白溶酶原激活劑)或轉(zhuǎn)化酶基因的信號(hào)序列。
最好能將重組表達(dá)載體整合到宿主基因組中，而不是將它們作為自主復(fù)制單元加以維持。整合載體要比自主載體穩(wěn)定得多，而它正是實(shí)施本發(fā)明所優(yōu)選的。具體說(shuō)，優(yōu)選的是美國(guó)專利4，882，279(引入本文參考文獻(xiàn))中所述的線性特異定點(diǎn)整合載體。這類載體包含一連續(xù)排列的序列，至少包括1)可插入的第一DNA片段;2)可選擇的標(biāo)記基因;和3)可插入的第二DNA片段。
可插入的第一和第二DNA片段的長(zhǎng)度每個(gè)至少約為200個(gè)核苷酸，并且具有與將要轉(zhuǎn)化的物種的基因組DNA若干部分同源的核苷酸序列。整合載體中的各種成分連續(xù)排列，形成DNA線性片段，使得表達(dá)盒和可選擇的標(biāo)記基因位于可插入的第一DNA片段的3′-末端與可插入的第二DNA片段與5′末端之間。可插入的第一和第二DNA片段如同在親本基因組中一樣以同一方向相繼線性排列。
用作第一和第二可插入的DNA片段的核苷酸序列是與天然基因組將出現(xiàn)基因組修飾的座位的各另部分同源的核苷酸序列。舉例來(lái)說(shuō)，如果要基因組修飾過(guò)程出現(xiàn)在酸性磷酸酶基因座位，所使用的可插入的第一和第二DNA片段必須是與酸性磷酸酶基因座位的各別部分同源的序列。為了實(shí)現(xiàn)基因組修飾，線性片段中的兩個(gè)可插入的DNA片段必須方面一致地相繼排列，并與它們的親本基因組的方向一樣。一組包含酸性磷酸酶PHO1基因、醇氧化酶AOX1基因、組氨醇脫氫酶HIS4基因以及二羥丙酮合成酶DHAS基因等一些基因中選出的核苷酸序列可以用作第一和第二可插入的DNA片段的核苷酸序列的例子。
第一可插入的DNA片段可含有能操縱的調(diào)節(jié)區(qū)，該區(qū)可包括用于表達(dá)盒中的調(diào)節(jié)區(qū)。使用可插入的第一DNA片段作為表達(dá)盒的調(diào)節(jié)區(qū)是本發(fā)明的優(yōu)選的具體化。選擇一個(gè)或多個(gè)插入位點(diǎn)和3′-終止序列使3′端可以直接連接可插入的第一DNA片段。這個(gè)位點(diǎn)特異的線性整合載體構(gòu)型的另一優(yōu)點(diǎn)是提供了一個(gè)插入結(jié)構(gòu)基因的方便的位點(diǎn)，而不必加進(jìn)另一個(gè)能相容的3′-終止序列。
此外，必須將至少一個(gè)可選擇的標(biāo)記基因包括在用于轉(zhuǎn)化宿主菌株的DNA中。它有助于篩選和分離已摻入轉(zhuǎn)化DNA的那些生物體。標(biāo)記基因?yàn)楸晦D(zhuǎn)化生物體提供了其宿主所不具有的表現(xiàn)型特性，例如恢復(fù)產(chǎn)生特定氨基酸的能力(未轉(zhuǎn)化的宿主在特定氨基酸生物合成途徑中存在缺陷)或?qū)咕氐目剐缘?。典型的可選擇標(biāo)記基因可以選自一組包含巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母的HIS4基因和ARG4基因、釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酶基因(SUC2)以及大腸桿菌的轉(zhuǎn)座因子Tn601或Tn903的G418R卡那霉素抗性基因。
如果可插入的第一DNA片段不含有調(diào)節(jié)區(qū)，則需要插入一合適的調(diào)節(jié)區(qū)并將其連接至結(jié)構(gòu)基因而使其成為可操縱的，以便提供一種可操縱的表達(dá)盒。同樣，如果在插入位點(diǎn)沒(méi)有提供3′-終止序列以完成表達(dá)盒，則必須將-3′-終止序列連接至所要插入的結(jié)構(gòu)基因中而使其成為可操縱的。
在對(duì)宿主細(xì)胞不產(chǎn)生有害作用的基因組位置上實(shí)現(xiàn)整合是很重要的。在巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因座位(PHO1)上的重組表達(dá)構(gòu)建物的整合對(duì)畢赤酵母宿主無(wú)害，并且重組序列得到穩(wěn)定的整合，這是一個(gè)驚人的發(fā)現(xiàn)。通過(guò)使用巴斯德畢赤酵母PHO1基因側(cè)面的5′-和3′-序列(也被稱作可插入的第一和第二DNA片段)可在重組基因表達(dá)載體中實(shí)現(xiàn)在PHO1座位上的定點(diǎn)整合。
進(jìn)一步又發(fā)現(xiàn)了篩選已轉(zhuǎn)化細(xì)胞以鑒定出那些通過(guò)破壞PHO1座位而將表達(dá)載體序列整合的細(xì)胞的方法。PHO1基因已被插入破壞的細(xì)胞相應(yīng)地表現(xiàn)出喪失酸性磷酸酶活性的現(xiàn)象。通過(guò)將細(xì)胞涂布在低磷酸鹽指示劑平板上并讓菌落生長(zhǎng)過(guò)夜可篩選出指示PHO1已被破壞的pho-表現(xiàn)型。平板上PHO1基因已被破壞的菌落為白色，而具有完整PHO1基因的菌落則為綠色。這一比色篩選法提供了一種檢測(cè)表達(dá)盒已正確地整合于PHO1座位上的細(xì)胞的快速而簡(jiǎn)便的方法。
圖1繪制了巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID NO1)的部分限制性酶切圖譜。表1所提供的核苷酸序列進(jìn)一步描繪出這個(gè)基因的特性。
本發(fā)明也提供了一些新的DNA片段，包括巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)、信號(hào)序列(SEQ ID NO3)、結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO4)和3′-轉(zhuǎn)錄終止序列(SEQ ID NO5)。
以下各表表示巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID NO1)及其片段的序列。
表 1酸性磷酸酶基因SEQ ID NO:1:
BamHI -390 -370 -350GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC-330 -310 -290ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA-270 -250 -230AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC-210 -190 -170TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG-150 -130 -110TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG-90 -70 -50TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA-30 -10 10ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGACATGTTTTCTCCTATTCTAAGTMetPheSerProlleLeuSer
30 50 70CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGGTTGAGTTGCAGCACLeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAlaValGluLeuGlnHis90 110 BclI 130GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTGValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu150 170 190AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAGArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu210 230 250TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGASerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg270 290 310TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCTTyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla330 350 370GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCTAspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer390 410 430GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCTAspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla450 470 490TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAAPheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu510 530 550GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTACGlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr570 590 610TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAAPheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu630 650 670GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAACGluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn690 710 730AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGASerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg750 770 790TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTALeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu
810 830 850TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGATyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg870 890 910GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAACGluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn930 950 970GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTGGlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu990 1010 1030GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACCGluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr1050 1070 1090GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGACAspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp1110 1130 NcolCAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTGGinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu1170 1190 1210CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATCLeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle1230 1250 1270CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCGLeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro1290 1310 1330TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAACLeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn1350 1370 1390TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTGCysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu1410 1430 1450TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGASerEnd1470 1490 1510ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA1530 1550 1570ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAGBamHIGTTCAATGGATCC
表 25′-調(diào)節(jié)區(qū)SEQ ID NO:2:
BamHI -390 -370 -350GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC-330 -310 -290ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA-270 -250 -230AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC-210 -190 -170TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG-150 -130 -110TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG-90 -70 -50TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA-30 -10ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGAC表 3信號(hào)序列SEQ ID NO:3:
10ATGTTTTCTCCTATTCTAAGTPHO1 signal sequence -->etPheSerProlleLeuSer30 50CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGLeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAla
表 4酸性磷酸酶結(jié)構(gòu)基團(tuán)SEQ ID NO:4:
70GTTGAGTTGCAGCACValGluLeuGlnHis90 110 Bcll 130GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTGValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu150 170 190AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAGArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu210 230 250TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGASerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg270 290 310TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCTTyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla330 350 370GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCTAspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer390 410 430GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCTAspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla450 470 490TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAAPheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu510 530 550GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTACGlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr570 590 610TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAAPheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu630 650 670GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAACGluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn690 710 730AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGASerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg
750 770 790TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTALeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu810 830 850TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGATyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg870 890 910GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAACGluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn930 950 970GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTGGlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu990 1010 1030GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACCGluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr1050 1070 1090GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGACAspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp1110 1130 NcolCAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTGGinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu1170 1190 1210CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATCLeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle1230 1250 1270CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCGLeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro1290 1310 1330TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAACLeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn1350 1370 1390TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTGCysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeuTCATAASerEnd
表 53′-轉(zhuǎn)錄終止序列SEQ ID NO:5:
1410 1430 1450AAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA1470 1490 1510ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA1530 1550 1570ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAGBamHIGTTCAATGGATCC
利用以下例實(shí)施所提出的方法從NRRLY-11430之類的巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物中回收酸性磷酸酶基因。回收巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID NO1)的一般方法包括使用酸性磷酸酶探針，例如下述實(shí)例中所描寫(xiě)的低磷酸鹽(LP)探針，來(lái)篩選巴斯德畢赤酵母DNA庫(kù)。其它探針則可根據(jù)表1所揭示的序列進(jìn)行選擇或合成。探針雜交則可按照本領(lǐng)域技術(shù)熟練的人員知道的任何合適的方案來(lái)完成。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可制備巴斯德畢赤酵母DNA庫(kù)，這些技術(shù)包括但不限于Gregg等(1985)在Mol.Cell Bio.5，3376-3385中所描述的方法。
此外也可以選擇利用已知的酶學(xué)的或化學(xué)的方法合成表1-5中所限定的適當(dāng)序列而得到酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)、信號(hào)序列(SEQ ID NO3)、結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO4)和3′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO5)。合適的方法包括根據(jù)磷酸三酯、亞磷酸鹽或氰乙基膦酰亞氨的化學(xué)而采用的化學(xué)處理方法，但也不限于此。
本領(lǐng)域技術(shù)熟練的人員也都會(huì)知道，由于可能發(fā)生的克隆變異或序列分析錯(cuò)誤，本發(fā)明分離的巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)、信號(hào)序列(SEQ ID NO3)、結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO4)和3′-轉(zhuǎn)錄終止序列(SEQ ID NO5)與后來(lái)分離的巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)、信號(hào)序列、結(jié)構(gòu)基因和3′-轉(zhuǎn)錄終止序列相比可能存在極少量的核苷酸差異。
也可對(duì)巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)、信號(hào)序列(SEQ ID NO3)、結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO4)和3′-轉(zhuǎn)錄終止序列(SEQ ID NO5)進(jìn)行修飾，例如加進(jìn)聯(lián)接DNA或進(jìn)行誘變(如M13誘變)以提供或除去一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)等。
一旦得到巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因，便可以將它在真核或原核的質(zhì)粒宿主系統(tǒng)中保存或復(fù)制，例如，保存在大腸桿菌里的pBR322中，或本領(lǐng)域已知的任何其它合適的系統(tǒng)中。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)熟練的人員也都知道，還可以將各種附加的DNA序列插入所使用的載體，諸如細(xì)菌質(zhì)粒DNA、各種標(biāo)記基因、噬菌體DNA、自主復(fù)制序列以及著絲粒DNA等，本文只列舉少數(shù)幾個(gè)有代表性的范例。
酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)位于圖1和表2所示的DNA片段的-399位核苷酸與0位核苷酸之間。當(dāng)該片段被連接并定位于編碼至少一個(gè)多肽的異源DNA序列的5′-末端而成為可操縱的序列時(shí)，它能夠影響DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的過(guò)程。
為了利用這里所揭示的酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)，可將圖1和表2所述的片段連接到至少編碼一個(gè)多肽的異源DNA序列上使其成為可操縱的序列。為了這里的說(shuō)明方便起見(jiàn)，異源DNA序列都是指非天然存在于宿主中或者與上述的調(diào)節(jié)區(qū)相連合的DNA序列的總稱?？膳c酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)連接而成為可操縱的至少編碼一個(gè)多肽的合適的異源DNA序列，包括(但不限于)組織纖維蛋白溶酶原激活劑、人血清白蛋白和轉(zhuǎn)化酶。利用本發(fā)明所使用的異源DNA序列應(yīng)含有一個(gè)5′ATG起始密碼子，一個(gè)3′終止密碼子，還可附帶包括一些其作用為穩(wěn)定mRNA或指導(dǎo)多聚腺苷酸化的核苷酸序列。
可將與異源DNA序列連接而成為可操縱的酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)插入合適的載體中?？赡軙?huì)有多種酵母載體-宿主結(jié)合物產(chǎn)生，本領(lǐng)域技術(shù)熟練的人員也都對(duì)此有所了解。該載體中也可出現(xiàn)其它序列，諸如標(biāo)記基因或其它能使載體有本事在細(xì)菌或酵母中擴(kuò)增或快速繁殖的一些序列。
能夠被含有酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)的載體所轉(zhuǎn)化的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括諸如酵母屬、畢赤酵母屬和漢遜酵母屬等等所屬的酵母，而優(yōu)選的是畢赤酵母，最優(yōu)選的是巴斯德畢赤酵母。
利用本領(lǐng)域技術(shù)熟練的人員所了解的任何適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化技術(shù)，都能夠用含有酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)的載體對(duì)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)受培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度的控制。具體地說(shuō)，低濃度磷酸鹽使該調(diào)節(jié)區(qū)去阻遏。因此，5′-調(diào)節(jié)區(qū)受培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度變化的調(diào)節(jié)。
酸性磷酸酶信號(hào)序列(SEQ ID NO3)存在于圖1和表3所示的DNA片段的第1位核苷酸至第66位左右的核苷酸之間。為了利用這里所揭示的酸性磷酸酶信號(hào)序例(SEQ ID NO3)，可將圖1和表3所述的DNA片段與至少編碼一種多肽的異源DNA序列連接使其成為可操縱的序列。合適的異源DNA序列包括但不限于選自組織纖維蛋白溶酶原激活劑、人血清白蛋白，和轉(zhuǎn)化酶類的DNA序列。
然后可將酸性磷酸酶信號(hào)序列(SEQ ID NO3)與異源DNA序列連接而成的可操縱序列一起聯(lián)接到合適的啟動(dòng)子上。選擇與前導(dǎo)序列相連的啟動(dòng)子作為這里應(yīng)用的啟動(dòng)子比較方便。此外還可以用允許轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的其它異源啟動(dòng)子代替天然存在的PHO1啟動(dòng)子。列入本文參考文獻(xiàn)的美國(guó)專利4，808，537中所揭示的巴斯德畢赤酵母醇氧化酶(AOX1)啟動(dòng)子(或5′-調(diào)節(jié)區(qū))就是合適的異源啟動(dòng)子的一個(gè)例子。
按照上述方法，可以得到能夠插入這種含有酸性磷酸酶信號(hào)序列(SEQ ID NO3)的DNA片段的合適載體。另外，可以被這樣造成的含有編碼信號(hào)序列的DNA片段轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞包括酵母屬、漢遜酵母屬和畢赤酵母屬等等的酵母，其中以巴斯德畢赤酵母比較更為合用。這些宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可利用本領(lǐng)域技術(shù)熟練的人員所了解的任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)完成。和出自這些載體(宿主)系統(tǒng)之一的蛋白質(zhì)連接而成為可操縱的信號(hào)序列可以指導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌上述蛋白質(zhì)。
酸性磷酸酶結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO4)存在于圖1和表4所示的DNA片段的第67位核苷酸與第1407位核苷酸之間。由于各種原因，重組生物技術(shù)可以把酸性磷酸酶結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO4)用于各種目的，其中包括但不限于(a)構(gòu)建適合于執(zhí)行插入失活的同源序列重組的DNA(這是一個(gè)將異源DNA序列在酸性磷酸酶座位插入巴斯德畢赤酵母基因組，從而破壞酸性磷酸酶基因活性的過(guò)程)。(b)生產(chǎn)酸性磷酸酶蛋白以用于各種生物檢測(cè)。
當(dāng)與編碼生產(chǎn)一種多肽的DNA序列的3′端連接而成為可操縱的序列時(shí)，酸性磷酸酶3′-轉(zhuǎn)錄終止序列(SEQ ID NO5)便終止mRNA的轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定mRNA。該酸性磷酸酶3′-轉(zhuǎn)錄終止序列(SEQ ID NO5)存在于圖1和表5所示的DNA片段的第1408位核苷酸與第1594位左右的核苷酸之間?？蓪⑺嵝粤姿崦?′-轉(zhuǎn)錄終止序列與編碼一種多肽的異源DNA序列連接而成為可操縱的序例，并用于諸如酵母屬、漢遜酵母屬和畢赤酵母屬等等的酵母中以終止mRNA的轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定mRNA，但尤其適用于巴斯德畢赤酵母。
下面提供一些非限制性實(shí)例以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施問(wèn)題。
菌株在以下的實(shí)施例中使用了下列菌株巴斯德畢赤酵母KM71(AOX1，his4)巴斯德畢赤酵母GS115(his4)NRRL Y-15851巴斯德畢赤酵母GS190(arg4)NRRL Y-18014巴斯德畢赤酵母GS247(Ade-)巴斯德畢赤酵母KM71GS102(Mut+)
巴斯德畢赤酵母GS115GS102(Mut-)巴斯德畢赤酵母MD100-20(his4，Ade-)巴斯德畢赤酵母MB102-26(pho-，his4，ade-)巴斯德畢赤酵母MB102-28巴斯德畢赤酵母MB102-51巴斯德畢赤酵母KM71pPSU216(Mut-)巴斯德畢赤酵母GS115pPSU216(Mut+)大腸桿菌JM103 δ(lac pro)thi rpsl(strA)supE endA sbcB hsdR弓形黑素瘤tPA過(guò)量表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)TCC＃CRL9607(人黑素瘤細(xì)胞)。
培養(yǎng)基、緩沖液和溶液下列實(shí)例中所用的培養(yǎng)基、緩沖液和溶液的組成如下LP培養(yǎng)基(低磷酸鹽)生物素 2ug/L泛酸鈣 400ug/L葉酸 2ug/L煙酸 400ug/L對(duì)-氨基苯甲酸 2ug/L鹽酸吡哆醇 400ug/L
核黃素 200ug/L硫胺素-Hcl 400ug/L硼酸 500ug/L硫酸銅 40ug/L碘化鉀 100ug/L氯化鐵 200ug/L硫酸錳 400ug/L硫酸鋅 400ug/L肌醇 2mg/L鉬酸鈉 200ug/L硫酸銨 5g/L一堿價(jià)磷酸鉀 30mg/L氧化鉀 1.5g/L氯化鈉 1.7mM氯化鈣 0.68mM硫酸鎂 4.2mMTE緩沖液Tris-HCl，pH8.0 10mMEDTA 1mMSSPE(1X)NaCl 180mM
Na3PO4，pH7.7 10mMEDTA 1mMSSC(1X)NaCl 150mM檸檬酸鈉 15mMDenhardt氏溶液(1X)菲科爾 200mg/L聚乙烯吡咯烷酮 200mg/L牛血清白蛋白 200mg/LREBLiCl 100mMTris-HCl，pH7.4 100mMEDTA 0.1mMPCl苯酚 500ml/L氯仿 480ml/L異戊醇 20ml/L
Cl氯仿 960ml/L異戊醇 40ml/LLP指示劑平板((升) 1XLP培養(yǎng)基22.5mM檸檬酸PH4.820g葡萄糖60mg5-溴，4-氯，3-吲哚基磷酸(Sigma)25gNoble瓊脂(Difco)SCE緩沖液 9.1g山梨醇1.47g檸檬酸鈉0.168gEDTA用鹽酸調(diào)節(jié)pH值5.8，并盛于50ml dH20和高壓滅菌器中YNB培養(yǎng)基 6.75g無(wú)氨基酸的酵母氮堿(DIFCO)于1升水中實(shí)施例1pLP24的構(gòu)建為了分離和鑒定巴斯德畢赤酵母的酸性磷酸酶基因(SEQID NO1)而進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。將巴斯德畢赤酵母GS115(NRRL Y-15851)分別培養(yǎng)在總體積均為300ml的高磷酸鹽環(huán)境〔含有無(wú)氨基酸的酵母含氮堿基(DIFCO)，2%葡萄糖，20mg/l組氨酸〕和低磷酸鹽環(huán)境(包含LP培養(yǎng)基，2%葡萄糖，20mg/l組氨酸)中。沉淀細(xì)胞后，用10mlREB一次洗滌，并重懸浮于盛4mlREB的30mlCorex試管中。然后加進(jìn)8g玻璃珠和4mlPCI。將懸浮液置旋渦振蕩攪拌器中高速攪拌8次，每次20秒鐘，同時(shí)在每次振蕩攪拌之后用冰冷卻20秒鐘。然后以10，000×g高速離心懸浮液10分鐘。上清液用4mlPCI和4mlCI萃取兩次。于-20℃用0.1倍體積的3M乙酸鉀(pH5.2)和2.5倍體積的乙醇從水相中沉淀RNA。按照Maniatis等人的方法(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)用LiCl代替NaCl可選擇出多聚-A+RNA。同樣按照Maniatis等人的方法，每種類型的多聚-A+RNA各用2ug，合成LP或HP mRNA標(biāo)記的cDNA探針。
從YEP13中的純化巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒基因文庫(kù)〔Broach等，Gene，8121(1979)〕中取60ng用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061(Mandel和Higa，1970 J.Mol.Biol.53154)。結(jié)果得到約8，000個(gè)菌落。讓這些菌落在兩張同樣的硝化纖維素濾膜復(fù)制上，并在含有100ug/ml氨芐青霉素和170ug/ml氯霉素的LB平板上擴(kuò)增，用標(biāo)準(zhǔn)方法(Grunstein和Wallis，1979，Methotls in Enzymology 68，379-389)溶菌后，于80℃中烘烤90分鐘，將二濾膜分別與LP或HP cDNA探針雜交。實(shí)行雜交時(shí)，每毫升雜交溶液使用2×SSPE、1×Denhardt氏溶液、0.2%十二烷基磺酸鈉(SDS)和2.5×105cpm標(biāo)記的cDNA探針。雜交過(guò)程在總體積25ml和55℃的條件下進(jìn)行40小時(shí)。雜交后，接著將濾膜在室溫下用2×SSC、0.1%SDS洗滌兩次，又在65℃下用0.2×SSC、0.1%SDS洗滌兩次。然后干燥并使其對(duì)x-光底片暴光。
共鑒定出24個(gè)基因組克隆，它們與LP cDNA探針雜交的能力比與HP cDNA探針雜交的能力更強(qiáng)，因此它們可能是含有某些編碼酸性磷酸酶基因的插入子。按照上述方法，再次用LP和HP探針對(duì)這24個(gè)克隆進(jìn)行篩選，其中有14個(gè)經(jīng)過(guò)再篩選的克隆還是更傾向于和LP cDNA探針雜交。逐個(gè)從這14個(gè)克隆中分離出質(zhì)粒DNA，用EcoRⅠ酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離，將漬跡吸印至兩張同樣的硝化纖維素濾膜上，每一張濾膜在與上述相同的條件下分別與LP或HP cDNA雜交，有4個(gè)獨(dú)立的克隆取得的基因片段與LP cDNA探針強(qiáng)烈雜交，而與HP cDNA探針的雜交很弱或根本不與HP cDNA探針雜交。然后用EcoRⅠ+HindⅢ，EcoRⅠ+SalⅠ和EcoRⅠ+BamHⅠ雙切消化，制備得這些片段的限制性酶切圖譜，并再次與LP cDNA探針雜交。這些片段與磷酸鹽調(diào)節(jié)基因的編碼無(wú)關(guān)，正切圖譜中所測(cè)定出的差別那樣。
將通過(guò)這一方法鑒定為編碼LP-調(diào)節(jié)基因的區(qū)段亞克隆至pUC8和pUC19(New England Biolab)。利用缺口翻譯法(Maniatis)將所得的質(zhì)粒用32P標(biāo)記。用這些標(biāo)記的質(zhì)粒去檢測(cè)LP和HP RNA的RNA印跡(5ug/印跡)。在24個(gè)原始克隆中選擇一個(gè)被鑒定為pLP24的克隆作進(jìn)一步的研究。
實(shí)施例ⅡpLP2411的構(gòu)建按以下方法對(duì)實(shí)施例Ⅰ中生產(chǎn)的被認(rèn)為含有巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID NO1)或其片段的質(zhì)粒pLP24進(jìn)一步加以鑒定。用EcoRⅠ/SalⅠ消化10ug的pLP24，并通過(guò)凝膠純化2.1kb片段。
用SphⅠ/SalⅠ消化10ug的pYM25(NRRLB-18015)并通過(guò)凝膠純化3.1kb片段。用EcoRⅠ/SalⅠ消化5ug的pUC19，再經(jīng)過(guò)PCI萃取、CI萃取和EtOH沉淀。用20ul連接緩沖液+1mmATP+1UT4DNA連接酶，將100ug的EcoRⅠ/SalⅠ線性化的pUC19與200ng的pLP24的2.1kb EcoRⅠ/SalⅠ片段以及450ug的pYM25的3.1kb sphⅠ/SalⅠ片段連接成功3成分連結(jié)物。轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，然后根據(jù)2.1kb EcoRⅠ/SalⅠ片段及3.1kb SphⅠ/SalⅠ片段的存在與否鑒定出符合要求的質(zhì)粒。這種質(zhì)粒被稱為pLP2411。
實(shí)施例ⅢpLP2412 PHO1-插入失活載體的構(gòu)建及GS190pLP2412的形成用XbaⅠ消化得自質(zhì)粒pLP24的質(zhì)粒pLP2411(見(jiàn)實(shí)施例Ⅱ)，用Klenow DNA多聚酶處理以形成平整末端，并與質(zhì)粒pYM25的2.1kg HpaⅠ片段連接。這個(gè)片段含有釀酒酵母ARG4基因(質(zhì)粒pYM25S可從當(dāng)作NRRL B-18015使用)。所產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pLP2412。然后用EcoRⅠ和BamHⅠ將pLP2412消化，將3.3kb片段分離，隨即用于把巴斯德畢赤酵母GS190(NRRL Y-18014)轉(zhuǎn)化成Arg+原養(yǎng)型(轉(zhuǎn)化方法如實(shí)施例Ⅳ所述)。根據(jù)其在缺乏精氨酸的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力大小可鑒別出精氨酸原養(yǎng)型。在LP指示劑平板上分離和篩選含有酸性磷酸酶的轉(zhuǎn)化株。將所得菌落在LP指示劑平板上重復(fù)鋪平板，并于30℃培養(yǎng)過(guò)夜。LP指示劑平板上的菌落要么為綠色(PHO 1)要么為白色(pho1)。白色菌落是巴斯德畢赤酵母基因組的PHO1座位已經(jīng)穩(wěn)定地整合了上述3.3kg表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化株。
通過(guò)Southern濾膜雜交分析Arg+穩(wěn)定菌株的基因組DNA以確定表達(dá)盒的位置。含有釀酒酵母ARG4基因的3.3kb的EcoRⅠ-BamHⅠ片段專一地整合和破壞的基因組序列與pLP2411中含有類似的DNA片段，從而證實(shí)該座位編碼酸性磷酸酶(PHO1)。該轉(zhuǎn)化株被命名為GS190pLP2412。
實(shí)施例Ⅳ轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母利用以下方案轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母。
將酵母細(xì)胞接種至約10ml的YPD培養(yǎng)基中，并于30℃搖動(dòng)培養(yǎng)16-20小時(shí)。然后稀釋細(xì)胞至在A600下吸收值大約為0.01-0.1的濃度，在YPD培養(yǎng)基中于30℃維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期6-8小時(shí)。在100ml的YPD培養(yǎng)基中接種0.5mlA600約為0.1的種子培養(yǎng)物，并于30℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)16-20小時(shí)。然后利用DAMON IEC DPR-6000離心機(jī)1500g離心5分鐘，收集培養(yǎng)物，其A600處的吸收值約為0.2至0.3(約16-20小時(shí)后)。
為了制備球狀體，用10ml無(wú)菌水、10ml新制備的SED和10ml無(wú)菌的1M山梨醇各洗滌細(xì)胞一次(每次洗滌后均按前述方法離心)，然后將其懸浮于5mlSCE緩沖液中。加入5ul 4mg/ml的酶解酶60，000(可從Miles藥廠購(gòu)得)，并將這些細(xì)胞于30℃培養(yǎng)約30分鐘。
按以下方法監(jiān)測(cè)原生質(zhì)球狀體的形成。在保溫過(guò)程的不同時(shí)期取樣檢測(cè)，在加入酶解酶之前或加入之后立即將每份100ul細(xì)胞分別加至900ul的5%SDS和900ul的1M山梨醇中，當(dāng)細(xì)胞在SDS中溶胞而在山梨醇中未溶胞時(shí)終止保溫。球狀體一旦形成則經(jīng)1，000g離心5-10分鐘在10ml 1M無(wú)菌山梨醇中洗滌一次，又經(jīng)離心用10ml無(wú)菌CaS洗滌一次。然后再次懸浮于0.6mlCaS中。
在實(shí)際轉(zhuǎn)化時(shí)，將水或TE緩沖液中的DNA樣品加至12×75mm無(wú)菌聚丙烯試管中(至總體積為20ul)。(對(duì)于小量的DNA來(lái)說(shuō)，每一樣品使用大約1ul的5ug/ml經(jīng)過(guò)超聲處理的大腸桿菌DNA時(shí)會(huì)產(chǎn)生最大的轉(zhuǎn)化)。向每一DNA樣品加入100ul球狀體，并于室溫下保溫約20分鐘。每一樣品加入1mlPEG溶液，并于室溫下保溫約15分鐘。將樣品于1，000g離心5-10分鐘并棄去上清液。其沉淀重新懸浮于150ulSOS中，并于室溫下保溫30分鐘。向每一樣品中加入850ul的1M無(wú)菌山梨醇，并按下述方法涂平板。
在進(jìn)行轉(zhuǎn)化前至少30分鐘，向每一平板倒入10ml再生瓊脂(Regcneration Agar)。另將每份10ml再生瓊脂分別加入45-50°水浴保溫的試管中，這時(shí)轉(zhuǎn)化樣品處于SOS中。然后將樣品加進(jìn)這些試管，之后鋪在含有固體瓊脂輔層的平板上。30℃保溫3-5天。
按以下方法測(cè)定不同點(diǎn)上原生質(zhì)球狀體的質(zhì)量。取10ul樣品，加入990ul的1M山梨醇中稀釋100倍。取10ul稀釋液，每份加入990ul 1M山梨醇。將每種100ul的兩種稀釋液分別鋪到Y(jié)PD瓊脂培養(yǎng)基上，測(cè)定殘留在制備物中未形成球狀體的完整細(xì)胞的濃度。將每種100ul的兩種稀釋液加至10ml已補(bǔ)充了40ug/ml宿主必需的全部氨基酸的再生瓊脂中，測(cè)定可再生的球狀體總數(shù)。在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)良值是1-3×107/ml個(gè)完全的可再生球狀體和大約1×103/ml個(gè)完整細(xì)胞。
實(shí)施例Ⅴ酵母DNA的制備方法利用以下方案制備巴斯德畢赤酵母DNA。
在加有2%葡萄糖的100mlYNB培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)酵母細(xì)胞，直至A600等于1-2為止。用Damon IECDPR-6000離心機(jī)2，000g離心5分鐘，將沉淀分別用dH2O、SED和1M山梨醇各洗滌1次。然后將其重新懸浮于1ml的0.1M Tris-HCl(pH7.0)和1M山梨醇的溶液中。將細(xì)胞與50-100ul濃度為4mg/ml的酶裂酶60，000(Miles藥廠)混合，30℃保溫1小時(shí)。然后將所得到的球狀體1，000g離心5-10分鐘，令其懸浮于5ml裂解緩沖液(0.1%SDS，10mM Tris-HCl(pH7.4)，5mM EDTA和50mM NaCl)中。然后將蛋白酶K(Boehringer Mannheim)和RNA酶A(Sigma)各按100ug/ml加入溶液，37℃保溫30分鐘，將制劑與等體積的CI輕輕混合而使DNA脫去蛋白質(zhì)，12，000g離心20分鐘使溶液分層。將上層(水相)移至清潔試管中，并用等體積的PCI萃取。按同樣方法分層，并將上層溶液加至含有2-3倍體積的100%冷乙醇的試管中。用一塑料棒輕輕攪拌樣品，將纏繞在棒上的DNA收集。隨即將DNA溶于1mlTE緩沖液中，并在4℃下置100倍體積的TE緩沖液中透析過(guò)夜。
實(shí)施例Ⅵ全長(zhǎng)PHO1基因的分離為了分離出含有完整的巴斯德畢赤酵母PHO1基因(SEQ ID NO1)，在前述條件下，將MC1061中的原始巴斯德畢赤酵母基因庫(kù)與pLP24的600bp BamHⅠ片段雜交。通過(guò)這一步驟，共鑒定出5個(gè)陽(yáng)性克隆。從這些克隆中制備出質(zhì)粒DNA，用BamHⅠ消化，將漬跡吸印至硝化纖維素濾膜，用同樣為600bp的探針雜交。5個(gè)克隆均含有2.0kg的BamHⅠ片段，它們都含有巴斯德畢赤酵母PHO1基因。選其中一個(gè)克隆作進(jìn)一步分析，并將其命名為pLP2420。
將限制酶消化片段亞克隆于M13(可用New England Biolabs的產(chǎn)品)上的標(biāo)準(zhǔn)二脫氧法，對(duì)pLP2420的2.0kb BamHⅠ片段進(jìn)行序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有468氨基酸的開(kāi)放閱讀框架完全包含2.0kg的BamHⅠ片段中。
實(shí)施例Ⅶ菌株MB120-26pLP2430-T1和MB102-26pLP2430-T3的培育將含有PHO1基因的pLP2420的2.0kbBamHⅠ片段連接至PYM8的BamHⅠ位點(diǎn)，它是一種含有釀酒酵母HIS4基因和pBR322序列的質(zhì)粒(pYM8質(zhì)?？砂匆韵路椒ㄖ苽溆胹phⅠ/ThaⅠ消化10ug的pYA2(NRRL B-15874)，并用凝膠過(guò)濾純化出3.4kg的片段。用SphⅠ/NruⅠ消化10ugpBR322并用凝膠過(guò)濾純化出3.95kb的片段，在標(biāo)準(zhǔn)條件下將100ng3.95kb的pBR322片段與250ng3.4kb的pYA2片段連接。根據(jù)3.1kgXhoⅠ/sphⅠ片段鑒定出所需質(zhì)粒，并命名為pYM8)。由此產(chǎn)生的質(zhì)粒被命名為pLP2430，它能夠利用位于釀酒酵母HIS4基因序列的碰巧帶上的具ARS(自主復(fù)制序列)功能在巴斯德畢赤酵母中自主復(fù)制。
將缺乏酸性磷酸酶活性的巴斯德畢赤酵母菌株GS190pLP2412(pho-)(見(jiàn)實(shí)施例Ⅲ)與巴斯德畢赤酵母菌株MD100-20(his4，Ade-)接合。接合方案與作為本文參考文獻(xiàn)的美國(guó)專利4，812，405中所公開(kāi)的方案相同。菌株MD100-20按以下方法培育在已知能促進(jìn)接合和二倍體形成的條件下，將巴斯德畢赤酵母菌株GS115(his4)NRRL Y-15851的細(xì)胞與菌株GS247(Ade-)混合(這一步驟見(jiàn)已列入本文參考文獻(xiàn)的U.S4，812，405)，然后鋪在YNB+葡萄糖平板上，從中篩選出原養(yǎng)型二倍體。該二倍體菌株被命名為MD100。在已知能夠誘導(dǎo)巴斯德畢赤酵母二倍體形成孢子的條件下(也見(jiàn)美國(guó)專利4，812，405)培養(yǎng)MD100，并將孢子子代鋪在YNB葡萄糖+腺嘌呤+組氨酸平板上培養(yǎng)。測(cè)定各個(gè)菌落在不補(bǔ)充腺嘌呤或組氨酸條件下的生長(zhǎng)能力。鑒定出在不補(bǔ)充組氨酸時(shí)能夠生長(zhǎng)但在不補(bǔ)充腺嘌呤時(shí)不能生長(zhǎng)的菌株，命名為MD100-20。
此雜交所產(chǎn)生的二倍體菌株MB102(pho+/pho-，HIS4/his4，Ade+/Ade-)在形成孢子時(shí)(U.S.4，812，405)將產(chǎn)生單倍體子代。在LP指示劑平板以及補(bǔ)加或未補(bǔ)加組氨酸或腺嘌呤的YNB平板上對(duì)這些子代進(jìn)行篩選，分離出MB102-26菌株(PHO-，his4，Ade-)。
按實(shí)施例Ⅳ所述的方法，用質(zhì)粒pLP2430轉(zhuǎn)化MB102-26菌株。選擇His+轉(zhuǎn)化株，并在LP指示劑平板上篩選表達(dá)酸性磷酸酶的菌株(見(jiàn)實(shí)施例Ⅲ)，有5個(gè)轉(zhuǎn)化株屬于表達(dá)酸性磷酸酶的陽(yáng)性菌株。
對(duì)這些轉(zhuǎn)化株中的MB102-26pLP2430-T1和MB102-26pLP2430-T3兩株進(jìn)行分析，以確定符合其酸性磷酸酶表達(dá)的特有的調(diào)節(jié)。每株都置于HP或LP培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，直至A600等于2.0。檢測(cè)每份培養(yǎng)物細(xì)胞的酸性磷酸酶的表達(dá)(Bostian等，1980;Proc.Nath.Acad.Sci.774504-4508)，與攜帶pho-的表現(xiàn)型的未轉(zhuǎn)化HIS4細(xì)胞(MB102-28)以及攜帶PHO的野生表現(xiàn)型的HIS4細(xì)胞(MB102-51)(表Ⅰ)進(jìn)行比較。pLP2430轉(zhuǎn)化株的誘導(dǎo)水平實(shí)際上與野生型菌株相同。因此，含有插入pLP2430的PHO1基因的2.0kbBamHⅠ片段，含有酸性磷酸酶的整個(gè)編碼區(qū)以及足以對(duì)酸性磷酸酶的表達(dá)進(jìn)行相應(yīng)的磷酸鹽調(diào)節(jié)的序列。
實(shí)施例Ⅷ轉(zhuǎn)化酶的分泌本實(shí)施例證明當(dāng)與異源基因連接而使其成為可操縱的序列時(shí)PHO1信號(hào)序列(SEQ ID NO3)發(fā)揮作用。從pSEYC3-6中分離出含有釀酒酵母SUC2基因的2.2kbSmaⅠ-PvuⅡ片段〔(Johnson等，Cell 48，875(1987)〕，并將其克隆至pA0810或pPSV218的SmaⅠ位點(diǎn)(見(jiàn)實(shí)施例Ⅺ和Ⅻ中對(duì)這些親本質(zhì)粒的敘述)。利用這一方法分別生產(chǎn)出質(zhì)粒pAPINV1和pAPINV2。它們利用巴斯德畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子調(diào)節(jié)從PHO1信號(hào)序列(SEQ ID NO3)到SUC2結(jié)構(gòu)基因的開(kāi)放閱讀框架的轉(zhuǎn)錄PHO1序列……GTGTTCGCTpSEYC306的連接子序列SUC2序列ACA AAC GAA…用BglⅡ消化分別為10ug的每個(gè)質(zhì)粒，pAPINV1或pAPINV2，并按實(shí)施例Ⅳ的同樣方法用于轉(zhuǎn)化GS115。從含有pAPINV1的BglⅡ片段的轉(zhuǎn)化株(稱作GS115pAPINV1)中選擇組氨酸原養(yǎng)型，并從中篩選出Mut-表現(xiàn)型，它表示AOX1座位被破壞并出現(xiàn)了某種整合。Mut的篩選是通過(guò)將菌落從含有葡萄糖的培養(yǎng)基印影培養(yǎng)到含有甲醇的培養(yǎng)基上并評(píng)估在甲醇上的生長(zhǎng)率而完成的。在甲醇上緩慢生長(zhǎng)說(shuō)明菌株為Mut-表現(xiàn)型。同樣從含有pAPINV2的Bgl Ⅱ片段的轉(zhuǎn)化株(命名為GS115pAPINV2)中選擇組氨酸原養(yǎng)型，便篩選的是phol-表現(xiàn)型，該表現(xiàn)型表示PHO1座位失活和出現(xiàn)了適當(dāng)?shù)恼?見(jiàn)實(shí)施例Ⅲ)。
鑒定各類轉(zhuǎn)化株，并將它們培養(yǎng)于YNB+2%甘油中，把它們與巴斯德畢赤酵母菌株KM71GS102(Mut-)和GS115GS102(Mut+)相比較，這兩個(gè)菌株都含有與pAPINV1相同的整合質(zhì)粒，而不同的是SUC2基因含有其天然信號(hào)序列且缺乏PHO1信號(hào)序列。EP256，421中描述過(guò)這兩種菌株。并行培養(yǎng)的菌株還有KM71pPSV216(Mut-)和GS115pPSV216(Mut+)，它們都含有與pAPIN2基本相同的整合質(zhì)粒，唯一不同的是缺少SUC2序列。
將各種培養(yǎng)物分別置于YNB+2%甘油中培養(yǎng)，直至A600約為3.0。從每一培養(yǎng)物中取出相同的一份試樣，經(jīng)無(wú)菌水洗滌后，重新懸浮于10ml YNB+0.5%MeOH中，重新懸浮Mut+培養(yǎng)物至A600＝0.02，重新懸浮Mut-至A600＝0.2，然后30℃培養(yǎng)24小時(shí)，至A600約為0.3-0.4。此時(shí)測(cè)得轉(zhuǎn)化酶的活性約為1.0mOD600。所得結(jié)果見(jiàn)表Ⅱ。
a分泌的轉(zhuǎn)化酶-按Goldstein和Lampen的方法測(cè)定，不用Triton增溶，數(shù)據(jù)表示轉(zhuǎn)化酶單位/測(cè)得的培養(yǎng)物A600。1單位＝釋放1umole葡萄糖/分，37℃。
b總轉(zhuǎn)化酶-在加入0.2%Triton X-100系列的條件下測(cè)定。
c分泌效率-分泌的轉(zhuǎn)化酶/測(cè)得的轉(zhuǎn)化酶總量。
d有PHOⅠ信號(hào)系列，無(wú)Suc2序列。
oGoldstein和Lampen方法，見(jiàn)Methods in Enzymology42504-511，1975。
所得結(jié)果清楚地說(shuō)明，在促進(jìn)巴斯德畢赤酵母分泌轉(zhuǎn)化酶方面，PHO1信號(hào)序列與SUC2信號(hào)序列起著同樣有效的作用。
實(shí)施例ⅨtPA(組織纖維蛋白溶酶原激活劑)的分泌本實(shí)施例證明，PHO1信號(hào)序列(SEQ ID NO3)與異源基因連接時(shí)發(fā)揮作用，使其成為可操縱的序列。
1.分離編碼tPA的cDNA利用Bower黑素瘤tPA過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞系A(chǔ)TCC＃CRL9607作為構(gòu)建cDNA庫(kù)的RNA的來(lái)源。有人曾利用這一細(xì)胞系克隆tPA序列(Pennica等，Nature 301214，1983;Edlund等，PNAS 80349，1983;Lemontt等，DNA 4419，1985)。通常按照Maniatis的方法(Molecular CloningA Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory，1982)，分離多聚A+RNA，并引入寡聚dT引物。利用市售的cDNA克隆盒(可用Amersham的產(chǎn)品)，用此RNA制備cDNA，并將其插入λgt11克隆載體。利用市售的包裝混合物(可用Stratagene的產(chǎn)品)，將含有插入子的λgt11噬菌體侵染至大腸桿菌宿主Y1088中。
將該庫(kù)一式三份鋪平板，并用三種不同的寡聚核苷酸探測(cè)，這三種寡聚核苷酸是依據(jù)所公開(kāi)的人的tPA cDNA序列(Pennica等，見(jiàn)前述)設(shè)計(jì)的。它們分別對(duì)應(yīng)于cDNA的5′、中間和3′部分，并具有下列序列3′探針GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA 3'中間探針5' TCA CAG TAC TCC CAC GTC AGC CTG CGG TTC 3'5′探針GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GAT TGC T 3'共鑒定出與所有三種探針雜交的5個(gè)噬菌斑。對(duì)這些克隆的插入物進(jìn)行限制性酶切消化，并根據(jù)已公布的限制性酶切圖式(Pennica等，同上)鑒定出它們是編碼tPA。這些克隆的差別僅在于5′-非編碼區(qū)出現(xiàn)的程度。由于克隆4和5在經(jīng)EcoRⅠ消化后含有0.8kb(5′末端)、0.47kb(中間)和1.3kb(3′-末端)的DNA插入物，使人聯(lián)想到存在著全長(zhǎng)的tPA編碼序列。因此把克隆4和5挑出來(lái)作進(jìn)一步的檢測(cè)。將克隆4的BglⅡ片段亞克隆至BamHⅠ切割的pUC18，并將所產(chǎn)生的連接物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Mc1061的細(xì)胞。通過(guò)EcoRⅠ酶切鑒定出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株。根據(jù)PstⅠ限制性酶切圖譜的420bp、624bp、760bp和2.7kb片段的存在鑒定出攜帶同義正向的插入物的克隆，命名為pUC18＃3。由PstⅠ按照420bp、624bp和3.4kb長(zhǎng)度進(jìn)行限制性酶切的克隆被鑒定為攜帶有插入反義方向的插入物的克隆，稱作pUC18＃2。該插入物從成熟tPA第一氨基酸之前的兩個(gè)核苷酸起接連通過(guò)3′-非編碼序列的1972個(gè)核苷酸進(jìn)行編碼。
2.構(gòu)建載體pT37(PHO1ss-tPA-pUC)
將pUC18＃2的tPA插入物克隆至巴斯德畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pA0810。質(zhì)粒pA0810由下列序列組成巴斯德畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子、巴斯德畢赤酵母PHO1信號(hào)序列、AOX1轉(zhuǎn)錄終止符、用于選擇的巴斯德畢赤酵母HIS4基因、f1復(fù)制起點(diǎn)以及用于在細(xì)菌中復(fù)制和選擇所必需的序列。實(shí)施例Ⅺ敘述了pA0810的構(gòu)建方法。
將2ug已預(yù)先在1%瓊脂糖凝膠上純化過(guò)的編碼tPA5′一端部分的pUC18＃2的1600bp SalⅠ/SmaⅠ片段與300ng用XhoⅠ/SmaⅠ消化過(guò)的pA0810連接。將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MC1061細(xì)胞中，并選擇ampR菌落。用PstⅠ消化后根據(jù)420bp、620bp、2kb和6.3kb片段圖譜鑒定出陽(yáng)性菌落。所產(chǎn)生的載體被稱作pT1。按照從f1起始復(fù)制載體的標(biāo)準(zhǔn)方法，進(jìn)行定點(diǎn)誘變，以刪去成熟的tPA編碼序列5′端的兩個(gè)額外核苷酸。誘變的寡核苷酸具有如下序列5′CAA TCT GTC TTC GCT TCT TAC CAA GTG ATC 3′用篩選SalⅠ/XbaⅠ消化的小樣制備(mini-preps)鑒定出所需要的質(zhì)粒。原始載體pT1的限制性酶切圖式格局為1.2、2.3和6.6kb按需要誘變的質(zhì)粒的酶切格局為1.2和9.8kb，稱為pT2-3。
用SmaⅠ/Sau3A消化50ug pUC18＃3。將編碼tPA3′部分的72-118bp之間的三條帶(75、90、110bp)在8%聚丙烯酰胺凝膠上純化后與0.5ugSmaⅠ/BamHⅠ切割的質(zhì)粒pT2-3連接。將連接物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MC1061細(xì)胞中，并選擇ampR菌落。用PvuⅡ/ApaⅠ消化過(guò)的小樣制備鑒定出陽(yáng)性菌落。所要的質(zhì)粒顯示出421bp片段(非所需要的質(zhì)粒顯示出225bp片段)。所要的載體稱為pT37。盡管5′-誘變已顯示具有所要的序列，但序列分析后發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒含有位于tPA3′非編碼序列末端的pUC18序列;并發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pT37具有pUC18的 Sau3A片段。位于1894-2004，緊接著t-PA序列。
用StuⅠ消化10ug質(zhì)粒pT37，并用它轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌株KM71(aox1，his4)。從轉(zhuǎn)化株中選擇組氨酸原養(yǎng)型。將轉(zhuǎn)化株KM71pT37在YNB+2%甘油上培養(yǎng)，并行培養(yǎng)的還有菌株KM71pT7，它含有與pT37基本相同的質(zhì)粒(pT7)，差別在于PHO1信號(hào)序列被天然人tPA信號(hào)序列代替和3′-末端的pUC18序列被除去。下文中將有對(duì)pT7的描述。將培養(yǎng)在YNB+2%甘油中的各種菌株的培養(yǎng)物以每種50ml接種至1升發(fā)酵罐中，以連接或分批加料方式培養(yǎng)。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表Ⅲ。
這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明，無(wú)論發(fā)醇方式如何，PHO1信號(hào)序列(SEQ ID NO3)在促進(jìn)巴斯德畢赤酵母分泌tPA上比天然信號(hào)序列更為有效。
另外，經(jīng)微量Edman降解分析證實(shí)，tPA的利用PHO1信號(hào)序列(SEQ ID NO3)建成的重組體的N-末端氨基酸序列，即由菌株KM71pT3分泌的tPA，與由培養(yǎng)的人組織(黑素瘤)純化得到的天然tPA相同。
3.構(gòu)建pT7(tPAss-tPA-no pUC)將5ug得自pUC18＃3的大約100bp的SmaⅠ/Sam3A片段與500ng SmaⅠ/BamHⅠ切割的pT1連接。把所得連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MC1061細(xì)胞中，選擇ampR菌落。用ApaⅠ/PvuⅡ消化，根據(jù)360bp帶而不是260bp帶的存在鑒定出陽(yáng)性菌落。對(duì)修飾過(guò)的3′末端進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)它具有所要的序列而不帶額外的pUC18序列。此質(zhì)粒被稱作pT49。
將編碼真正的t-PA信號(hào)序列的寡核苷酸加至質(zhì)粒pT49的XhaⅠ位點(diǎn)，然后進(jìn)行兩次誘變1)刪去t-PA信號(hào)序列和編碼成熟t-PA的序列之間的8個(gè)額外的核苷酸，2)刪去PHO1信號(hào)序列。可按以下步驟完成這些操作合成具有下述序列的寡核苷酸(109個(gè)核苷酸)
合成三條長(zhǎng)度分別為33、37和39個(gè)核苷酸的第二條鏈所需的互補(bǔ)寡核苷酸，它們分別具有下述序列5' CTG GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG 3'5' CTA GTC TGG CTC CTC TTC TGA ATC GGG CAT GGA TTT C 3'5' CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT 3'將全長(zhǎng)寡核苷酸和三條互補(bǔ)寡核苷酸用激酶處理，然后置沸水浴中加熱3分鐘并緩慢冷卻至室溫而一起退火。退火后的寡核苷酸用5%聚丙烯酰胺凝膠分開(kāi)和分離。
將200ng經(jīng)XbaⅠ部分線性化的pT49與1ug退火的雙鏈寡核苷酸連接。連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MC1061細(xì)胞中，并挑選ampR菌落。用AsuⅡ消化，根據(jù)增加的一條700bp帶鑒定出含有按需要改變了的質(zhì)粒的克隆，符合這里需要的質(zhì)粒稱為pT544。
用pT544 DNA(5ug)和具有下述序列的寡核苷酸(1ug)為材料，依靠標(biāo)準(zhǔn)的f1基礎(chǔ)的定點(diǎn)誘變方法，完成第一次誘變。
5′ GA TTC AGA GGA GCC AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AG 3′經(jīng)BglⅡ消化篩選所要的質(zhì)粒。出現(xiàn)符合需要的限制性酶切格局(1.1、2.8和5.3kb)指示此種質(zhì)粒的存在，它稱作pT64(非所需質(zhì)粒的切割格局為2.8和6.3kb帶)。
用質(zhì)粒pT64實(shí)行第二輪誘變以刪去PHO1信號(hào)序列。使用具有下述序列的寡核苷酸5′ACT AAT TAT TCG AAA CGA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G 3′這輪誘變使用3ug pT64和0.4ug上述寡核苷酸。通過(guò)BglⅡ消化篩選小樣制備。根據(jù)大小為1、2.8和5.3kb的三個(gè)DNA片段鑒定出所要的質(zhì)粒(非需要的質(zhì)粒顯示出最小帶為1.1kb，而不是1kb)。這種誘變經(jīng)序列分析證實(shí)，所需要的質(zhì)粒被稱作pT7。
實(shí)施例ⅩpAPB101PHO1啟動(dòng)子-lacZ表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例證實(shí)與異源基因連接使其成為可操作的序列時(shí)PHO1啟動(dòng)子(或5′調(diào)節(jié)區(qū))發(fā)揮作用。用EcoRⅠ和BamHⅠ消化1ug含有1acZ的質(zhì)粒pSAOH5(NRRL B-15862)，并通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離出10.1kb載體片段。用EcoRⅠ和BclⅠ消化5ug pLP 2420并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離出1.6kb片段，該片段含有375bp的pBR322DNA、含PHO1啟動(dòng)子(SEQ ID NO2)的約1075bp的PHO15′側(cè)面DNA以及123bp的PHO1編碼序列。在含有1mM ATP和1U T4DNA連接酶(可采用Boehringer Mannhe-im產(chǎn)品)的20ul連接酶緩沖液混合物中，將100ng pSAOH5的EcoRⅠ-BamHⅠ片段與60ng pLP 2420的1.6kb EcoRⅠ-BolⅠ片段連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM103中，并將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪在含有40ug/ml X-gal的LB Amp平板上。選擇蘭色菌落，在LB Amp上培養(yǎng)，分離質(zhì)粒DNA。用EcoRⅠ和SmaⅠ消化DNA，并從1450bp片段的釋放鑒定出所要的質(zhì)粒，稱為pABP101。在pAPB101中含有大腸桿菌的lacZ基因組成的表達(dá)盒，這種基因受到巴斯德畢赤酵母PHO1啟動(dòng)子成分(SEQ ID NO2)的調(diào)節(jié)。
將10ug未切割的pAPB101轉(zhuǎn)化至GS115原生質(zhì)球狀體中，并挑選組氨酸原養(yǎng)型。共選出12個(gè)His+菌落，將其菌株培養(yǎng)在高磷酸鹽(HP)和低磷酸鹽(LP)液體培養(yǎng)基中，檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。依據(jù)在LP培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)表達(dá)β-半乳糖苷酶而在HP培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)缺乏β-半乳糖苷酶來(lái)鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株。按照J(rèn).H.Miller的方法(見(jiàn)Experimentsin Molecular Genetis Cold Spring Harbor Labs Cold Spring Harbor，NY 1972)檢測(cè)β-半乳糖苷酶。LP-X-gal平板上出現(xiàn)藍(lán)色菌落，而HP-X-gal平板上則出現(xiàn)白色菌落。
實(shí)施例Ⅺ以下質(zhì)粒是為本申請(qǐng)的其它實(shí)施例使用而構(gòu)建的。
1.構(gòu)建質(zhì)粒pA0810通過(guò)以下步驟構(gòu)建M13mp19△RⅠ用EcoRⅠ切開(kāi)1ug M13mp19，平末端插入，并將插入的片段與其本身連接;用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103細(xì)胞，通過(guò)分離DNA并用EcoRⅠ消化鑒定出所要的噬菌體。它不被EcoRⅠ切割，稱為M13 mp19△RⅠ。用SstⅠ和EcoRⅤ消化質(zhì)粒pAO804(已列入本文參考文獻(xiàn)的WO89/04320敘述了此質(zhì)粒的構(gòu)建方法)，并通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離出約1.2kb片段(在這一構(gòu)建過(guò)程中的所有片段都通過(guò)0.8-1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離)。將100ng的片段與500ng的SstⅠ和SmaⅠ消化過(guò)的M13mp19△RⅠ連接。連接物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM103細(xì)胞中，通過(guò)分離DNA并用SstⅠ和PvuⅡ消化而鑒定出所要的噬菌體。所要的噬菌體是通過(guò)具有950bp片段來(lái)鑒定的，并稱之為pPSV101。
用20pmol的下述寡核苷酸作材料，使1pmol的pPSV101在體外發(fā)生針對(duì)寡核苷酸的位點(diǎn)行特異性誘變5′ CGA GGA ATT CCC CGG GAT CCT TAG ACA T 3′用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103細(xì)菌。用BglⅡ和BamHⅠ消化小樣制備DNA。當(dāng)發(fā)現(xiàn)1.4kb和0.5kbDNA片段時(shí)便鑒定出所要的噬菌體了，此噬菌體稱為pPSV102。
用下列最佳化的畢赤酵母密碼子合成編碼巴斯德畢酵母PHO1信號(hào)序列(SEQ ID NO3)的如下雙鏈DNA片段，用EcoRⅠ酶切質(zhì)粒pPSV102，并將500ng的8.5kb的片段與50ng的下述合成DNA片段連接
將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌CJ236的細(xì)胞中，并通過(guò)下述步驟鑒別出所要的噬菌體用一條已被32p標(biāo)記的酵母信號(hào)序列編碼鏈進(jìn)行噬斑雜交，用SstⅠ和BamHⅠ消化雜交的DNA，然后尋找700bp片段。此質(zhì)粒稱為pPSV103。
用20pmole的如下序列的寡核苷酸使1pmole的pPSV103在體外誘變5' CTAA TTA TTC GAA ACG ATG TTC TCT CCA ATT 3'通過(guò)與上面使用的寡核苷酸相同的序列作菌斑雜交以鑒定出所需要的噬菌體DNA。此所要質(zhì)粒稱為pPSV104。
通過(guò)以下步驟制備質(zhì)粒pAO810用HindⅢ消化10ugpPSV104并由1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離出400bp的DNA片段，將50ng的此種片段與250ng通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離出的pA0807(下面敘述了其制備方法)的7.9kbHindⅢ消化產(chǎn)物連接。用該連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061細(xì)胞并選擇ampR菌落。通過(guò)用BamHⅠ和EcoRⅠ消化后450bp帶的出現(xiàn)鑒定出所要的質(zhì)粒。此質(zhì)粒稱為pAO810。
2.構(gòu)建pA0807a.制備f1-ori DNA用50單位的RsaⅠ和DraⅠ(參考生產(chǎn)廠家的說(shuō)明書(shū))消化f1噬菌體DNA(50ug)，釋放出含有f1復(fù)制起點(diǎn)(ori)的約458bp DNA片段。用等體積的PCⅠ萃取消化混合物，接著用等體積的CI萃取水層，最后通過(guò)將Nacl的濃度調(diào)至0.2M并加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇使水相里沉淀出DNA。將該混合物置冰(4℃)上冷卻10分鐘，并在4℃下用微型離心機(jī)10，000xg離心30分鐘，收集DNA沉淀物。
用70%乙醇水溶液洗滌DNA沉淀兩次。洗過(guò)的沉淀經(jīng)真空干燥后溶于25ulTE緩沖液中。將該DNA在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，并切出含有約458bpf1-ori片段的凝膠部分，將其中的DNA電洗脫到DE81(Whatman)濾紙上，并在1MNacl中將DNA從此濾紙上洗脫。按上述方法沉淀DNA，并將DNA沉淀物溶于25ulTE緩沖液中(f1-ori片段)。
b.將f1-ori克隆至pBR322的DraⅠ位點(diǎn)用2單位DraⅠ(參考生產(chǎn)廠家的說(shuō)明書(shū))部分地消化pBR322(2ug)。用PCI萃取接著按照上述步驟a的方法沉淀DNA，終止反應(yīng)。將DNA沉淀溶于20ulTE緩沖液中。將約100ng的此DNA與100ng f1-ori片段(步驟a)置20ul連接緩沖液中用與1單位T4DNA連接酶一起14℃保溫過(guò)夜的方法連接。70℃加熱10分鐘后終止連接，然后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103菌株，得到pBRf1-ori，它含有已被克隆至pBR322的DraⅠ位點(diǎn)(處在核苷酸3232和3251的位置)的f1-ori。
c.構(gòu)建pA0807用各為10單位的PstⅠ和NdeⅠ37℃消化pBRf1-ori(10ug)4小時(shí)。按照上述步驟1的方法用PCI提取經(jīng)過(guò)消化的DNA，沉淀后將其溶于25ulTE緩沖液中。按照上述步驟a的方法，將此材料置1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，分離出含有f1-ori的NdeⅠ-PstⅠ片段(約0.8kb)，并將其溶于20ulTE緩沖液中。將約100ng的此DNA與100ng已被PstⅠ和NdeⅠ消化并被磷酸酶處理過(guò)的pA0804混合。WO89/04320中有關(guān)pA0804的描寫(xiě)。將此混合物置于20ul連接緩沖液中用與1單位T4DNA連接一起14℃保溫過(guò)夜的方法連接。70℃加熱10分鐘后終止連接反應(yīng)。用此DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103菌株，從而得到pA0807。
實(shí)施例ⅫpPSV218的構(gòu)建在20ul連接緩沖液、1mmATP和1UT4連接酶組成的緩沖溶液中，將200ng pLP2420的1.6kb EcoRⅠ/BclⅠ片段、100ng pPG2.5(見(jiàn)下述)的0.8kb BglⅡ/HindⅢ片段以及100ng pUC8(New England Biolabs，Inc)的2.6kb Ecori/HindⅢ片段連接成功三成分連接物。并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MC1061菌株中以篩選Amp抗性菌落(質(zhì)粒pPG2.5是置于pBR322中的pPG4.0(NRRL B-15868)的2.5kb EcoRⅠ-SalⅠ片段，它含有乙醇氧化酶啟動(dòng)子)。分析抗性菌落，篩選出含有2.4kb EcoRⅠ+HindⅢ片段的質(zhì)粒;此所要質(zhì)粒稱為pPSV201。用BamHⅠ消化50ng的pPSV201，脫磷酸后與50倍摩爾的過(guò)量的具有的下序列的寡核苷連接5′-GATCAGATCT-3′此寡核苷酸將BamHⅠ位點(diǎn)轉(zhuǎn)化成BglⅡ位點(diǎn)。據(jù)此鑒定出陽(yáng)性克隆，其質(zhì)粒稱為pPSV203，用有限量的HindⅢ部分地消化10ng pPSV203，并用klenow產(chǎn)生平末端。將全長(zhǎng)線性質(zhì)粒片段凝膠純化，并在100ul體積中自我連接。根據(jù)質(zhì)粒DNA含有1350bp BglⅡ/HindⅢ片段而鑒定出所要的克隆，并將它命名為pPSV210。
將60ng的pLP2420的500bp BglⅡ-BamHⅠ片段與100ng BamHⅠ酶切消化的pUC8連接。根據(jù)422bp NcoⅠ-BamHⅠ片段鑒定出所要的質(zhì)粒;由此產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pPSV202，50ng pPSV202經(jīng)BamHⅠ酶切消化和脫磷酸后與50倍摩爾的過(guò)量的包含BamHⅠ位點(diǎn)至BglⅡ位點(diǎn)的具有下述序列的寡核苷酸連接5′-GATCAGATCT-3′此寡核苷酸將BamHⅠ位點(diǎn)轉(zhuǎn)化成BglⅡ位點(diǎn)。根據(jù)422bpNcoⅠ/BglⅡ片段鑒定出所要的質(zhì)粒，并稱之為pPSV204。
用BglⅡ和SacⅠ消化10ug pPSV210，并通過(guò)凝膠純化出700bp片段。將25ng該片段與100ng經(jīng)凝膠純化的pA0810的8200bp BglⅡ/SacⅠ片段連接。根據(jù)700bpBglⅡ/SacⅠ片段的存在鑒定出所要的質(zhì)粒，并稱之為pPSV212。用SphⅠ消化10ug pPSV212，用T4 DNA多聚酶產(chǎn)生平整末端(根據(jù)Maniatis等人的方法)，用BglⅡ部分消化，通過(guò)凝膠純化出8000bp的片段。用NcoⅠ消化10ug的pPSV204，用Klenow產(chǎn)生平整末端，用Bgl Ⅱ消化，將440bp片段凝膠純化。將100ng上述來(lái)自pPSV212的8kb片段與15ng來(lái)自pPSV204的440bp片段連接。根據(jù)5500bpBglⅡ片段鑒定出所要的質(zhì)粒，并稱之為pPSV218。
以上所提供的實(shí)施例僅在于舉例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施，而無(wú)論如何不應(yīng)該理解為是對(duì)本發(fā)明或所附權(quán)利要求的實(shí)施范圍的限制。在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)及精神的情況下所作出的一些合理的變化和修改都會(huì)被考慮為屬于所要求的專利保護(hù)的范圍。
序列目錄(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Richard G.Buckholz(ⅱ)發(fā)明名稱巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(ⅲ)序列數(shù)5(ⅳ)對(duì)應(yīng)地址(A)收信人RICHMOND，PHILLIPS，HITCHCOCK & UMPHLETT(B)街道P.O.Box2443(C)市Bartlesville(D)州OK.
(E)國(guó)家USA(F)ZIP74005(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Display Write 4(ⅵ)目前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?7/627，539(B)申請(qǐng)日1990，12，14(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息
(A)名稱Jack E.Phillips(B)登記號(hào)19，903(C)卷號(hào)/文件號(hào)32427(ⅸ)電信信息(A)電話1-918-661-0520(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1994bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子 類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度400bp(B)類型核酸(C)鏈度單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度66bp(B)類型核酸(C)鏈度單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1341bp(B)類型核酸(C)鏈度單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4
(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度187bp(B)類型核酸(C)鏈度單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO權(quán)利要求
1.一種分離的DNA片段，它包含巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基團(tuán)(SEQ-ID-NO∶1)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有圖1所示的限制性酶切圖譜(SEQ ID NO1)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有下述核苷酸序列(SEQ ID NO1)BamHI -390 -370 -350GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC-330 -310 -290ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA-270 -250 -230AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTGAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC-210 -190 -170TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG-150 -130 -110TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG-90 -70 -50TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA-30 -10 10ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGACATGTTTTCTCCTATTCTAAGTMetPheSerProlleLeuSer30 50 70CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGGTTGAGTTGCAGCACLeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAlaValGluLeuGlnHis90 110 BclI 130GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTGValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnIleLeu150 170 190AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAGArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrIleGlyTyrAsnGlyTrpGlyIleAlaAlaGlu210 230 250TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGASerGluIleGluSerCysThrIleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg270 290 310TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCTTyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla330 350 370GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCTAspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer390 410 430GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCTAspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla450 470 490TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAAPheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeuIleAsnAsnSerGluGlu510 530 550GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTACGlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr570 590 610TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAAPheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu630 650 670GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAACGluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArgIleSerCysProAsnTyrAsn690 710 730AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGASerHlsIleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAspIleAlaGinArgGluAlaAspArg750 770 790TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTALeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnIleThrAlaAspAspIleProThrIleAlaLeu810 830 850TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGATyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg870 890 910GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAACGluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn930 950 970GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTGGlyAsnProLeuGlyLysThrIleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu990 1010 1030GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACCGluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr1050 1070 1090GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGACAspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp1110 1130 NcolCAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTGGinIleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGluIleValProMetGlyAlaArgLeu1170 1190 1210CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATCLeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrIle1230 1250 1270CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCGLeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro1290 1310 1330TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAACLeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn1350 1370 1390TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTGCysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu1410 1430 1450TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGASerEnd1470 1490 1510ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA1530 1550 1570ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAGBamHIGTTCAATGGATCC
4.一種分離的DNA片段，它包含巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶5′-調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO2)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所說(shuō)的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有圖1所示的限制性酶切圖譜(SEQ ID NO2)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有下述核苷酸序列(SEQ ID NO2)BamHI -390 -370 -350GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC-330 -310 -290ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA-270 -250 -230AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC-210 -190 -170TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG-150 -130 -110TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG-90 -70 -50TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA-30 -10ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGAC
7.根據(jù)權(quán)利要求4所說(shuō)的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段與編碼至少一種多肽的異源DNA序列連接而使其成為可操縱的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所說(shuō)的DNA片段，其中所說(shuō)的異源DNA序列編碼組織纖維蛋白溶酶原激活劑。
9.一種分離的DNA片段，它包括巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶信號(hào)序列(SEQ ID NO3)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所說(shuō)的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有圖1所示的限制性酶切圖譜(SEQ ID NO3)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有如下的核苷酸序列(SEQ ID NO3)10ATGTTTTCTCCTATTCTAAGTPHO1 signal sequence -->etPheSerProlleLeuSer30 50CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGLeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAla
12.根據(jù)權(quán)利要求9的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段與編碼至少一種多肽的異源DNA序列連接而使其成為可操縱的序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的DNA片段，其中所說(shuō)的異源DNA序列的DNA片段編碼組織纖維蛋白溶酶原激活劑。
14.一種由真核細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的方法，此處所說(shuō)的分泌是在巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因信號(hào)序列(SEQ ID NO3)的引導(dǎo)下進(jìn)行的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所說(shuō)的酵母是巴斯德畢赤酵母。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所說(shuō)的蛋白質(zhì)是組織纖維蛋白溶酶原激活劑。
18.一種分離的DNA片段，它包含巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶結(jié)構(gòu)基團(tuán)(SEQ ID NO4)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有圖1所示的限制性酶切圖譜(SEQ ID NO4)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有下述核苷酸序列(SEQ ID NO4)70GTTGAGTTGCAGCACValGluLeuGlnHis90 110 BclI 130GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTGValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu150 170 190AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAGArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu210 230 250TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGASerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg270 290 310TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCTTyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla330 350 370GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCTAspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer390 410 430GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCTAspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla450 470 490TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAAPheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu510 530 550GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTACGlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr570 590 610TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAAPheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu630 650 670GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAACGluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn690 710 730AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGASerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg750 770 790TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTALeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu810 830 850TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGATyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg870 890 910GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAACGluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn930 950 970GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTGGlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu990 1010 1030GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACCGluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr1050 1070 1090GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGACAspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp1110 1130 NcolCAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTGGinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu1170 1190 1210CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATCLeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle1230 1250 1270CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCGLeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro1290 1310 1330TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAACLeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn1350 1370 1390TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTGCysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeuTCATAASerEnd
21.一種分離的DNA片段，它包含巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶3′轉(zhuǎn)錄終止序列(SEQ ID NO5)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有圖1所示的限制性酶切圖譜(SEQ ID NO5)。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段具有下述核苷酸序列(SEQ ID NO5)。1410 1430 1450AAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA1470 1490 1510ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA1530 1550 1570ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAGBamHIGTTCAATGGATCC
24.質(zhì)粒pLP24。
25.質(zhì)粒pT37。
26.一種使巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因的酸性磷酸酶調(diào)節(jié)區(qū)活化以促進(jìn)編碼至少一種多肽的異源DNA序列表達(dá)的方法，它包括感染一種合適的宿主細(xì)胞，這種細(xì)胞已被酸性磷酸酶5′調(diào)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)化，此調(diào)節(jié)區(qū)和一種異源DNA序列連接而使其成為可操縱的序列，所用的培養(yǎng)基里的磷酸鹽濃度會(huì)影響表達(dá)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的異源DNA還含有一種與它連接而使它成為可操縱的信號(hào)序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所說(shuō)的信號(hào)序列是巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶信號(hào)序列(SEQ ID NO3)。
30.一種分離的DNA片段，它包括連接于5′調(diào)節(jié)區(qū)而使其成為可操縱的巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶信號(hào)序列(SEQ ID NO3)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的DNA片段，其中所說(shuō)的5′調(diào)節(jié)區(qū)DNA片段是巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶5′調(diào)節(jié)區(qū)(SEQ ID NO3)。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的DNA片段，其中所說(shuō)的5′調(diào)節(jié)區(qū)DNA片段是巴斯德畢赤酵母醇氧化酶(AOX 1)5′調(diào)節(jié)區(qū)。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的DNA片段，其中所說(shuō)的DNA片段與編碼至少一種多肽的異源DNA序列連接而使其成為可操縱的序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的DNA片段，其中所說(shuō)的異源DNA編碼組織纖維蛋白溶酶原激活劑。
35.利用整合載體在巴斯德畢赤酵母PHO 1座位引導(dǎo)整合的方法，此載體包括巴斯畢赤酵母PHO 1基因5′和3′兩翼的序列。
36.一種鑒定含有整合于PHO 1座位的表達(dá)載體的巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化株的方法，它包含把已被轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母鋪在低磷酸鹽指示劑平板上，令其培養(yǎng)過(guò)夜，并從收獲的菌落中篩選白色菌落。
全文摘要
本發(fā)明公布了巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因，它包括5′調(diào)節(jié)區(qū)、信號(hào)序列、結(jié)構(gòu)基團(tuán)以及3′轉(zhuǎn)錄終止序列。還公布了使用這些片段的方法，它包括但不限于由細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄。還公布了含有酸性磷酸酶基因或其片段的DNA載體以及被這些載體轉(zhuǎn)化的宿主。另外，也公布了引導(dǎo)在巴斯德畢赤酵母PHO1座位整合的整合載體以及鑒定這些插入失活基因的方法。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1062169SQ9111139
公開(kāi)日1992年6月24日 申請(qǐng)日期1991年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1990年12月14日
發(fā)明者R·G·布克霍 申請(qǐng)人:菲利浦石油公司