專利名稱：利用家蠶高效表達天花粉蛋白及其他有用蛋白的方法
利用家蠶高效表達天花粉蛋白及其他有用蛋白的方法基因工程技術(shù)。本發(fā)明是利用基因工程技術(shù)，通過構(gòu)建的新型轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒和分離的家蠶核型多角體病毒HB毒株，在家蠶體內(nèi)高效表達天花粉蛋白，進而可用于生產(chǎn)其他有用蛋白。
基因工程使利用重組DNA技術(shù)，在大腸桿菌、枯草桿菌、酵母及哺乳動物細胞中生產(chǎn)人們所需要的蛋白質(zhì)及藥物等成為可能。
近年來建立的桿狀病毒載體表達系統(tǒng)，以兩種昆蟲病毒，即苜蓿尺蠖核型多角體病毒和家蠶核型多角體病毒為載體在昆蟲培養(yǎng)細胞及昆蟲活體內(nèi)表達了數(shù)十種外源基因。并證實該系統(tǒng)表達的外源蛋白具備天然性質(zhì)，可作為檢測試劑、藥物、疫苗等。
已有的研究結(jié)果表明，雖然在家蠶體內(nèi)表達外源基因、生產(chǎn)有用蛋白的效率受多種因素的影響，但其中最關(guān)鍵的是用于構(gòu)建重組病毒、供外源基因插入的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。在轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒中，多角體蛋白啟動基因的完整性可使表達效率相差幾倍甚至幾十倍。而多角體蛋白基因下游的序列對外源基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的終止也有影響。特別是現(xiàn)有的家蠶核型多角體病毒載體的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒尚不完善。
本發(fā)明采用新興的PCR技術(shù)，通過人工合成的寡聚核苷酸引物對所克隆的多角體蛋白基因的旁側(cè)序列進行了定點改造，冊除了全部結(jié)構(gòu)基因部分，保留了完整的5′端及3′端序列，并插入了合適的多聚接頭，使新構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體處于最理想狀態(tài)，保證了外源基因在此完整啟動子的控制下，可獲得高效表達。并且在3′端下游序列中，引入了三套終止密碼子TAA，無論外源基因是否含有終止密碼，在本載體中表達均能有效地終止。
因而，本發(fā)明旨在通過構(gòu)建理想的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，提高利用家蠶核型多角體病毒在家蠶體內(nèi)表達外源基因的表達效率。
家蠶核型多角體病毒是家蠶血液型膿病的病原體，該病毒屬于桿狀病毒科的A亞組。在野外該病毒只感染家蠶、野蠶、蓖麻蠶等少數(shù)幾種昆蟲。野生型家蠶核型多角體病毒有許多分離株，它們的多角體形態(tài)和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜不同。本發(fā)明選擇能形成四方形多角體的HB分離株為材料，該分離株不僅多角體大于一般六角形多角體，而且很均整，這些特性為構(gòu)建高效表達載體提供了基礎(chǔ)。其表達載體的構(gòu)建方案如下已知家蠶核型多角體病毒的多角體蛋白結(jié)構(gòu)基因位于該病毒基因組EcoRⅠ 10.6kb片段內(nèi)。該片段可通過構(gòu)建家蠶核型多角體病毒的基因文庫，從文庫中篩選獲得。
通過菌落原位雜交，Southern雜交等常用分子生物學(xué)實驗方法可對所得到的目的片段進行分析、鑒定。進而用一系列限制性內(nèi)切酶酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，可繪制出該片段的酶切圖譜。在多角體蛋白結(jié)構(gòu)基因上游(5′端)有一XhoⅠ位點，下游(3′端)有一BamHⅠ位點。分別位于上游1.8Kb和下游1.3Kb。包括結(jié)構(gòu)基因在內(nèi)，該XhoⅠ-BamHⅠ片段的大小為3.8Kb。從EcoRⅠ 10.6Kb片段中，可進一步克隆到該XhoⅠ-BamHⅠ 3.8Kb片段。
利用鏈終止法對多角體蛋白結(jié)構(gòu)基因及上、下游區(qū)域進行序列分析，測得HB分離株的多角體蛋白結(jié)構(gòu)基因的編碼序列為738bp，另外從上游-196bp至下游+750bp范圍內(nèi)共有4bp的堿基序列發(fā)生了變化。
以上述克隆在載體質(zhì)粒Bluescript的XhoⅠ/BamHⅠ位點的XhoⅠ-BamHⅠ 3.8Kb片段為模板，根據(jù)測定的多角體蛋白基因結(jié)構(gòu)基因上游及下游序列合成一對引物，并以通用引物T7和T3與之相配合，分別擴增多角體蛋白結(jié)構(gòu)基因的5′端1.8Kb及下游1.3Kb區(qū)域，在人工合成的引物中，分別引入了HindⅢ和XbaⅠ切點，并使原多角體蛋白基因的啟始密碼子ATG改為AAGCTT(HindⅢ切點);而在3′端引物XbaⅠ的下游加入了三套終止密碼子TAA。經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)30個循環(huán)的擴增，分別獲得多角體蛋白基因上游1.8Kb片段a和下游1.3Kb片段b。將片段a和b用XhoⅠ、HindⅢ酶切;片段b用XbaⅠ和SacⅠ酶切，分別克隆于Bluescript的XhoⅠ/HindⅢ和XbaⅠ/SacⅠ切點。
擴增的XhoⅠ/HindⅢ 1.8Kb片段含有完整的多角體蛋白基因啟動子，XbaⅠ/SacⅠ 1.3Kb片段含有多角體蛋白基因轉(zhuǎn)錄終止信號及通過引物合成引入的三套翻譯終止密碼子。然后，從XhoⅠ到Bluescript的XbaⅠ切點(含片段a)切下，克隆到片段b的上游XhoⅠ/XbaⅠ位點，為完整的家蠶核型多角體病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。該載體具備(1)完整的啟動子序列(2)3′端轉(zhuǎn)錄終止及翻譯終止信號(3)可供外源基因插入的HindⅢ、EcoRⅤ、EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ多聚克隆接頭。
(4)多角體蛋白基因5′端及3′端旁側(cè)序列，可作同源重組。
該轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒為最理想的家蠶核型多角體病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，可供插入各種在基因兩側(cè)含有HindⅢ、EcoRⅤ、EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ等酶切位點的外源基因。
克隆在載體質(zhì)粒PGEM3z(f-)HincⅡ切點的天花粉蛋白基因用HindⅢ、XbaⅠ切下，連接到上述轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的HindⅢ、XbaⅠ位點，其方向與多角體蛋白基因啟動子的轉(zhuǎn)錄方向一致。
插入天花粉蛋白基因的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒擴增后，可用氯化銫密度梯度離心，瓊脂糖凝膠(Sepharose-4B)柱層析純化或PEG-8000沉淀等常用DNA純化方法進行純化。純化的重組質(zhì)粒DNA與家蠶核多角體病毒HB株DNA通過磷酸鈣沉淀的方法共轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞Bm-N，進入細胞內(nèi)的野生型病毒DNA在復(fù)制過程中，與重組質(zhì)粒上的同源的病毒DNA序列發(fā)生同源重組，可獲得含天花粉蛋白基因的重組病毒。這種重組的機會很低，僅有0.1-1%。重組病毒與野生病毒可根據(jù)有無多角體這一形態(tài)標志，用空斑法進行篩選、純化，獲得重組病毒。重組病毒用斑點雜交、Southern雜交、PCR擴增天花粉蛋白基因等方法進行鑒定。
用重組病毒感染培養(yǎng)的家蠶傳代細胞或家蠶活體，在感染后期，插入的外源基因(天花粉蛋白基因)在多角體蛋白基因啟動子的控制下大量表達。表達產(chǎn)物可用多種常規(guī)的蛋白質(zhì)方法分離、純化。
利用本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，除可表達天花粉蛋白這類植物來源的外源蛋白外，還可用于表達其他各種細菌、病毒、動、植物基因。
本發(fā)明選用的材料為家蠶核型多角體病毒HB分離株，其多角體形態(tài)為四方形，大而均整，該多角體蛋白基因的啟動子活性高于普通家蠶核多角體病毒。
本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒5′端病毒序列為1.8Kb，小于普通家蠶核多角體病毒轉(zhuǎn)移載體。其啟動子部分結(jié)構(gòu)完整。3′端病毒序列為1.3Kb，含三套翻譯終止信號TAA。中間的多聚克隆位點包含了常用的7種限制性內(nèi)切酶位點。因此，本載體具有表達效率高、操作方便、適合于有或無翻譯終止信號的各種外源基因的表達。
利用家蠶活體表達外源基因其成本低于培養(yǎng)細胞系統(tǒng)，而且不需特殊的儀器、設(shè)備。家蠶在我國飼養(yǎng)歷史悠久、技術(shù)普及，因此本技術(shù)容易推廣、普及。家蠶核型多角體病毒的宿主域狹，且重組的含外源基因的病毒不能形成多角體，無多角體保護的病毒在野外很易失活，因此具很好的安全性能。
實施例(1)病毒DNA的提取及多角體蛋白基因的分離收集家蠶核多角體病毒感染的家蠶血淋巴，經(jīng)低速離心(5000轉(zhuǎn)/分)，沉淀(為多角體)用0.1%SDS懸浮，再離心(相同條件)，如此重復(fù)5次，最后用重蒸水懸浮。在上述含多角體的懸浮液中加入等體積的0.1mol/1 Na2CO3和0.05mol/1 NaCl，置冰上1小時，使多角體溶解。而后用等體積苯酚、苯酚/氯仿/異茂醇(25∶24∶1)、氯仿/異茂醇(24∶1)各抽提一次。最后加入十分之一體積的3mol/1 KAc(PH 4.8)和2.5倍體積乙醇，置-20℃30分鐘，用12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清，加入70%乙醇洗一次，真空抽干，將沉淀溶于TE，使病毒DNA的含量為0.1μg/μl。此病毒DNA溶液可用于酶切或家蠶培養(yǎng)細胞的傳染。
將上述病毒DNA用限制性內(nèi)切酶完全酶切，然后與同樣酶切的Bluescript連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在選擇性培養(yǎng)基上含插入片段的重組質(zhì)粒所形成的菌落為白色。將白色菌落作菌落原位雜交，以32P-dATP標記的普通家蠶核多角體病毒多角體蛋白基因為探針，篩選獲得HB株系的多角體病毒含多角體蛋白基因的EcoRⅠ片段。將雜交陽性的菌落挑出，快速制備質(zhì)粒DNA，EcoRⅠ酶切檢查，證實其插入片段大小為10.6Kb。對重組質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切，作Southern雜交，采用相同的探針，進一步證實在10.6Kb的插入片段中含有多角體蛋白基因。將含10.6Kb插入片段的重組質(zhì)粒命名為pOCU102。
(2)多角體蛋白基因的定位及結(jié)構(gòu)分析 將質(zhì)粒pOCU102用EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、PstⅠ、XbaⅠ、HindⅢ作單酶、雙酶酶切，繪制插入片段的物理圖譜。結(jié)果(見附圖1)，與已有普通家蠶核型多角體病毒的相應(yīng)片段比較，在該片中增加了一個XhoⅠ切點。進一步用XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切pOCU102，并連接，得只含XhoⅠ-BamH3.8Kb的質(zhì)粒pOCUXB。進一步利用該片段內(nèi)存的XbaⅠ、NdeⅠ、HindⅢ切點，制作亞克隆，得亞克隆pXUB2、pSUB22、pSUB40、pSUB-62、pSUB80、pSUB71，對它們進行序列分析，其結(jié)果得到多角體蛋白基因的全序列及5′端和3′端旁側(cè)序列(見附圖2)。在5′端啟動基因范圍內(nèi)，有2個核苷酸發(fā)生了變化，結(jié)構(gòu)基因也有2個核苷酸變化，但只有一個導(dǎo)致了編碼的氨基酸序列的改變。
(3)PCR擴增多角體蛋白基因的上、下游序列 根據(jù)序列分析的結(jié)果，人工合成了一對寡聚核苷酸引物a和b，其序列分別為a5′TAAGCTTATTTATAGGTTTTTTTATT3′b5′TTCTGAGTGATTAAAACACTATACATTG3′另以通用測序引物T7和T3分別與a和b組合，擴增pOCUXB的多角體蛋白基因5′端和3′端序列。PCR擴增條件為模板DNA 1μg，引物25pmol，dNTP 2.4mmol/l，300mmol/l KCl，1mmol/l DTT，0.1mmol/l EDTA，67mmol/l Tris·HCl(PH8.8)和6.7mmol/l MgCl2，反應(yīng)溫度為退火45℃45秒;延伸反應(yīng)65℃2分;變性93℃30秒。經(jīng)30個循環(huán)的擴增，各得1.8Kb的上游序列a和1.3Kb的下游序列b。
(4)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 將擴增所得到的兩個片段a和b分別用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ/HindⅢ和XbaⅠ/SacⅠ酶切，并克隆到Bluescript的相應(yīng)位點，得兩個中間質(zhì)粒pBma和pBmb。然后作序列分析，證實擴增產(chǎn)物與所設(shè)計的引物的序列一致，而其余為病毒原有序列。將pBma的插入片段用XhoⅠ和XbaⅠ切下，與相同酶切的pBmb連接，即得pBmAB。該質(zhì)粒具備多角體蛋白基因的上、下游序列及限制性內(nèi)切酶位點HindⅢ、EcoRⅤ、EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ和XbaⅠ(見附圖3)。
(5)天花粉蛋白基因的插入 天花粉蛋白基因是用PCR方法從括樓基因組DNA中分離的815bp的片段，克隆在pGEM3Z(f-)的HindⅡ位點。將該基因用HindⅢ和XbaⅠ切下，定向克隆到pBmAB的HindⅢ/XbaⅠ位點。所用方法有DNA片段的回收、連接，轉(zhuǎn)化等，均為分子生物學(xué)常規(guī)方法。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定證實天花粉蛋白基因的存在，并且方向與啟動基因的轉(zhuǎn)錄方向一致。然后大量提取重組質(zhì)粒，采用堿法抽提，用柱層析(Shepharose-4B)純化質(zhì)粒DNA，TE洗脫。純化的質(zhì)粒DNA用于共轉(zhuǎn)染昆蟲培養(yǎng)細胞。
(6)家蠶培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)染 前述病毒HB分離株DNA與重組質(zhì)粒DNA以分子比1∶100混合，配置下列溶液Ⅰ、重蒸水 2.1ml家蠶核多角體病毒 DNA 50μl(5μg)重組質(zhì)粒 DNA 50μl(50μg)2mol/l CaCl2300μlⅡ、50mmol/l HEPES 緩沖液(PH7.1)含
0.28mol/l NaCl磷酸緩沖液(35mmol/l Na2HPO4，35mmol/l NaH2PO4)50μl將上述溶液Ⅰ和Ⅱ混合，可見乳白色磷酸鈣沉淀，然后加入到家蠶培養(yǎng)細胞中，其病毒DNA與質(zhì)粒DNA同時被導(dǎo)入細胞內(nèi)。于28℃保持4小時，用培養(yǎng)液TC100洗一次，然后換新的培養(yǎng)液(TC100，含10%胎牛血清)，于28℃培養(yǎng)4～6天，細胞被病毒感染死亡，并形成多角體。
(7)空斑篩選及空斑純化上述轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)液稀釋104，感染單層培養(yǎng)的家蠶培養(yǎng)細胞，并用含1%低融點瓊脂糖的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，5日后形成空斑，在顯微鏡下挑選無多角體的空斑，并用同樣方法進行4輪空斑純化，得純重組病毒。
在培養(yǎng)細胞中繁殖重組病毒，差速離心得病毒粒子，用蛋白酶K處理和苯酚抽提病毒DNA，用PCR方法鑒定重組病毒是否含有天花粉蛋白基因。所用引物為天花粉蛋白基因的5′端及3′端引物，亦以前述家蠶核型多角體病毒DNA為對照，進行擴增，結(jié)果重組病毒能擴增出0.8Kb的片段，而野生病毒無此片段。證實重組病毒含有天花粉蛋白基因。
(8)天花粉蛋白基因在家蠶活體內(nèi)的表達用105PFU(空斑形成單位)的重組病毒注射家蠶5齡起蠶，5日后收集蟲體血淋巴，并以野生病毒為對照。重組病毒和野生病毒感染家蠶的血淋巴5μl作SDS-PAGE(聚丙稀酰胺凝膠電泳)分析，結(jié)果重組病毒感染蠶血淋巴中有天花粉蛋白特異條帶。用天花粉蛋白的兔抗血清作Western blotting，證實所增加的條帶為表達產(chǎn)物。經(jīng)紫外掃描積分計算，天花粉蛋白的表達量占蠶體血淋巴總蛋白量的5%左右。


圖1、Ⅰ含多角體蛋白基因的家蠶核型多角體病毒EcoRⅠ 10.6kb片段的物理圖譜Ⅱ上述片段中XhoⅠ-BamHⅠ 3.8kb的物理圖譜Ⅲ含多角體蛋白基因及其旁側(cè)序列的各亞克隆的結(jié)構(gòu)圖中字母RⅠEcoRⅠ;ph多角體蛋白基因;
HHindⅢ;XXhoⅠ;PPstⅠ;XbXbaⅠ;HpHpaⅠ;NNdeⅠ圖2、家蠶核型多角體病毒HB分離株多角體蛋白結(jié)構(gòu)基因及其部分旁側(cè)序列圖3、ⅠPCR擴增的XhoⅠ-BamHⅠ片段的區(qū)域Ⅱ克隆擴增產(chǎn)物pBma及pBmb的結(jié)構(gòu)Ⅲ家蠶核型多角體病毒的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBmAB的結(jié)構(gòu)，大寫字母為病毒圖列，小寫字母為載體中多聚克隆位點的序列
權(quán)利要求
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，是一種以家蠶核型多角體病毒為載體，利用家蠶表達天花粉蛋白及其他有用蛋白質(zhì)的方法。其特征在于利用構(gòu)建的新型家蠶核型多角體病毒載體質(zhì)粒，通過與野生型家蠶核多角體病毒在培養(yǎng)細胞中進行同源重組，獲得重組病毒，在家蠶體內(nèi)表達自然界難以大量獲得的天花粉蛋白。本方法適合于利用同樣方法表達其他外源基因。權(quán)利要求為1、含有家蠶核型多角體病毒HB分離株多角體蛋白基因的EcoRI10.6kb片段及XhoI-BamHI3.8kb片段，以及由XhoI-BamHI片段引伸而來的一系列亞克隆片段。
2.PCR擴增的含多角體蛋白基因5′端序列和3′端序列的兩個片段a和b。
3.家蠶核型多角體病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBmAB。
4.插入了天花粉蛋白基因的重組家蠶核多角體病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。
5.含天花粉蛋白基因的重組家蠶核多角體病毒。
全文摘要
本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，從家蠶核多角體病毒HB分離株中克隆了含多角體蛋白基因的片段，利用PCR定點突變法，構(gòu)建了新型高效家蠶核多角體病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。該質(zhì)粒的5′及3′端同源序列區(qū)小于普通轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，適合于基因工程的操作。多角體蛋白基因啟動子的結(jié)構(gòu)完整，有利于高效表達。3′端引入了三套TAA終止密碼，可以有效地終止外源基因的翻譯。中間的多聚克隆位點適合于外源基因的插入。天花粉蛋白基因被插入到該質(zhì)粒，并由些構(gòu)建了含天花粉蛋白基因的重組家蠶核型多角體病毒，并在家蠶活體內(nèi)表達了該基因。
文檔編號C12N15/29GK1062001SQ9111046
公開日1992年6月17日 申請日期1991年11月12日 優(yōu)先權(quán)日1991年11月12日
發(fā)明者儲瑞銀, 陳章良, 鮑一明, 林玉蓮 申請人:北京大學(xué)