專利名稱：天花粉蛋白突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天花粉蛋白突變體(Mutant Trichosanthin，MTCS)，其制備方法，及其用途。
本發(fā)明的目的在于克服天花粉蛋白的副作用，提供免疫原性低、能反復(fù)安全使用的新天花粉蛋白產(chǎn)品。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明天花粉蛋白突變體的核酸。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸的載體、特別是表達(dá)載體，以及用本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明天花粉蛋白突變體的方法，包括在有利于所述天花粉蛋白突變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，及從培養(yǎng)物中回收所述天花粉蛋白突變體。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明天花粉蛋白突變體和藥物可接受載體或賦型劑的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及作為藥物的本發(fā)明的天花粉蛋白突變體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明天花粉蛋白突變體在制備治療病毒性疾病、治療腫瘤、治療宮外孕和/或引產(chǎn)的藥物中的應(yīng)用。
最后，本發(fā)明涉及一種在哺乳動(dòng)物中引產(chǎn)、治療宮外孕、治療病毒性疾病和/或治療腫瘤的方法，包括給予需要治療的哺乳動(dòng)物治療有效量的本發(fā)明的天花粉蛋白突變體。
發(fā)明詳述經(jīng)大量的研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白中免疫活性相關(guān)區(qū)域在結(jié)構(gòu)上位于第174位到180位、203位到226位、230位到244位氨基酸殘基內(nèi)。通過修飾這三個(gè)區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸殘基可以得到具有優(yōu)秀性能的新的天花粉蛋白突變體。它顯著地降低了天花粉蛋白的過敏原性，但基本保留了天花粉蛋白的生物學(xué)活性。本發(fā)明的天花粉蛋白突變體至少保留核糖體失活和引產(chǎn)兩種活性，優(yōu)選保留天然天花粉蛋白的全部生物活性，包括抗腫瘤和抗病毒等活性。
因此，本發(fā)明提供了一種低免疫原性天花粉蛋白突變體，其中在天花粉蛋白的以下三個(gè)氨基酸序列區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸殘基被修飾氨基酸殘基第174位到180位、203位到226位、230位到244位。
在本申請(qǐng)說明書和權(quán)利要求中，氨基酸殘基的位置編號(hào)參照
圖1中的殘基編號(hào)。
本發(fā)明的天花粉蛋白突變體可以是一個(gè)全長(zhǎng)的成熟蛋白，或其包含至少一個(gè)本發(fā)明中定義的氨基酸殘基修飾的片段或衍生物。
在本申請(qǐng)中，所述氨基酸殘基的“修飾”指氨基酸殘基的缺失、插入、添加、置換或化學(xué)修飾。氨基酸殘基的修飾優(yōu)選能引起在被修飾的氨基酸位點(diǎn)的電荷改變。術(shù)語(yǔ)氨基酸殘基的“置換”優(yōu)選指用疏水性氨基酸殘基置換親水性氨基酸殘基、用親水性氨基酸殘基置換疏水性氨基酸殘基、用堿性氨基酸殘基置換酸性氨基酸殘基，或用酸性氨基酸殘基置換堿性氨基酸殘基。
本發(fā)明中所用術(shù)語(yǔ)“親水性氨基酸”特別是指絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天門冬氨酸(Asp)、天門冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、和組氨酸(His)。其中，Asp、Asn、Glu、Gln為酸性氨基酸，Lys、Arg、His為堿性氨基酸。術(shù)語(yǔ)“疏水性氨基酸”特別是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)和甲硫氨酸(Met)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，天花粉蛋白突變體在174-180區(qū)域中含有至少一個(gè)選自表1中的氨基酸殘基修飾。
表1
在本發(fā)明的另一個(gè)選優(yōu)實(shí)施方案中，天花粉蛋白突變體在203-226區(qū)域中含有至少一個(gè)選自表2中的氨基酸殘基修飾
表2
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，天花粉蛋白突變體在230-244區(qū)域中含有至少一個(gè)選自表3中的氨基酸殘基修飾表3
優(yōu)選地，本發(fā)明的天花粉蛋白突變體在所述174-180，203-226和230-244三個(gè)區(qū)域中的2個(gè)或3個(gè)區(qū)域中都含有氨基酸殘基的修飾。在這種情況下，更優(yōu)選每個(gè)區(qū)域中的氨基酸殘基的修飾分別選自表1、2和3中所列出的那些。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的天花粉蛋白突變體含有如下2個(gè)氨基酸殘基的修飾第177位的Lys被Glu置換，以及第203位的Ser被Gly置換。
在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的天花粉蛋白突變體含有如下所有3個(gè)氨基酸殘基的修飾第177位的Lys被Glu置換，以及第203位的Ser被Gly置換，以及第236位的Asn被Gly置換。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明天花粉蛋白突變體的核酸。
本發(fā)明的天花粉蛋白突變體可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因工程或肽合成方法制備，例如固相肽合成(Merrifield J，J.Am.Chem.Soc.852149-2154.1963)。優(yōu)選通過對(duì)天然天花粉蛋白基因的改造和在適當(dāng)生物宿主中表達(dá)上述改造好的基因來制備。
本發(fā)明編碼上述天花粉蛋白突變體的核酸可以克隆在適當(dāng)?shù)妮d體中，特別是表達(dá)載體如質(zhì)粒載體pET-2d或pET-3a。
本發(fā)明的核酸或含有該核酸的載體可被用來轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，如大腸桿菌(E.Coli.)。這種轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞可用于培養(yǎng)生產(chǎn)本發(fā)明的天花粉蛋白突變體。本發(fā)明同樣涉及這種被轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞。
因此，本發(fā)明還涉及一種制備本發(fā)明天花粉蛋白突變體的方法，包括在有利于所述天花粉蛋白突變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，及從培養(yǎng)物中回收所述天花粉蛋白突變體。
天然天花粉蛋白的基因是從ATG(起始密碼子)到TAG(終止密碼子)共計(jì)870堿基對(duì)。本技術(shù)領(lǐng)域人員可根據(jù)已發(fā)表的序列信息，用常規(guī)的方法得到該基因。如從基因組DNA文庫(kù)(Chow TP，F(xiàn)eldman RA，Lovett M，Piatak M，et al.，Isolation and DNA Sequence of a GeneEncoding Alpha-trichosanthin，a Type I Ribosome-inactivating Protein，J.Biol.Chem.265(15)8670-8674，1990)或cDNA文庫(kù)篩取(Shaw PC，Yung MH，Zhu RH，Ho WK，Ng TB，Yeung HW，et al.，Cloning ofTrichosanthin cDNA and its Expression in Escherichia Coli，Gene，97(2)267-72，1991)，或利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法吊取(聶慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及結(jié)構(gòu)分析，第四次中國(guó)基因結(jié)構(gòu)、克隆與表達(dá)學(xué)術(shù)討論會(huì)，海口，A-32，1991)，也可以利用化學(xué)方法合成。該基因編碼了一個(gè)由289個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白。它除了編碼成熟的247氨基酸殘基的天花粉蛋白外，前體蛋白在N端前還包含一個(gè)23肽的信號(hào)肽，在C端后還包含一個(gè)19肽的尾肽。方便地，可以利用已發(fā)表的方法(Sambrook J，et al.，Molecular Cloning，A laboratoryManual(Second Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1982)克隆編碼天然天花粉蛋白前體蛋白的cDNA，或者直接使用含有該cDNA的質(zhì)粒。
利用本技術(shù)領(lǐng)域人員均已知的DNA定點(diǎn)突變方法，可對(duì)天然天花粉蛋白基因進(jìn)行修飾。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述修飾包括a)必要時(shí)在編碼成熟天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端前和3’端后分別引進(jìn)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，引入起始密碼子和終止密碼子。例如在編碼成熟天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端引入NcoI位點(diǎn)(CCATGG)，從而引進(jìn)了起始密碼子ATG，同時(shí)在成熟天然天花粉蛋白的第-1位加了一個(gè)甲硫氨酸；或引進(jìn)限制性內(nèi)切酶NdeI位點(diǎn)(CATATG)，從而使成熟天然天花粉蛋白的第1位氨基酸殘基從天門冬氨酸改為甲硫氨酸。在編碼成熟天花粉蛋白的DNA序列的3’端后可引進(jìn)限制性內(nèi)切酶BamHI位點(diǎn)(GGATCC)，從而引進(jìn)了終止密碼子；以及b)對(duì)編碼待突變部位氨基酸序列(在174-180、203-226、230-244區(qū)域的氨基酸殘基)的DNA序列進(jìn)行修飾，以獲得編碼本發(fā)明天花粉蛋白突變體的基因。由于氨基酸遺傳編碼子的簡(jiǎn)并性，對(duì)一個(gè)氨基酸位置的突變?cè)诨蛩缴峡梢杂卸鄠€(gè)方案。對(duì)特定部位的DNA序列的定點(diǎn)改造可以利用商業(yè)上可買到的試劑盒，例如Bio-Rad公司的Muta-Gene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit，按廠家提供的說明來進(jìn)行。
將定點(diǎn)突變得到的編碼天花粉蛋白突變體的DNA序列用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶如NcoI(或NdeI)和BamHI酶切，然后克隆進(jìn)表達(dá)載體如質(zhì)粒載體pET-2d(或pET-3a)。所得的突變表達(dá)載體用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞如大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。將轉(zhuǎn)化子在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，若需要在適當(dāng)時(shí)加誘導(dǎo)劑如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)天花粉蛋白突變體表達(dá)。然后通過常規(guī)方法，包括宿主細(xì)胞裂解、對(duì)裂解液離心、柱層析分離純化等，從培養(yǎng)物中分離所表達(dá)的天花粉蛋白突變體。MTCS的活性實(shí)驗(yàn)以下所列為本發(fā)明天花粉蛋白突變體的免疫反應(yīng)能力及生物活性的測(cè)試方法和結(jié)果。
1.TCS缺失型突變體和TCS修飾型突變體的性質(zhì)為了探索一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的關(guān)系，按表1至3中所示突變，從基因水平將天花粉蛋白進(jìn)行改造，獲得了多個(gè)編碼天花粉蛋白C末端序列缺失(缺失型突變體)或多個(gè)氨基酸殘基被修飾(修飾型突變體)的基因。經(jīng)大腸桿菌表達(dá)、純化后分別獲得了相應(yīng)的多個(gè)缺失型突變體或修飾型突變體。天花粉蛋白及其突變體具有RNA N-糖苷酶活性，可使核糖體失活，從而阻斷細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。對(duì)這些缺失型突變體和修飾型突變體的生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)這些檢測(cè)的結(jié)果，結(jié)合天花粉蛋白的空間結(jié)構(gòu)信息，分析TCS活性區(qū)域的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。RIP活性依Pelhem和Jackson的方法進(jìn)行(H.K.B.Pelhem and R.J.Jackson，Eur.J.Biochem.67247-256，1976)。引產(chǎn)活性按發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法進(jìn)行(Nie HL，et al.，Position 120-123，a Potential Active Site of Trichosanthin，Life Sciences，62(6)491-500，1998)。體外免疫反應(yīng)活性用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法檢測(cè)(He XH，et al.，Effects of Chemical Modification of Lysine and ArginineResidues of Trichosanthin on its Reactivity with IgE，Acta Biochemicaet Biophysica Sinica，26657-662，1994)。結(jié)果列于表4。
表4TCS缺失型突變體和TCS修飾型突變體的性質(zhì)檢測(cè)
NTCS--天然天花粉蛋白LTCS--天花粉蛋白缺失型突變體MTCS--為天花粉蛋白修飾型突變體*RIP活性IC50(ng/ml)++≤50，50＜+≤500，500＜±≤5000，-＞5000**引產(chǎn)活性(％)++≥80，80＞+≥30，30＞±≥5，-＜5***體外免疫反應(yīng)能力％++＞80，80≥+＞30，30≥±＞10，10≥-(a)＞5，-(b)≤5上述天花粉蛋白缺失型突變體和天花粉蛋白修飾型突變體的性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果表明對(duì)于天花粉蛋白缺失型突變體，當(dāng)3個(gè)氨基酸殘基從C末端缺失時(shí)，它的體外與IgG和與IgE反應(yīng)的能力如同天然天花粉蛋白一樣呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性。當(dāng)缺失程度加大至5個(gè)氨基酸殘基時(shí)，免疫活性下降，但此時(shí)尚未觀察到對(duì)核糖體失活和引產(chǎn)活性的影響。直至缺失29個(gè)氨基酸殘基，它的生物學(xué)活性才出現(xiàn)下降。按本發(fā)明人以往所報(bào)道，天花粉蛋白的生物學(xué)活性中心位于位點(diǎn)110至174之間的區(qū)域(Ke YB，Chen JK，Nie HL，et al.，Structure-function Relationship ofTrichosanthin，Life Sciences，60(7)465-472，1997)。C末端序列的缺失引起的空間結(jié)構(gòu)的變化對(duì)此活性區(qū)域同樣有影響。這種缺失序列越接近活性中心，生物學(xué)活性下降越大?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)區(qū)域較生物學(xué)活性區(qū)域結(jié)構(gòu)排列接近羧基末端，因而它較易受到C末端序列缺失的影響。表4中修飾型突變體M7TCS(1-247)[位點(diǎn)174至180間的一個(gè)氨基酸殘基被突變]，M24TCS(1-247)[位點(diǎn)203至226間一個(gè)氨基酸殘基被突變]和M15TCS(1-247)[位點(diǎn)230至244間一個(gè)氨基酸殘基被突變]表現(xiàn)出弱的與IgG和IgE相關(guān)的體外免疫反應(yīng)能力，但仍然保留著包括RIP和引產(chǎn)的強(qiáng)生物學(xué)活性。這個(gè)結(jié)果表明這三個(gè)被修飾的氨基酸序列區(qū)域(第180-174，226-203，244-230位)與免疫反應(yīng)能力相關(guān)。在這些區(qū)域中任何結(jié)構(gòu)改變均可導(dǎo)致免疫反應(yīng)能力的下降。這些結(jié)構(gòu)改變包括至少一個(gè)氨基酸殘基被缺失；相鄰兩個(gè)氨基酸殘基間插入至少一個(gè)氨基酸殘基；這些序列被加上至少一個(gè)氨基酸殘基；用疏水性氨基酸殘基置換至少一個(gè)親水性氨基酸殘基；用親水性氨基酸殘基置換至少一個(gè)疏水性氨基酸殘基；用堿性氨基酸殘基置換至少一個(gè)酸性氨基酸殘基；用酸性氨基酸殘基置換至少一個(gè)堿性氨基酸殘基；至少一個(gè)氨基酸殘基被接上其它化學(xué)基團(tuán)；和/或包括插入至少一個(gè)氨基酸殘基的任何修飾，此修飾能引起被修飾氨基酸位點(diǎn)的電荷改變。修飾型突變體M31TCS(1-247)[位點(diǎn)174至180間的一個(gè)氨基酸殘基和位點(diǎn)203至226間的一個(gè)氨基酸殘基被突變]和M46TCS(1-247)[位點(diǎn)174至180間的一個(gè)氨基酸殘基，位點(diǎn)203至226間的一個(gè)氨基酸殘基和位點(diǎn)230至244間的一個(gè)氨基酸殘基被突變]兩種蛋白突變體免疫反應(yīng)能力為陰性而仍然保留包括RIP和引產(chǎn)在內(nèi)的強(qiáng)生物學(xué)活性。這是兩類性質(zhì)優(yōu)秀的天花粉蛋白突變體。極大地降低了天然天花粉蛋白的免疫原性，而無(wú)損生物學(xué)活性。其中M46TCS(1-247)的免疫原性比M31TCS(1-247)更低。
2.本發(fā)明天花粉蛋白突變體的性質(zhì)按上文所述方法檢測(cè)本發(fā)明的MTCS(M177、203)(177位Lys被Glu置換，且203位Ser被Gly置換)的體外RIP活性、懷孕小白鼠中期引產(chǎn)活性、體外與IgG和IgE的反應(yīng)能力。體外培養(yǎng)下對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用的檢測(cè)按本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法進(jìn)行(Kong M，et al.，Studyon Trichosanthin Induced Apoptosis of Leukemia K562 Cells，ActaBiologiae Experimentalis Sinica，31(3)233-243，1998)。
a)天花粉蛋白突變體與天然天花粉蛋白的免疫與生物學(xué)活性的比較列于表5。
表5天花粉蛋白突變體與天然天花粉蛋白的免疫與生物學(xué)活性的比較
*詳見(c-iv)**詳見(c-iii)b)天花粉蛋白突變體對(duì)不同細(xì)胞株的毒性列于表6。
表6天花粉蛋白突變體對(duì)不同細(xì)胞株的毒性
*為人正常外周血淋巴細(xì)胞，從臨床采集。
天花粉蛋白突變體對(duì)K562、HL60、MLT、U937等白血病細(xì)胞株和Jar絨癌細(xì)胞株的半數(shù)致死濃度LC50低于30ug/ml。這些LC50≤30ug/ml的細(xì)胞株被視為最敏感的細(xì)胞株。天花粉蛋白突變體對(duì)B16、A431、B7-325、SPCA1、7404等癌細(xì)胞的LC50高于30ug/ml，這些細(xì)胞為中度敏感型細(xì)胞株。天花粉蛋白突變體對(duì)正常體細(xì)胞，如人外周血淋巴細(xì)胞和人羊膜細(xì)胞(Wish細(xì)胞)的LC50高于1000ug/ml以上，稱為非敏感型細(xì)胞株。這些數(shù)據(jù)清楚地表明在一定的劑量條件下，天花粉蛋白突變體對(duì)白血病細(xì)胞和其它種類的癌細(xì)胞有強(qiáng)烈的毒性，而不損傷正常體細(xì)胞。這結(jié)果與以往對(duì)天花粉蛋白的類似研究相符。
c)動(dòng)物模型的研究c-i)抗腫瘤研究將人慢性髓細(xì)胞白血病的K562細(xì)胞接種至八周齡裸小鼠皮下，接種細(xì)胞數(shù)量為1×107細(xì)胞。接種10天后，可見接種細(xì)胞在50％動(dòng)物中體內(nèi)生長(zhǎng)并形成實(shí)體腫瘤。選擇腫瘤生成鼠并隨機(jī)分為四組。三組動(dòng)物給予不同劑量的天花粉蛋白突變體注射治療。另一組以生理鹽水注射作為對(duì)照。在治療劑量≤引產(chǎn)劑量(三組分別為15nm/Kg、45nm/Kg、75nm/Kg)條件下，每四天注射一次，以四次治療為限，均可見不同程度的抑瘤效應(yīng)。各治療組的抑瘤率分別為(40±3)％、(71±2)％和(92±4)％。選用另一種T和B淋巴細(xì)胞雙缺陷的免疫嚴(yán)重陷動(dòng)物SCID小鼠，研究天花粉蛋白突變體對(duì)K562細(xì)胞的毒性。選用九周齡SCID小鼠皮下接種1×107的K562細(xì)胞，100％的接種動(dòng)物長(zhǎng)出了實(shí)體腫瘤。在接種后第五天，隨機(jī)將小鼠分為四組，其中三組為治療組，另一組為生理鹽水對(duì)照組。治療組按高、中、低不同劑量進(jìn)行天花粉蛋白突變體注射治療。高劑量組一次注射150nm/kg；中劑量組二次治療注射，每次75nm/kg，每周注射一次；低劑量組三次注射，每次37nm/kg，每四天注射一次。每組的總劑量均為150nm/kg。高、中、低三組抑瘤率分別為(43±6)％、(64±8)％、和(94±3)％。兩種動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)論是天花粉蛋白突變體在引產(chǎn)劑量條件下，便可見明顯的抑瘤效應(yīng)。一半引產(chǎn)劑量四次注射便可見90％以上的抑瘤效果，即小劑量多次注射效果尤佳。
上述為人慢性髓細(xì)胞型白血病的細(xì)胞接種至兩種動(dòng)物機(jī)體形成實(shí)體瘤后，天花粉蛋白突變體的治療效果均佳。在此兩種動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，繼續(xù)用SCID小鼠建立了另一種與臨床表現(xiàn)更為接近的人慢性髓細(xì)胞型白血病的動(dòng)物模型。接種K562細(xì)胞后小鼠體內(nèi)生成液體瘤，并通過小鼠血液白血球數(shù)量和其它生化指標(biāo)的變化得到反映。在三個(gè)治療組中，從小鼠尾靜脈注射3.75nm/kg、7.5nm/kg、和15nm/kg劑量的天花粉蛋白突變體，用以治療移植瘤模型小鼠。經(jīng)三次注射后，三個(gè)治療組中小鼠白血球總數(shù)恢復(fù)至正常值的百分比分別為(25±6)％、(75±8)％和(94±3)％。這些數(shù)據(jù)表明MTCS治療液體瘤的劑量可小于實(shí)體瘤，而治療液體瘤的效果卻優(yōu)于實(shí)體瘤。
c-ii)小白鼠急性毒性試驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)。選用八周齡F1小鼠(ICR/Balb-c)，每只動(dòng)物一次注射天然天花粉蛋白或天花粉蛋白突變體，觀察動(dòng)物7天，比較天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體的半致死劑量(LD50)。在同一劑量下，天然天花粉蛋白組相對(duì)天花粉蛋白突變體組可見較高的動(dòng)物死亡率和較早的動(dòng)物死亡時(shí)間。LD50(天然天花粉蛋白)＝18.4mg/Kg，LD50(天花粉蛋白突變體)＝27.5mg/Kg，天花粉蛋白突變體的急性毒性比天然天花粉蛋白幾乎下降了50％。
c-iii)豚鼠體內(nèi)急性過敏試驗(yàn)將天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體分別作豚鼠體內(nèi)急性過敏試驗(yàn)。致敏用量為一次皮內(nèi)注射人引產(chǎn)劑量的4.5倍劑量，14天后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行攻擊，攻擊劑量為一次靜脈注射人引產(chǎn)劑量的10倍。觀察動(dòng)物在受過敏原攻擊后30分鐘內(nèi)的過敏反應(yīng)和死亡情況。天然天花粉蛋白組死亡動(dòng)物數(shù)與試驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)之比為12/14，大約86％。天花粉蛋白突變體組為3/15，大約20％。兩者相較差異顯著。即天花粉蛋白突變體引起的豚鼠體內(nèi)急性過敏程度比天然天花粉蛋白顯著降低。
c-iv)大鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)按Ovary的方法(Ovary Z，et al.，PCA Reactions with MouseAntibodies in Mice and Rats，Inter Archs Allergy Appl Immun，4816-21，1975)，作大鼠被動(dòng)皮膚過敏(Passive Cutaneous anaphylaxis，PCA)試驗(yàn)。兩組小鼠分別用天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體致敏。14天后，分別得到抗天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體的小鼠抗血清。將兩種抗血清分別注入麻醉了的大鼠剃去毛的背部皮內(nèi)，并分別用含天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突變體的1％伊文思藍(lán)注射入大鼠的靜脈進(jìn)行攻擊。30分鐘后，處死動(dòng)物，觀查大鼠背部皮膚藍(lán)斑形成情況，以藍(lán)斑直徑大于0.5cm者為PCA陽(yáng)性反應(yīng)。天然天花粉蛋白組的所有動(dòng)物均顯陽(yáng)性，天花粉蛋白突變體組的所有動(dòng)物均顯陰性。天花粉蛋白突變體誘發(fā)大鼠體內(nèi)IgE應(yīng)答較天然天花粉蛋白銳減。
3.天花粉蛋白突變體抗腫瘤機(jī)理a)天花粉蛋白突變體誘導(dǎo)敏感細(xì)胞的凋亡如上文2a和2b所述，天花粉蛋白突變體對(duì)體外培養(yǎng)中的白血病細(xì)胞有極強(qiáng)的毒性，而無(wú)損正常細(xì)胞。以天花粉蛋白突變體對(duì)K562細(xì)胞的作用為例，經(jīng)多種手段研究其機(jī)理。通過電子顯微鏡觀察可見用天花粉蛋白突變體治療后K562細(xì)胞發(fā)生了典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變細(xì)胞變小，胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核仁消失，染色質(zhì)凝聚濃縮為數(shù)個(gè)團(tuán)塊，和形成有外膜包繞的凋亡小體。天花粉蛋白突變體治療組細(xì)胞還表現(xiàn)出DNA“階梯狀”條帶，這是凋亡的生化指標(biāo)。以及利用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)到的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)的二倍體凋亡峰。這些結(jié)果表明天花粉蛋白突變體誘導(dǎo)了K562細(xì)胞的凋亡。
b)敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在著與天花粉蛋白突變體專一結(jié)合的部位用生物分子相互作用分析系統(tǒng)(Real-time BiomolecularInteraction Analysis，BIA)研究。天花粉蛋白突變體被固相化在傳感片上的葡聚糖基質(zhì)中，形成一面微流細(xì)胞墻(Wall of Micro-flow Cell)。細(xì)胞膜抽提液控制地流經(jīng)表面，反應(yīng)所導(dǎo)致的任何表面濃度的變化被作為SPR(Surface Plasmon Resonance)信號(hào)測(cè)出，并以RU(ResonanceUnit)來衡量。不同種類的敏感細(xì)胞有100至300不等的RU變化，表明天花粉蛋白突變體與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合甚強(qiáng)。而同樣測(cè)試的正常細(xì)胞如人子宮羊膜細(xì)胞則無(wú)明顯結(jié)合發(fā)生。
c)通過激光共聚焦掃描顯微鏡研究，觀察到天花粉蛋白突變體可以通過受體介導(dǎo)形式被內(nèi)吞到K562細(xì)胞內(nèi)。
d)在[35S]GTPγS的結(jié)合實(shí)驗(yàn)里，天花粉蛋白突變體激活敏感細(xì)胞的G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。不敏感細(xì)胞觀察不到此激活現(xiàn)象。
e)通過激光共聚焦掃描顯微鏡，觀察到天花粉蛋白突變體誘導(dǎo)敏感細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)中游離鈣離子的釋放和濃度變化。
以上研究得出的結(jié)論為敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在著天花粉蛋白突變體的受體，能介導(dǎo)天花粉蛋白突變體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮致核糖體失活作用。同時(shí)，天花粉蛋白突變體還干擾了細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。上述雙重作用導(dǎo)致了敏感細(xì)胞的凋亡。敏感細(xì)胞極大多數(shù)是腫瘤細(xì)胞，因而天花粉蛋白突變體治療腫瘤與細(xì)胞毒型和細(xì)胞抑制型的化療藥物使腫瘤和正常組織兩敗俱傷的殺傷機(jī)理完全不同。為天花粉蛋白突變體作為新抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
如上所述，本發(fā)明的天花粉蛋白突變體與天然天花粉蛋白相比大大降低了免疫原性，而基本保留了天然天花粉蛋白的生物活性。低免疫原性使之可以被多次安全地使用，能更好地治療天然天花粉蛋白的適應(yīng)癥。更具體地，這些適應(yīng)癥包括但不局限于以下項(xiàng)目。
1.白血病和其它種類的實(shí)體腫瘤。由于天花粉蛋白突變體選擇性地進(jìn)入靶細(xì)胞的機(jī)理，臨床上使用天花粉蛋白突變體只需少次數(shù)地小劑量給藥。在一定的劑量范圍內(nèi)，天花粉蛋白突變體對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈毒性作用，而不損傷正常細(xì)胞，故不良反應(yīng)極微。
2.病毒性疾病，特別是艾滋病。在艾滋病的治療上天花粉蛋白突變體較天然天花粉蛋白毒副反應(yīng)低，對(duì)病人更安全。
3.宮外孕和中期引產(chǎn)。與天花粉蛋白作為引產(chǎn)藥物時(shí)每個(gè)個(gè)體一生中只能使用一次不同，因其低免疫原性，可以多次安全地使用天花粉蛋白突變體。
本發(fā)明的天花粉蛋白突變體可以與藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑一起形成藥物組合物。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了這樣的藥物組合物，其包括治療有效量的天花粉蛋白突變體和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體或賦型劑的實(shí)例包括但不局限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油及乙醇等或其組合。這樣的藥物組合物的劑型與所選擇的給藥方式相適應(yīng)。
本發(fā)明也提供了一種藥物包裝或試劑盒，包括一個(gè)或多個(gè)裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分的容器。根據(jù)本發(fā)明的天花粉蛋白突變體及其片段或其衍生物也可與其它的治療化合物組合使用。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可用多種方式，諸如口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑，給藥于哺乳動(dòng)物宿主，例如人類。這些藥物組合物用于治療或預(yù)防具體疾病或癥狀時(shí)，應(yīng)按根據(jù)該疾病或癥狀的特性的有效劑量使用。本發(fā)明天花粉蛋白突變體的使用劑量可以參照天然天花粉蛋白的有效劑量確定。
以下實(shí)施例的目的是舉例說明，但無(wú)意限制本發(fā)明。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可按照常規(guī)的方法，方便地獲得天然天花粉蛋白基因。例如以天然天花粉蛋白為探針，從植物栝蔞的cDNA庫(kù)中篩選(Shaw PC，Yung MH，Zhu RH，Ho WK，Ng TB，Yeung HW，et al.，Cloning of Trichosanthin cDNA and its Expression in Escherichia Coli，Gene，97(2)267-72，1991)；又例如設(shè)計(jì)合適的DNA探針，從植物栝蔞的基因文庫(kù)中篩選(Chow TP，F(xiàn)eldman RA，Lovett M，Piatak M，etal.，Isolation and DNA Sequence of a Gene EncodingAlpha-trichosanthin，a Type I Ribosome-inactivating Protein，J.Biol.Chem.265(15)8670-8674，1990)；再例如設(shè)計(jì)合適的DNA引物，利用PCR方法吊取(聶慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及結(jié)構(gòu)分析，第四次中國(guó)基因結(jié)構(gòu)、克隆與表達(dá)學(xué)術(shù)討論會(huì)，海口，A-32，1991)。
利用突變引物1和2對(duì)天花粉蛋白包含信號(hào)肽和尾肽的前體蛋白的cDNA(序列見圖1)進(jìn)行定點(diǎn)突變，使得編碼成熟天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端前引入起始密碼子，并在3’端后引進(jìn)終止密碼子。然后編碼成熟天然天花粉蛋白的DNA被克隆進(jìn)一個(gè)表達(dá)載體。為本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩個(gè)引物。
引物1 5’GTG CAG GCC ATG GAT GTT AGG 3’(SEQ IDNO.3)引物2 5’AAC AAT ATG GCA TAG GAT CCC ATG GAT GAC3’(SEQ ID NO.4)引物1的特點(diǎn)是含限制性內(nèi)切酶NcoI位點(diǎn)(CCATGG)，同時(shí)引進(jìn)起始密碼子(ATG)，并在成熟天然天花粉蛋白的-1位加了一個(gè)Met。
引物2的特點(diǎn)是含限制性內(nèi)切酶BamHI位點(diǎn)(GGATCC)，結(jié)果在編碼成熟天然天花粉蛋白的3’端后引進(jìn)終止密碼子(TAG)。
選用Bio-Rad公司提供的利用噬菌粒進(jìn)行的體外突變藥盒(Muta-Gene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit，目錄號(hào)170-3576)，按藥盒中所附的說明進(jìn)行操作。通過DNA序列分析驗(yàn)證所獲突變。詳見該藥盒廠家說明。
簡(jiǎn)言之，該方法包括以下步驟。
含Uracil的模板DNA的抽提編碼天花粉前體蛋白的原始基因先被克隆進(jìn)噬菌粒載體pTZ-19U，得到模板DNA pTZ-19U-TCS′(聶慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及結(jié)構(gòu)分析，第四次中國(guó)基因結(jié)構(gòu)、克隆與表達(dá)學(xué)術(shù)討論會(huì)，?？冢珹-32，1991)。在含氯霉素培養(yǎng)液里生長(zhǎng)的大腸桿菌CJ236用pTZ-19U-TCS′轉(zhuǎn)化，然后鋪在含青霉素的平板上挑選單菌落。含噬菌粒的轉(zhuǎn)化子在含青霉素的50ml培養(yǎng)液培養(yǎng)至O.D.600為0.3左右。接著加入M13K07輔助噬菌體(Halper Phage)1×1010pfu(噬斑形成單位)后，在37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，再加入卡那霉素3.5mg。繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)后離心，上清液中加入100ug Rnase并保溫30分鐘，在冰浴中用醋酸銨/PEG沉淀30分鐘后離心。沉淀用高鹽緩沖液200ul再懸浮一次，冰浴中放置30分鐘后再次離心。取含Uracil的模板DNA的上清液，先后用酚、酚/氯仿、氯仿抽提。最后該含Uracil的模板DNA用醋酸銨/乙醇在-70℃沉淀，用70％乙醇洗沉淀，并溶解于10-20ul的TE緩沖液。
突變鏈的合成上述含Uracil的模板DNA與0.1到0.3pmol突變引物、退火緩沖液和水混合，混合物先加熱至70℃，在40分鐘時(shí)間內(nèi)緩緩冷卻到30℃。如此冷卻后的混合物放入冰浴中，加入3單位的T4 DNA連接酶和1單位的T4 DNA聚合酶。該合成混合物在冰浴中放置5分鐘，然后在25℃放置5分鐘，最后在37℃放置90分鐘。加入90ul終止緩沖液終止合成反應(yīng)。用該經(jīng)突變后的DNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣處理的感受態(tài)大腸桿菌MV1190。將轉(zhuǎn)化子鋪板于含青霉素的平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑選數(shù)個(gè)單菌落，分別抽提質(zhì)粒，最后經(jīng)DNA序列測(cè)定證實(shí)符合突變?cè)O(shè)計(jì)。在本實(shí)施例情況下該質(zhì)粒為pTZ-19U-TCS，即其5’端含有NcoI位點(diǎn)，3’端含有BamHI位點(diǎn)的編碼成熟天花粉蛋白的DNA序列。
用引物1和引物2突變后得到的質(zhì)粒pTZ-19U-TCS可用于作為實(shí)施例2至6中的模板DNA。另一方面，質(zhì)粒pTZ-19U-TCS接著經(jīng)NcoI和BamHI在37℃雙酶解2小時(shí)，通過低熔點(diǎn)瓊脂醣凝膠電泳分離和回收長(zhǎng)度約750bp的天花粉蛋白基因片段。然后該片段利用T4 DNA連接酶在4℃與事先同樣經(jīng)NcoI和BamHI雙酶解的表達(dá)型質(zhì)粒pET-2d連接過夜，得到可供表達(dá)用的pET-2d-TCS。
實(shí)施例2編碼MTCS(M177)的DNA的突變和克隆利用Bio-Rad公司的Muta-Gene Phagemid in vitro MutagenesisKit進(jìn)行突變。按廠家說明的步驟操作。使用實(shí)施1中得到的質(zhì)粒pTZ-19U-TCS作為模板DNA。使用引物3進(jìn)行定點(diǎn)突變。簡(jiǎn)言之，用pTZ-19U-TCS轉(zhuǎn)化大腸桿菌CJ236。然后在輔助噬菌體存在下抽提出含Uracil的突變模板DNA。接著通過一系列的操作合成突變鏈。這些操作包括混合含Uracil的模板DNA和突變引物、加T4 DNA連接酶、加T4 DNA聚合酶等。如此突變了的DNA被用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌MV1190。最后挑選突變體克隆并經(jīng)DNA序列測(cè)定證實(shí)突變位點(diǎn)，得到pTZ-19U-MTCS(M177)。
為本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了突變引物3。
引物3 5’AAG CGT GTT GACGAAACC TTC CTA CCA 3’(SEQ ID NO.5)引物3的特點(diǎn)是將天然天花粉蛋白177位的Lys的密碼子置換成Glu的密碼子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，下劃線部位的密碼子還可以用其它編碼Glu的堿基替代，如GAG。
如此取得的pTZ-19U-MTCS(M177)接著被NcoI和BamHI雙酶解，得到編碼MTCS(M177)的DNA片段。然后該片段與事先經(jīng)NcoI和BamHI雙酶解后的質(zhì)粒pET-2d連接，從而得到pET-2d-MTCS(M177)。
實(shí)施例3編碼MTCS(M203)的DNA的突變和克隆除根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和使用了一個(gè)不同的引物4外，突變和克隆的操作步驟均按實(shí)施例2中所描述的方法進(jìn)行，從而得到pET-2d-MTCS(M203)。
為本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了突變引物4。
引物4 5’ATT CAG ATA GCGGGTACT AAT AAT GGA 3’(SEQ ID NO.6)引物4的特點(diǎn)是將天然天花粉蛋白203位的Ser的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGC和GGG。即共有4種替代方式。
實(shí)施例4編碼MTCS(M236)的DNA的突變和克隆除根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和使用了一個(gè)不同的引物5外，突變和克隆的操作步驟均按實(shí)施例2中所描述的方法進(jìn)行，從而得到pET-2d-MTCS(M236)。
為本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了突變引物5。
引物5 5’GTT GTA ACC TCCGGCATC GCG TTG CTG3’(SEQ ID NO.7)引物5的特點(diǎn)是將天然天花粉蛋白236位的Asn的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGG和GGT。
實(shí)施例5編碼MTCS(M177，203)的DNA的突變和克隆除根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和使用了兩個(gè)不同的引物3和4外，突變和克隆的操作步驟均按實(shí)施例2中所描述的方法進(jìn)行，從而得到pET-2d-MTCS(M177，203)。
引物3 5’AAG CGT GTT GACGAAACC TTC CTA CCA 3’(SEQ ID NO.5)引物4 5’ATT CAG ATA GCGGGTACT AAT AAT GGA 3’(SEQ ID NO.6)引物3的特點(diǎn)是將天然天花粉蛋白177位的Lys的密碼子置換成Glu的密碼子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，下劃線部位的密碼子還可以用其它編碼Glu的堿基替代，如GAG。
引物4的特點(diǎn)是將天然天花粉蛋白203位的Ser的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGC和GGG。
實(shí)施例6編碼MTCS(M177，203，236)的DNA的突變和克隆除根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和使用了三個(gè)不同的引物3、4和5外，突變和克隆的操作步驟均按實(shí)施例2中所描述的方法進(jìn)行，從而得到pET-2d-MTCS(M177，203，236)。
引物3 5’AAG CGT GTT GACGAAACC TTC CTA CCA3’(SEQ ID NO.5)引物4 5’ATT CAG ATA GCGGGTACT AAT AAT GGA3’(SEQ ID NO.6)引物5 5’GTT GTA ACC TCCGGCATC GCG TTG CTG3’(SEQ ID NO.7)引物3的特點(diǎn)是將天然天花粉蛋白177位的Lys的密碼子置換成Glu的密碼子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，下劃線部位的密碼子還可以用其它編碼Glu的堿基替代，如GAG。
引物4的特點(diǎn)是將天然天花粉蛋白203位的Ser的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGC和GGG。
引物5的特點(diǎn)是將天然天花粉蛋白236位的Asn的密碼子改變成Gly的密碼子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，下劃線部位的堿基還可以用其它編碼Gly的堿基替代，如GGA、GGG和GGT。
實(shí)施例7天花粉蛋白的表達(dá)按常規(guī)操作步驟，用實(shí)施例1中所得含天花粉蛋白基因的質(zhì)粒pET-2d-TCS轉(zhuǎn)化經(jīng)氯化鈣處理過的感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。簡(jiǎn)言之，輕輕混合1-100ng pET-2d-TCS和100ul感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)在冰浴中放置30-60分鐘，該混合物在42℃熱休克90秒后，再放回冰浴中。5分鐘后在該混合物中加入0.5ml的LB培養(yǎng)液，接著在37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。取1/10該培養(yǎng)后的混合物用0.1ml LB培養(yǎng)液稀釋后鋪在含青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)板上。這些板在37℃培養(yǎng)過夜，然后挑取大小形態(tài)均勻的單菌落。轉(zhuǎn)化子在37℃用含青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜后，再用含青霉素和氯霉素的M9ZB培養(yǎng)液在同樣溫度放大培養(yǎng)至A570＝0.8。加IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)后離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲破碎后，離心取上清液加載于CM-Sephadex或CM-Sephorose柱層析。用含0.1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗柱，直至A280下降到基線，然后用0.1-0.4M線性梯度的NaCl洗脫液洗脫。其主峰即為表達(dá)的重組天花粉蛋白。重組天花粉蛋白的氨基酸序列在圖1中如氨基酸殘基1至247所示，在其-1位加上了一個(gè)Met。
實(shí)施例8MTCS(M177)的表達(dá)用實(shí)施例2中所得含有編碼MTCS(M177)的DNA的質(zhì)粒pET-2d-MTCS(M177)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)?；蜣D(zhuǎn)化、表達(dá)和蛋白純化按實(shí)施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M177)。MTCS(M177)的氨基酸序列除了第177位Lys被Glu置換外，與實(shí)施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實(shí)施例9MTCS(M203)的表達(dá)用實(shí)施例3中所得含有編碼MTCS(M203)的DNA的質(zhì)粒pET-2d-MTCS(M203)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)?；蜣D(zhuǎn)化、表達(dá)和蛋白純化按實(shí)施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M203)。MTCS(M203)的氨基酸序列除了第203位Ser被Gly置換外，與實(shí)施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實(shí)施例10MTCS(M236)的表達(dá)用實(shí)施例4中所得含有編碼MTCS(M236)的DNA的質(zhì)粒pET-2d-MTCS(M236)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)。基因轉(zhuǎn)化、表達(dá)和蛋白純化按實(shí)施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M236)。MTCS(M236)的氨基酸序列除了第236位Asn被Gly置換外，與實(shí)施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實(shí)施例11MTCS(M177，203)的表達(dá)用實(shí)施例5中所得含有編碼MTCS(M177，203)的DNA的質(zhì)粒pET-2d-MTCS(M177，203)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)?；蜣D(zhuǎn)化、表達(dá)和蛋白純化按實(shí)施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M177，203)。MTCS(M177，203)的氨基酸序列除了第177位Lys被Glu置換，且第203位Ser被Gly置換外，與實(shí)施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實(shí)施例12MTCS(M177，203，236)的表達(dá)用實(shí)施例6中所得含有編碼MTCS(M177，203，236)的DNA的質(zhì)粒pET-2d-MTCS(M177，203，236)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3，plysS)?；蜣D(zhuǎn)化、表達(dá)和蛋白純化按實(shí)施例7所用相同的步驟操作，藉此得到MTCS(M177，203，236)。MTCS(M177，203，236)的氨基酸序列除了第177位Lys被Glu置換、第203位Ser被Gly置換，且第236位Asn被Gly置換外，與實(shí)施例7中的重組天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
實(shí)施例13MTCS(M177)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)RIP活性按Pelhem & Jackson方法測(cè)定(H.K.B.Pelhem and R.J.Jackson，Eur.J.Biochem.67247-256，1976)。兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液為Promega產(chǎn)品。[3H]亮氨酸為New England Nuclear產(chǎn)品。引產(chǎn)活性測(cè)定按本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行(Nie HL，et al.，Position 120-123，aPotential Active Site of Trichosanthin，Life Sciences，62(6)491-500，1998)，以懷孕11天的ICR小鼠為模型。動(dòng)物背部注射75nmol/KgMTCS(M177)，48小時(shí)后處死。解剖記錄總胎鼠數(shù)及死亡胎鼠數(shù)(包括胎兒吸收點(diǎn))，計(jì)算胎鼠死亡率。體外免疫反應(yīng)能力用ELISA方法檢測(cè)。IgG抗體和單克隆抗體IgE為本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室自行制備和純化(He XH，et al.，Acta Biochemia et Biophysica Sinica，26657-662，1994)?？贵w用免疫親和層析柱純化。本實(shí)施例所有實(shí)驗(yàn)均用天然天花粉蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果列于表7。
表7MTCS(M177)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)
*實(shí)施例13至17中的“+”、“-”等所代表的數(shù)值參見表4。
實(shí)施例14MTCS(M203)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)按實(shí)施例13同樣方法測(cè)定MTCS(M203)的RJP活性、引產(chǎn)活性和體外免疫反應(yīng)能力。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均用天然天花粉蛋白為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果列于表8。
表8MTCS(M203)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)
實(shí)施例15MTCS(M236)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)按實(shí)施例13同樣方法測(cè)定MTCS(M236)的RIP活性、引產(chǎn)活性和體外免疫反應(yīng)能力。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均用天然天花粉蛋白為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果列于表9。
表9MTCS(M236)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)
實(shí)施例16MTCS(M177，203)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)按實(shí)施例13同樣方法測(cè)定MTCS(M177，203)的RIP活性、引產(chǎn)活性和體外免疫反應(yīng)能力。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均用天然天花粉蛋白為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果列于表10。
表10MTCS(M177，203)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)
實(shí)施例17MTCS(M177，203，236)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)按實(shí)施例13同樣方法測(cè)定MTCS(M177，203，236)的RIP活性、引產(chǎn)活性和體外免疫反應(yīng)能力。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均用天然天花粉蛋白為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果列于表11。
表11MTCS(M177，203，236)生物學(xué)活性和免疫反應(yīng)能力的檢測(cè)
實(shí)施例18MTCS(M177)對(duì)K562細(xì)胞的毒性用MTT(3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物細(xì)胞毒試驗(yàn)測(cè)定MTCS(M177)對(duì)人慢性髓細(xì)胞型白血病K562細(xì)胞和正常人淋巴細(xì)胞的毒性。每種細(xì)胞，以在含有10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)的200000數(shù)量級(jí)細(xì)胞，于37℃、5％CO2條件下接種細(xì)胞。分別加入1、5、10、20、50、100ug/ml的MTCS(M177)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時(shí)后每孔加入25ulMTT(購(gòu)自Sigma)(5mg/ml)終止反應(yīng)，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后每孔加入裂解緩沖液以裂解細(xì)胞。37℃放置過夜，用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)板各孔A570值。經(jīng)計(jì)算MTCS(M177)對(duì)K562的LC50＜30ug/ml。對(duì)正常人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)MTCS(M177)不敏感，因?yàn)樵贛TCS(M177)的濃度高達(dá)1000ug/ml條件下，測(cè)不出LC50值。
實(shí)施例19MTCS(M203)對(duì)K562細(xì)胞的毒性用實(shí)施例18相同方法測(cè)定MTCS(M203)對(duì)人慢性髓細(xì)胞型白血病K562細(xì)胞和正常人淋巴細(xì)胞的毒性。經(jīng)計(jì)算MTCS(M203)對(duì)K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴細(xì)胞不敏感，因?yàn)樵贛TCS(M203)的濃度高達(dá)1000ug/ml條件下，測(cè)不出LC50值。
實(shí)施例20MTCS(M236)對(duì)K562細(xì)胞的毒性用實(shí)施例18相同方法測(cè)定MTCS(M236)對(duì)人慢性髓細(xì)胞型白血病K562細(xì)胞和正常人淋巴細(xì)胞的毒性。經(jīng)計(jì)算MTCS(M236)對(duì)K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴細(xì)胞不敏感，因?yàn)樵贛TCS(M236)的濃度高達(dá)1000ug/ml條件下，測(cè)不出LC50值。
實(shí)施例21MTCS(M177，203)對(duì)K562細(xì)胞的毒性用實(shí)施例18相同方法測(cè)定MTCS(M177，203)對(duì)人慢性髓細(xì)胞型白血病K562細(xì)胞和正常人淋巴細(xì)胞的毒性。經(jīng)計(jì)算MTCS(M177，203)對(duì)K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴細(xì)胞不敏感，因?yàn)樵贛TCS(M177，203)的濃度高達(dá)1000ug/ml條件下，測(cè)不出LC50值。
實(shí)施例22
MTCS(M177，203，236)對(duì)K562細(xì)胞的毒性用實(shí)施例18相同方法測(cè)定MTCS(M177，203，236)對(duì)人慢性髓細(xì)胞型白血病K562細(xì)胞和正常人淋巴細(xì)胞的毒性。經(jīng)計(jì)算MTCS(M177，203，236)對(duì)K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴細(xì)胞不敏感，因?yàn)樵贛TCS(M177，203，236)的濃度高達(dá)1000ug/ml條件下，測(cè)不出LC50值。
序列表序列表<110>北京翔天牧生物科技有限公司柯一保聶慧玲<120>天花粉蛋白突變體<130>US0158<150>CN00119553.0<151>2000-08-02<150>CN01103102.6<151>2001-01-18<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>289<212>PRT<213>栝樓<400>1Met Ile Arg Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu Ile Leu Thr Leu Phe Leu1 5 10 15Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala20 25 30Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu35 40 45Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu50 55 60Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp65 70 75 80Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly85 90 95Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr100 105 110Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu115 120 125Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile130 135 140Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr145 150 155 160Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val165 170 175Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln180 185 190Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile195 200 205Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile210 215 220Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn225 230 235 240Ala Gln Asn Gln Arg Val Thr Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val245 250 255Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala Ala Met260 265 270Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gln Ser Phe Gly Cys Gly Ser Tyr Ala275 280 285Leu<210>2<211>870<212>DNA<213>栝樓<400>2atgatcagat tcttagacct ctctttgcta attctcaccc tcttcctaac aactcctgct 60gtggagggcg atgttagctt ccgtttatca ggtgcaacaa gcagttccta tggagttttc120atttcaaatc tgagaaaagc tcttccaaat gaaaggaaac tgtacgatat ccctctgtta180cgttccagtc ttccaggttc tcaacgctac gcattgatcc atctcacaaa ttacgccgat240gaaaccattt cagtggccat agacgtaacg aacgtctata ttatgggata tcgcgctggc300gatacatcct attttttcaa cgaggcttct gcaacagaag ctgcaaaata tgtattcaaa360gacgctatgc gaaaagttac gcttccatat tctggcaatt acgaaaggct tcaaactgct420gcaggcaaaa taagggaaaa tattccgctt ggactccctg ctttggacag tgccattacc480actttgtttt actacaacgc caattctgct gcgtcggcac ttattgtact cattcagtcg540acgtctgagg ctgcgaggta taaatttatt gagcaacaaa ttgggaagcg tgttgacaaa600accttcctac caagtttagc aattataagt ttggaaaata gttggtctgc tctctccaag660caaattcaga tagcgagtac taataatgga cagtttgaaa gtcctgttgt gcttataaat720gctcaaaacc aacgagtcac gataaccaat gttgatgctg gagttgtaac ctccaacatc780gcgttgctgc tgaatagaaa caatatggca gccatggatg acgatgttcc tatgacacag840agctttggat gtggaagtta tgctatttag 870<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3gtgcaggcca tggatgttag g21<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4aacaatatgg cataggatcc catggatgac 30<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5aagcgtgttg acgaaacctt cctacca 27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6attcagatag cgggtactaa taatgga 27<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7gttgtaacct ccggcatcgc gttgctg 2權(quán)利要求
1.一種低免疫原性的天花粉蛋白突變體，其含有天然天花粉蛋白的氨基酸序列，且在以下三個(gè)區(qū)域有至少一個(gè)氨基酸殘基的修飾氨基酸殘基第174位到180位，203位到226位，和230位到244位；或包含所述修飾并基本保留天花粉蛋白生物活性的所述天花粉蛋白突變體的片段或衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中所述修飾是選自缺失、插入、添加、置換，和化學(xué)修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中所述置換選自用疏水性氨基酸殘基置換親水性氨基酸殘基、用親水性氨基酸殘基置換疏水性氨基酸殘基、用堿性氨基酸殘基置換酸性氨基酸殘基，和用酸性氨基酸殘基置換堿性氨基酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中所述修飾能引起被修飾氨基酸位點(diǎn)的電荷改變。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中選自174位精氨酸、177位賴氨酸、222位精氨酸、和243位精氨酸的至少一個(gè)氨基酸殘基被相互獨(dú)立地用谷氨酸、門冬氨酸或甘氨酸置換。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中選自176位門冬氨酸、205位門冬酰胺、206位門冬酰胺、208位谷氨酰胺、210位谷氨酸、217位門冬酰胺、219位谷氨酰胺、220位門冬酰胺、221位谷氨酰胺、236位門冬酰胺、242位門冬酰胺和244位門冬酰胺的至少一個(gè)氨基酸殘基被相互獨(dú)立地用賴氨酸或甘氨酸置換。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中選自178位蘇氨酸、203位絲氨酸、204位蘇氨酸、211位絲氨酸、224位蘇氨酸、226位蘇氨酸、234位蘇氨酸，和235位絲氨酸的至少一個(gè)氨基酸殘基被相互獨(dú)立地用甘氨酸或丙氨酸置換。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中選自175位纈氨酸、179位苯丙氨酸、180位亮氨酸、207位甘氨酸、209位苯丙氨酸、212位脯氨酸、213位纈氨酸、214位纈氨酸、215位纈氨酸、223位纈氨酸、216位異亮氨酸、225位異亮氨酸、218位丙氨酸、230位丙氨酸、238位丙氨酸、231位甘氨酸、232位纈氨酸、233位纈氨酸、237位異亮氨酸、239位亮氨酸、240位亮氨酸和241位亮氨酸的至少一個(gè)氨基酸殘基被相互獨(dú)立地缺失。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中所述三個(gè)區(qū)域的二個(gè)或三個(gè)中的每一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸殘基被修飾。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的蛋白突變體或其片段或其衍生物，其中177位賴氨酸被谷氨酸置換，且203位絲氨酸被甘氨酸置換。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的蛋白突變體或片段或衍生物，其中177位賴氨酸被谷氨酸置換，203位絲氨酸被甘氨酸置換，且236位谷氨酰胺被甘氨酸置換。
12.編碼權(quán)利要求1至11之任一項(xiàng)的蛋白突變體或其片段或其衍生物的核酸。
13.包含根據(jù)權(quán)利要求12的核酸的載體。
14.用根據(jù)權(quán)利要求12的核酸或根據(jù)權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
15.一種制備權(quán)利要求1至11之任一項(xiàng)的蛋白突變體或其片段或其衍生物的方法，包括在有利于所述蛋白突變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所述蛋白突變體。
16.包含權(quán)利要求1至11之任一項(xiàng)的蛋白突變體或其片段或其衍生物和制藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
17.作為藥物的根據(jù)權(quán)利要求1至11之任一項(xiàng)的蛋白突變體或其片段或其衍生物。
18.權(quán)利要求1至11之任一項(xiàng)的蛋白突變體或其片段或其衍生物在制備治療病毒性疾病、治療腫瘤、引產(chǎn)和/或治療宮外孕的藥物中的應(yīng)用。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的應(yīng)用，其中所述藥物為用于引產(chǎn)的藥物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的應(yīng)用，其中所述藥物為用于治療艾滋病的藥物。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的應(yīng)用，其中所述藥物為用于治療白血病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種天花粉蛋白突變體(MTCS)產(chǎn)品及其制備方法。本發(fā)明的產(chǎn)品相比天然天花粉蛋白顯著地降低了過敏原性，而保留了天然天花粉蛋白的生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、引產(chǎn)、及核糖體失活蛋白活性。根據(jù)本發(fā)明的天花粉蛋白突變體能用于作為高效低毒地治療腫瘤、艾滋病、宮外孕和中期引產(chǎn)等的藥物。其低免疫原性允許天花粉蛋白突變體安全多次使用。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1468257SQ01816701
公開日2004年1月14日 申請(qǐng)日期2001年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月2日
發(fā)明者柯一保, 聶慧鈴 申請(qǐng)人:北京翔天牧生物科技有限公司