專利名稱：抗血管生成的多肽的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及來自纖維蛋白原的具抗血管生成作用的多肽。
血管生成為從已有血管床出發(fā)的新血管發(fā)育，是一個復雜的多階段過程，涉及到細胞外基質(zhì)組分的降解，以及隨后內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和分化以形成細管，并最終形成新血管。血管生成對以下正常生理進程是重要的，其中所述生理進程包括但不限于胚胎植入、胚胎發(fā)生和發(fā)育，以及傷口愈合。過度的血管生成也與如腫瘤細胞生長和非癌疾病等病理疾病相關，其中非癌疾病如新生血管性青光眼、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病和糖尿病性視網(wǎng)膜病。
血管內(nèi)皮在一般情況下為靜止的。但是在激活后，內(nèi)皮細胞可增殖并遷移，形成微管，后者最終形成毛細血管床，用來將血液提供給發(fā)育中的組織，自然也提供給正在生長的腫瘤。目前已鑒定了一系列促進/激活內(nèi)皮細胞進行血管生成的生長因子。這些生長因子包括但不限于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGFb)、酸性和堿性成纖維細胞生長因子(aFGF和bFGF)，以及血小板來源的生長因子(PDGF)(1，2)。
VEGF為具有非常特異的作用位點的內(nèi)皮細胞特異的生長因子，即促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移和分化。VEGF為含有2條相同23kD多肽的二聚體復合物。VEGF的單體可以以四種不同分子量的多肽形式存在，其中每一種都來自于不同剪接的mRNA。在這四種單體形式中，兩種以膜結(jié)合VEGF形式存在，兩種為可溶的。多種細胞/組織類型都表達VEGF，包括胚胎組織、增生的角質(zhì)細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞。研究(2)已顯示VEGF在許多種腫瘤細胞系中高表達，包括膠質(zhì)瘤和AIDS相關的卡波西肉瘤。VEGF的活性通過內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞表達的VEGF特異性受體介導。事實上，在浸潤腫瘤的內(nèi)皮細胞上，VEGF受體上調(diào)，從而促進腫瘤細胞生長。
bFGF是一種刺激成纖維細胞和內(nèi)皮細胞增殖的生長因子。bFGF為具16.5Kd分子量的單一多肽鏈。已發(fā)現(xiàn)了氨基末端區(qū)長度不同的幾種bFGF分子形式。但這些不同分子形式的生物功能似乎是相同的。bFGF由垂體產(chǎn)生，并由位于人第4號染色體上的單一基因編碼。
已發(fā)現(xiàn)了許多血管生成的內(nèi)源性抑制劑，例如制管張素和內(nèi)皮抑素(endostatin)，它們分別是通過對纖溶酶原和膠原XVIII進行蛋白酶剪切而形成的。這兩種因子均已顯示出可以抑制促血管生成(pro-angiogenic)的生長因子如血管VEGF和bFGF的活性。在體外，這兩種因子均可抑制內(nèi)皮細胞對VEGF和bFGF的應答，并能在動物模型中降低實驗性腫瘤的血管形成和生長。
纖維蛋白原為纖維蛋白的可溶性循環(huán)前體，其為含有成對不同鏈(即α-、β-和γ-鏈)的二聚體分子。它們排列為三個分立的結(jié)構(gòu)域，為兩個外部的D-結(jié)構(gòu)域和中央的E-結(jié)構(gòu)域(4)。纖維蛋白原可被纖溶酶或凝血酶消化。
纖溶酶切割纖維蛋白原的第一步為對α-鏈C-末端結(jié)構(gòu)域的切割。然后纖溶酶從一個E結(jié)構(gòu)域(由通過二硫鍵結(jié)合在一起的α-、β-和γ-鏈的NH2末端組成)上切割下兩個D結(jié)構(gòu)域和多個較小的片段，包括小肽，β1-42(β-鏈的氨基末端)(5)。另一方面，凝血酶產(chǎn)生纖維蛋白單體和兩個拷貝的血纖肽A和B(4)。已顯示纖維蛋白原在實體瘤的滲漏血管周圍聚積(5)，也已顯示纖維蛋白原在宿主-瘤分界面聚合，以形成纖維蛋白網(wǎng)絡，后者通過支持內(nèi)皮細胞的粘附、遷移、增殖和分化而促進腫瘤血管生成(7)。
纖維蛋白E-片段(FnE-片段)由蛋白酶剪切纖維蛋白產(chǎn)生，在尿囊絨膜測試中刺激血管生成(8)。而且，存在于侵襲性乳腺癌中的該蛋白質(zhì)的量與腫瘤血管供應的程度正相關(5)。
在我們的共同待決申請PCT/GB01/02079中，公開了一種有效的新型血管生成抑制劑，纖維蛋白原E，其為纖維蛋白原的50kDa蛋白酶解片段，所述申請在此引用作為參考。目前我們已在纖維蛋白原E片段中鑒定出一個結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域與較之大得多的纖維蛋白原E片段具有相同抗血管生成活性。該結(jié)構(gòu)域位于α鏈的氨基端，并被稱為α1-24。來自該結(jié)構(gòu)域的多肽具有抗血管生成活性。我們也已鑒定了保留未修飾α1-24肽的抗血管生成活性的修飾α1-24肽。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了包含選自以下的氨基酸序列的多肽i)序列為ADSXEXXFLAEGGGVXXPXVVEXH的肽，其中X為任意的氨基酸殘基；ii)(i)中所表示的肽，其中氨基酸殘基X選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸；和iii)具有抗血管生成活性的在(i)或(ii)中表示的肽。
提及的抗血管生成活性可通過本文公開的試驗測定。例如，本發(fā)明的多肽可以通過體外試驗進行檢測，所述試驗包括對內(nèi)皮細胞介導的細管形成的抑制、對內(nèi)皮細胞遷移的抑制、對VEGF和bFGF誘導的內(nèi)皮細胞增殖的抑制和內(nèi)皮細胞毒性試驗。多肽也可應用如本文公開的鼠腫瘤模型中進行體內(nèi)試驗。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所述多肽包含選自以下的一段氨基酸序列A D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V E R HA D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V EXHA D S G E G D F L A E G G G V R G PXV V E R HA D S G E G D F L A E G G G V RXP R V V E R HA D S G E G D F L A E G G G VXG P R V V E R HA D S G E GXF L A E G G G V R G P R V V E R HA D S G EXD F L A E G G G V R G P R V V E R HA D SXE G D F L A E G G G V R G P R V V E R HA D SXEXD F L A E G G G V RXP R V V E R HA D S G E GXF L A E G G G V R G PXV V E R H在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述肽包含的氨基酸序列中X為丙氨酸。
而在本發(fā)明再進一步優(yōu)選的實施方案中，所述多肽包含氨基酸序列A D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V E R H
所提及的α1-24肽為具有以下序列的肽A D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V E R H，或來自該序列的活性肽，此時所述序列已由加入、缺失或替換至少一個氨基酸殘基進行了修飾。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述多肽的長度為至少24個氨基酸殘基。該多肽優(yōu)選地由氨基酸序列ADSGEGDFLAEGGGVRGPRVVERH，或其片段組成。
提及片段時是指來自α1-24肽并保留了抗血管生成活性的肽。此類片段的長度可為3個氨基酸；該片段的長度優(yōu)選地為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個氨基酸殘基。
本領域的技術(shù)人員明了，對含α1-24的多肽的氨基酸序列進行修飾可增加多肽對其靶序列的結(jié)合和/或穩(wěn)定性。此外，多肽的修飾也可增加多肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性，由此減少抑制血管生成所需的有效多肽量。這將有利于減少可在體內(nèi)產(chǎn)生的不期望的副作用。修飾包括，例如但不限于，乙?；王０坊?。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，包含α1-24序列的所述多肽進行了乙?；?。該乙酰化優(yōu)選位于該多肽的氨基端。更優(yōu)選地為α1-24肽氨基端的丙氨酸進行了乙?；?。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，包含α1-24序列的所述多肽進行了酰胺化。該酰胺化優(yōu)選地位于該多肽的羧基端。更為優(yōu)選地，酰胺化位于羧基端的組氨酸上。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，α1-24肽或其片段進行了乙?；王０坊揎?。優(yōu)選地，該乙?；挥讦?-24肽氨基端的丙氨酸上，而該酰胺化位于α1-24肽羧基端的組氨酸上。
對本領域的技術(shù)人員而言，顯而易見的是，此處公開的α1-24肽的片段容易接受如乙酰化和/或酰胺化等修飾。
作為備選方案或優(yōu)選地，所述修飾包括在含α1-24肽的多肽的重組或合成生產(chǎn)中應用修飾氨基酸。
本領域技術(shù)人員明了，修飾氨基酸包括但不限于4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、N6-乙酰基賴氨酸、N6-甲基賴氨酸、N6，N6-二甲基賴氨酸、N6，N6，N6-三甲基賴氨酸、環(huán)己基丙氨酸、D-氨基酸、鳥氨酸。其他修飾包括具有C2、C3或C4烷基R基團的氨基酸，所述基團任選地被1、2或3個取代基取代，所述取代基選自鹵素(如F、Br、I)、羥基或C1-C4烷氧基。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的多肽，所述多肽包含至少一個修飾氨基酸，其中X代表該修飾氨基酸的位置。
修飾氨基酸的摻入可使含α1-24的多肽具有有利的性質(zhì)。例如，修飾氨基酸的摻入可增強多肽與其結(jié)合位點的親和性，或修飾氨基酸可增加多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，由此使得可以降低施與患者的治療多肽的有效量。
對本領域的技術(shù)人員而言顯而易見的是，保留抗血管生成活性的α1-24片段可通過應用如蛋白水解酶對完整的多肽進行裂解而獲得。作為備選方案，片段可從頭進行合成，并經(jīng)如環(huán)化進行修飾。環(huán)化在本領域是公知的(見Scott等，Chem Biol(2001)，8801-815；Gellerman等J.PeptideRes(2001)，57277-291；Dutta等J.Peptide Res(2000)，8398-412；Ngoka和Gross，J Amer Soc Mass Spec(1999)，10360-363)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽進行了環(huán)化修飾。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了包含選自以下的DNA序列的核酸分子i)如圖5a中所示的DNA序列；ii)如圖5a中所示的DNA序列，但此時該序列已通過在至少一個密碼子中加入、缺失或替換至少一個核苷酸減基進行修飾以編碼根據(jù)本發(fā)明的修飾肽；iii)與圖6中所示編碼具有抗血管生成活性的肽的序列雜交的DNA序列；和iv)由于遺傳密碼而與(i)、(ii)或(iii)中所定義的DNA序列簡并的DNA序列。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，提供可以與以上(i)、(ii)、(iii)和(iv)中所描述的序列在嚴格的雜交條件下發(fā)生退火的分離的核酸分子。
嚴格的雜交/洗滌條件在本領域內(nèi)是熟知的。例如核酸雜交體在0.1xSSC、0.1％SDS中60℃洗滌后為穩(wěn)定的。本領域熟知，如果核酸序列已知的話，可計算最佳雜交條件。雜交條件一般應用4-6xSSPE(20xSSPE為每升含溶解的175.3g NaCl、88.2g NaH2PO4H2O和7.4g EDTA，且pH值調(diào)整到7.4)、5-10x Denhardts溶液(50x Denhardts溶液含5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)、5g聚乙烯吡咯烷酮及5g牛血清白蛋白)、100μg-1.0mg/ml超聲降解的鮭魚/鯡魚DNA、0.1-1.0％十二烷基硫酸鈉；任選的40-60％去離子甲酰胺。雜交溫度根據(jù)核酸目標序列的GC含量有所變化，但一般在42℃-65℃之間。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了含α1-24肽或其部分的藥物組合物。
施用時，本發(fā)明的藥物組合物可以以可藥用制劑的形式施用。此制劑可例行包括可藥用濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、兼容載體、輔助的免疫增強劑(如佐劑和細胞因子)和任選地其他治療劑，如化療劑。
本發(fā)明的藥物組合物的施用可通過任何常規(guī)途徑進行，包括注射或延時逐漸輸注。施用途徑可為如口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或經(jīng)皮。
本發(fā)明的組合物以有效量施用?！坝行Я俊睘閱为毣蚺c其他藥劑聯(lián)合應用時產(chǎn)生所需反應的組合物量。在治療特定疾病如癌癥時，所需的反應為抑制疾病的發(fā)展。這可能涉及臨時減慢疾病的進程，但更優(yōu)選涉及永久地終止疾病的進程。這可通過常規(guī)方法進行監(jiān)控。
當然，此量將取決于進行治療的特定疾病、疾病的嚴重程度、病人的個體參數(shù)(包括年齡、體質(zhì)、身高和體重)、治療的持續(xù)時間、同時進行的治療的性質(zhì)(如果有)、給藥的具體途徑，以及屬于健康從業(yè)者知識和技能范圍內(nèi)的類似因素。這些因素為本領域的普通技術(shù)人員所公知，并可使用常規(guī)實驗確定。
用于前述治療方法的藥物組合物優(yōu)選為無菌的，且在適于給患者施用的單位重量或體積內(nèi)含有能引起所需反應的有效量的α1-24肽或編碼α1-24肽的核酸。
給個體施用的α1-24肽或編碼α1-24肽的核酸的劑量可根據(jù)不同的參數(shù)進行選擇，特別是可以根據(jù)施用的方式和個體的狀態(tài)進行選擇。其他因素包括所期望的治療期。在起始施用劑量不能在個體內(nèi)產(chǎn)生足夠的反應時，可在病人耐受程度容許的范圍內(nèi)應用更高的劑量(或通過不同的、更為局部的施用途徑獲得的有效更高劑量)。
給藥時，本發(fā)明的治療制劑以治療上可接受的量和可藥用組合物的形式施用。術(shù)語“可藥用”指不干擾活性成分的生物活性效力的無毒材料。該制劑一般可以含有鹽、緩沖劑、防腐劑、兼容載體和任選的其他治療劑。當用于醫(yī)用時，鹽應為可藥用鹽，但由于非可藥用鹽可方便地用于制備其可藥用鹽，故不應排除在本發(fā)明的范圍之外。
如果需要，α1-24肽組合物可與可藥用載體結(jié)合。此處應用的術(shù)語“可藥用載體”指適于施用給人類的一種或多種兼容的固體或液體填充劑、稀釋劑或形成膠囊的物質(zhì)。術(shù)語“載體”指有機的或無機的、天然或合成的成分，活性成分與之結(jié)合將有利于應用。
藥物組合物可含有適宜的緩沖劑，包括乙酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽。
優(yōu)選地，藥物組合物也可包括適宜的防腐劑，如苯扎氯銨、氯代丁醇、對羥苯甲酸酯和硫柳汞。
藥物組合物可方便地以單位劑量形式呈現(xiàn)，且可通過制藥領域公知的任何方法進行制備。所有的方法都包括將活性劑與載體結(jié)合的步驟，所述載體構(gòu)成一個或多個輔助成分。一般而言，組合物制備時使活性成分與液體載體、細碎的固體載體或二者均一地且密切地結(jié)合，然后需要時，將產(chǎn)物成形。
適于口服給藥的組合物可以以離散單位的形式呈現(xiàn)，如膠囊、片劑、錠劑，各單位含有預定量的活性成分。其他組合物包括在水性溶液或非水性溶液中的懸浮物如糖漿、酏劑或乳劑。
適于腸胃外給藥的組合物方便地包括α1-24肽或核酸的無菌水性或非水性制劑，該制劑優(yōu)選與接受者的血液等滲。該制劑可通過已知的方法應用合適的分散劑或潤濕劑或懸浮劑進行配制。無菌注射制劑也可以為在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸液，如1，3-丁二醇中的溶液?？蓱玫目山邮艿馁x形劑和溶劑有水、林格液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)油可方便地用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可應用任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成的單或雙甘油酯。此外，脂肪酸(如油酸)可用于注射劑的制備。
適于口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等施用途徑的載體制劑可在Remington藥物科學(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司，Easton，PA)中查詢。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物調(diào)節(jié)血管生成。該調(diào)節(jié)優(yōu)選地為抑制血管生成。該抑制優(yōu)選涉及內(nèi)皮細胞激發(fā)的血管生成。
作為備選方案，或優(yōu)選地，所述抑制為對巨噬細胞和/或腫瘤細胞所激發(fā)的血管生成的抑制。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述抑制作用通過對促血管生成因子的抑制來介導。理想的情況是這些因子是細胞內(nèi)或細胞表面的受體。
更優(yōu)選地，所述抑制作用通過抑制促血管生成的生長因子的活性來介導。該生長因子理想地選自VEGF、bFGF、aFGF、TGFβ、PDGF。
而根據(jù)本發(fā)明再一方面，提供了含α1-24肽或其部分的多肽在癌癥治療藥劑的生產(chǎn)中的應用。
含α1-24肽的多肽可應用標準的肽合成技術(shù)通過體外肽合成進行生產(chǎn)。作為備選方案，或優(yōu)選地，多肽可通過本領域公知的重組技術(shù)生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明再一方面，提供了載體，其中該載體含有編碼含α1-24肽的多肽的核酸分子。
作為備選方案，可以使含有編碼如下多肽的核酸的載體適應重組表達，其中所述多肽包含α1-24肽。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述載體為適應于原核或真核細胞表達的表達載體。優(yōu)選使該真核載體適應于基因治療。
所述適應一般包括，例如但不限于，提供介導細胞/組織特異性表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(啟動子序列)。這些啟動子序列可為細胞/組織特異的，誘導型的或組成型的。
啟動子為本領域認可的術(shù)語，為清楚起見，其包括下列僅以舉例方式而非限制性方式舉出的特性。增強子元件為順式作用核酸序列，通常位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點的5’端(增強子也可位于基因序列的3’端或甚至位于內(nèi)含子序列中，因此是不依賴位置的)。增強子的作用是提高與增強子連接的基因的轉(zhuǎn)錄速率。增強子的活性將對如下反式作用轉(zhuǎn)錄因子(多肽)起反應，其中所述反式作用轉(zhuǎn)錄因子顯示出能特異性地與增強子元件結(jié)合。而轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合/活性(請參見真核轉(zhuǎn)錄因子(Eukaryotic TranscriptionFactors)，David S Latchman，Academic Press Ltd，San Diego)對許多環(huán)境信號起反應，其中所述環(huán)境信號包括但不限于中間代謝物、環(huán)境效應物。
啟動子元件也包括所謂的TATA盒和RNA聚合酶起始選擇(RIS)序列，其作用在于選擇轉(zhuǎn)錄起始位點。這些序列也與多肽結(jié)合，而此多肽尤其起促進RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄起始選擇的作用。
適應也包括提供選擇標記和自主復制序列，它們均利于所述載體在真核細胞或原核宿主中的維持。自主維持的載體稱為游離型載體。
有利于載體編碼基因?qū)崿F(xiàn)表達的適應包括提供轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷酸化序列。這還包括提供內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，其作用在于使以雙順反子或多順反子表達盒排列的載體編碼基因的表達得以最大化。
這些適應為本領域熟知的。有大量的關于一般性的表達載體構(gòu)建和重組DNA技術(shù)的公開文獻。請參見Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約及其中的參考文獻；Marston，F(xiàn)(1987)DNA克隆技術(shù)實用方法卷III(DNA Cloning TechniquesA Practical Approach Vol III)IRLPress，英國牛津；DNA克隆(DNA Cloning)F M Ausubel等，分子生物學最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
而在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的核酸的基因治療載體。
對本領域的技術(shù)人員而言顯而易見的是，將基因治療載體向內(nèi)皮細胞或腫瘤細胞遞送可以使含α1-24肽的多肽定向在腫瘤附近產(chǎn)生，由此提高含α1-24的多肽的抗血管生成效應。
而根據(jù)本發(fā)明再一方面，提供了用根據(jù)本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細胞。理想的情況是，該核酸為根據(jù)本發(fā)明的載體。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了用于生產(chǎn)含α1-24的多肽的方法，包括i)提供根據(jù)本發(fā)明的細胞；ii)提供利于包含α1-24的多肽生產(chǎn)的條件；和iii)從細胞或細胞培養(yǎng)環(huán)境中純化出該多肽。
而根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了非人轉(zhuǎn)基因動物，其特征為該動物的基因組中摻入了編碼包含α1-24的多肽的核酸分子。
對本領域的技術(shù)人員而言顯而易見的是，通過提供編碼包含α1-24的多肽的轉(zhuǎn)基因遺傳修飾的非人轉(zhuǎn)基因動物可以用作活性多肽的備選來源。轉(zhuǎn)基因動物可用于生產(chǎn)各種治療性多肽，這在本領域是公知的。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因為人源的。
在本發(fā)明的再一方面，提供了治療可受益于抑制血管生成的動物的方法，該方法包括i)對待治療的動物施用有效量的含有α1-24的藥劑；ii)監(jiān)測該藥劑的血管生成抑制效果。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述治療為抑制腫瘤的發(fā)展。
在一個備選治療方法中，含α1-24的多肽進一步與可增強多肽的抗血管生成效應的藥劑綴合、結(jié)合或交聯(lián)。
一般地，此藥劑可為細胞毒性劑、另一種抗血管生成劑、前藥活化酶、化療劑、促凝血劑(pro-coagulant)或免疫調(diào)節(jié)因子。
這些藥劑的實例在本領域內(nèi)是熟知的，例如但不限于細胞毒素諸如蓖麻毒素A-鏈或白喉毒素；腫瘤中重要的促血管生成因子(如VEGF、bFGF、TNFα、PDGF)的拮抗劑，包括這些因子的中和抗體或受體、或它們的受體的酪氨酸激酶抑制劑(如針對VEGF受體的SU5416，F(xiàn)lk-1/KDR)；前藥活化酶如人單純皰疹病毒-胸苷激酶HSV-TK，當前藥丙氧鳥苷全身施用后，HSV-TK將活化前藥丙氧鳥苷；化療劑如新制癌素、順鉑、碳鉑、環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、巰基嘌呤、道諾霉素、阿霉素、表阿霉素、長春堿、長春新堿、放線菌素D、絲裂霉素C、紫杉酚、L-天冬酰胺酶、G-CSF、enediyne如chalicheamicin或埃斯波霉素、苯丁酸氮芥、ARA-C、長春堿酰胺、博來霉素和表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷。
此外，或備選地，還可以使人類組織因子的細胞表面結(jié)構(gòu)域(即，組織因子的截短形式(tTF)與α1-24結(jié)合。當截短的TF游離于循環(huán)中時，具有有限的抗內(nèi)皮活性，但當它靶向腫瘤內(nèi)皮細胞表面時，則成為有效的和選擇性的凝血酶原(即它在血管內(nèi)引起廣泛的血栓形成和凝血)。
免疫調(diào)節(jié)因子的一個示例為人類IgG1的Fc效應結(jié)構(gòu)域。其結(jié)合自然殺傷(NK)細胞，且還結(jié)合啟動補體級聯(lián)效應的C1q蛋白。然后NK細胞和補體可激活強大的靶向內(nèi)皮細胞的溶細胞反應。
顯然，α1-24和治療劑的上述組合也將有益于治療依賴于血管生成的其它病癥/疾病。例如，新生血管性青光眼、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病和糖尿病性視網(wǎng)膜病。
而在另一備選治療方法中，所述基因治療載體包括編碼增強α1-24抗血管生成效應的藥劑的核酸，因此同時提供了編碼該藥劑的核酸和所述編碼含α1-24的多肽的核酸。
而根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了包含α1-24的顯象劑。
本領域熟練技術(shù)人員明了，可以利用包含α1-24的多肽將顯象劑靶向如腫瘤以確定發(fā)展中的腫瘤或監(jiān)測抑制腫瘤生長的治療效果。而且，顯而易見的是，包含α1-24且還包含其它抗血管生成劑的聯(lián)合治療組合物也可與顯象劑結(jié)合以監(jiān)測聯(lián)合治療組合物的分布和/或監(jiān)測所述的聯(lián)合組合物的功效。
用于檢測顯象劑的方法在本領域內(nèi)是熟知的，包括但不限于FI8和C11化合物的正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)檢測。
現(xiàn)在將僅通過實施例并參考下圖描述本發(fā)明的實施方案

圖1顯示纖維蛋白原E的α-β-γ-多肽的核酸和氨基酸序列；圖2比較了纖維蛋白原E片段(A圖)和纖維蛋白E片段(B圖)對體外HuDMEC引起的細管形成的影響。其中顯示了缺乏(空白條)或存在(有色條)VEGF或bFGF時細管形成所覆蓋的平均(±SEM)面積。每個試驗條件在三個重復孔內(nèi)進行，每個孔在三個隨機挑選的視野內(nèi)測量總面積(n＝9)。*與相應的對照組相比p＜0.005；圖3表示的示意圖顯示了抗血管生成纖維蛋白原E片段(A)和促血管生成纖維蛋白E片段(B)之間的結(jié)構(gòu)差異。唯一的差異為存在(纖維蛋白原E-片段)或不存在(纖維蛋白E-片段)16個氨基酸的纖維蛋白肽A；圖4顯示了在缺乏或存在VEGF或bFGF時，α1-24(β-轉(zhuǎn)角)在體外對SVEC4-10細胞引起的細管形成的影響。上圖(A)缺乏外源性因子(對照)(I)，或存在100nMα1-24(II)、10ng/ml VEGF(III)或10ng/mlVEGF+100nMα1-24時，在減少GF的Matrigel試驗中的細管形成(×40物鏡)。下圖(B)在缺乏(空白條)或存在(陰影條)VEGF或bFGF時，細管形成的平均(±SEM)面積。n＝9，*與相應的對照組相比p＜0.03；圖5A為編碼α1-24肽的核酸序列；圖5B為α1-24肽的線性氨基酸序列和各種修飾的α1-24肽的氨基酸序列；圖6說明未修飾的α1-24肽對小鼠的腫瘤生長的體內(nèi)效應。每日注射(腹膜內(nèi))25μg/kg溶于PBS的α1-24肽或僅注射PBS(對照)對CT26腫瘤在Balb/c小鼠中的生長的影響，(數(shù)據(jù)來自兩次單獨的實驗)；圖7比較了23位精氨酸的丙氨酸替換物(R23A)、α1-24對照肽和截短的α1-24(第17-24位氨基酸)的抗血管生成活性；圖8表示丙氨酸替換的α1-24肽(G4A、G6A、G17A)的抗血管生成活性；圖9表示丙氨酸替換的α1-24肽(D7A和R19)和(R16A)的抗血管生成活性；圖10表示末端修飾(乙酰化和酰胺化)的α1-24肽的抗血管生成活性。末端修飾(TMa)對α1-24肽在HuDMEC引起的體外細管形成中的抑制效應(存在或不存在10ng/ml VEGF)的影響；和圖11表示更大濃度范圍的α1-24肽對HuDMEC引起的體外細管形成的影響(存在或不存在10ng/ml VEGF)。
材料和方法成人皮膚微血管內(nèi)皮細胞(HuDMEC)來自市售(TCS Biologicals，Buckinghamshire，英國)并培養(yǎng)于含肝素(10ng/ml)、氫化可的松、人表皮生長因子(10ng/ml)、人成纖維細胞生長因子(10ng/ml)(此類內(nèi)皮生長因子對于HuDMEC在培養(yǎng)中的常規(guī)傳代是必需的)和雙丁酰環(huán)AMP的微血管內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(EGM)中。對其補充5％熱滅活的FCS，50μg/ml慶大霉素和50ng/ml兩性霉素B(TCS Biologicals，英國)。鼠內(nèi)皮細胞(SVEC4-10)從ATCC獲得，且培養(yǎng)在DMEM+10％FCS中。細胞在具5％CO2氣相的100％潮濕的培養(yǎng)箱中37℃生長，并常規(guī)甄別支原體。在用于下列測試前，HuDMECs生長至80％匯合，在DMEM+1％FCS中培養(yǎng)2h，然后用0.05％胰蛋白酶溶液收獲，洗滌兩次并以各試驗所需的細胞密度重懸(見以下)。
蛋白質(zhì)和肽人纖維蛋白原(Fgn)E-片段購自Diagnostica Stago，Asnieres，法國。該產(chǎn)品通過纖溶酶切割纖維蛋白原產(chǎn)生，并通過電泳、免疫電泳、離子交換和凝膠過濾進行純化。為產(chǎn)生人纖維蛋白(Fn)E-片段，如已前所述(10)用人凝血酶(Sigma-Aldrich Co，Dorset，英國)消化纖維蛋白原E-片段。為了控制FnE片段制品中痕量凝血酶對我們的測試實驗的可能影響，向使用FnE-片段的實驗中所用的對照培養(yǎng)基中加入相同量的凝血酶(0.5U/ml)。HPLC-純化的FpA購自Bachem Ltd，Saffron Walden，UK。在研究中包括該肽是因為該肽在FnE生產(chǎn)中從Fgn E-片段上切下，并將以痕量存在于試驗中。β-轉(zhuǎn)角(α1-24)應用FMOC氨基酸和合成機器通過標準的肽合成方法產(chǎn)生。肽的純度由質(zhì)譜法確認。
細管(tubule)形成試驗用30μl/孔減少生長因子的(減少GF的)Matrigel(Becton DickinsonLabware，Bedford，MA)包被24孔板。鋪于該基質(zhì)上的內(nèi)皮細胞如先前(14)描述的那樣在鋪板的6h內(nèi)遷移并分化為細管。HuDMECs或SVEC4-10細胞以4×104個細胞/ml的密度接種，在存在或缺乏纖維蛋白原E-片段、纖維蛋白E-片段、FpA或α1-24時，于500μl僅DMEM+1％FCS(對照)，或該培養(yǎng)基±10ng/ml VEGF或bFGF中孵育6h。細管形成的評估涉及到將細胞制備物在70％乙醇中，于4℃固定15分鐘，在PBS中漂洗，并用蘇木精和伊紅染色。對每個試驗條件，在低倍鏡下(×40放大)觀察3個重復孔中的三個隨機視野，并用與奔騰III計算機相連的富士數(shù)碼相機(包含幀接收板)捕捉彩色影像。用Scion Image提供的圖像分析軟件通過計數(shù)每一視野中的細管分支數(shù)和細管覆蓋的總面積來評定細管形成。
遷移試驗對博伊登室(Boyden chamber)技術(shù)(13)進行適當修改并用于評估HuDMEC沿VEGF(10ng/ml)或bFGF(10ng/ml)濃度梯度跨多孔膜的遷移。使用Neuro Probe 48孔微趨化室(Neuro Probe Inc，Cabin John，MD)和包被有100μg/ml IV型膠原的8μm孔徑的聚碳酸酯膜(Neuro Probe Inc，Cabin John，MD)。將10ng/ml VEGF或bFGE單獨或與不同濃度的纖維蛋白原E-片段、纖維蛋白E-片段、FpA或α1-24溶于DMEM+1％FCS，并置于較下的孔中。然后將膠原包被的膜置于其上，并在較上的室中加入50μl 25×104個HuDMECs/ml(在含1％FCS的DMEM中)。然后將這些室37℃孵育4.5h。然后拆卸這些室，取出膜，將未遷移細胞從上表面刮下。下表面上的遷移細胞用甲醇固定，用Hema‘Gurr’快染試劑盒(Merck，Leics，英國)染色，并用光學顯微鏡(×160放大)對每孔3個隨機視野中的細胞計數(shù)。每一試驗條件進行3-6個重復孔，且每一實驗重復三次。
增殖試驗.
如以前所述(12)用MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓)測試法評估在缺乏或存在纖維蛋白原E-片段、纖維蛋白E-片段、FpA或α1-24時VEGF或bFGF誘導的HuDMEC增殖。HuDMEC以3×103個細胞/100μl接種在96孔微滴定板的DMEM+1％FCS±10ng/mlVEGF或bFGF試驗溶液中，放置4.5和6h。在這些時間點上，向每孔加入四分之一體積的MTT溶液(2mg MTT/ml PBS)，并將每塊板37℃孵育4h，產(chǎn)生不溶的紫色甲產(chǎn)物。將培養(yǎng)基吸出并將沉淀物在pH10.5下溶于100μl DMSO緩沖液。然后在Dynex ELISA板讀取儀上于540nm處讀取光吸收值。
細胞毒性試驗在缺乏或存在纖維蛋白原E-片段、纖維蛋白E-片段、FpA或α1-24時，將HuDMEC以每孔1-2×105個細胞的密度接種于24孔板中。6h后，收獲活的(通過胰蛋白酶消化脫落后)和死的(漂浮的)細胞，對每次處理的三重樣品中的每一個樣品，所存在的全部細胞的細胞成活力使用碘化丙錠對5000個細胞染色，用配備有15mW藍色激光激發(fā)器的FACScan(BectonDickinson)在488nm處評估。收集數(shù)據(jù)并用Cell Quest軟件(BectonDickinson)分析。
α1-24肽的體內(nèi)功效實驗用體重為15g的六周齡Balb/C小鼠進行，小鼠購自Sheffield FieldLaboratories。所有實驗均得到Home Office Project Licence NumberPPL50/1414批準。
腫瘤細胞培養(yǎng)CT26細胞系在含10％胎牛血清、1％青霉素和鏈霉素的Dulbecco′s極限Eagles培養(yǎng)基中體外傳代維持，并于37℃維持在含5％CO2的潮濕空氣中。常規(guī)檢查細胞系以確保其無支原體(支原體快速檢測系統(tǒng)，Gena-ProbeIncorporated，美國)。
皮下腫瘤植入動物通過腹腔內(nèi)注射1∶1比例的安定(0.5mg/ml，Dumex Ltd.)和hypnorm(檸檬酸芬太尼0.0315mg/ml和氟丁酰酮1mg/ml，JanssenPharmaceutical Ltd.)麻醉，注射體積為0.1ml/200g體重，需要時進行補充以維持足夠的麻醉。首次用于實驗的Balb/c小鼠去毛后，右側(cè)面皮下免疫。腫瘤細胞的注射濃度為每個動物注射懸浮在100μl無血清培養(yǎng)基中的3×105個活CT26細胞。然后使動物恢復。每天監(jiān)測腫瘤生長和動物體重。
肽α1-24的施用每日測定腫瘤生長，當該群動物中的大多數(shù)動物的腫瘤體積＞100mm3且＜350mm3時，將動物分成實驗組和對照組。這在植入腫瘤細胞懸液后的14至18天之間發(fā)生。然后給動物腹腔內(nèi)(i.p.)注射活性藥物(α1-24肽100mM；100μl)或賦形劑(磷酸緩沖鹽水，100μl)。繼續(xù)每日注射，直至對照動物的腫瘤生長達到Home Office法規(guī)允許的最大荷載量。
腫瘤生長的評估通過卡尺測定垂直直徑并用下列等式估計體積來評價腫瘤體積體積＝(a2×b)/2其中a為較小的直徑，b為較大的直徑。
每日稱量動物體重，并監(jiān)測總體健康狀況。
統(tǒng)計分析所有實驗至少進行三次，并使用Mann-Whitney U檢驗分析數(shù)據(jù)，其中所述Mann-Whitney U檢驗是不設定所分析的數(shù)據(jù)為高斯分布的非參數(shù)檢驗。認為P≤0.05為具顯著性。
可觀察到在缺乏外源刺激時GF減少的Matrigel中內(nèi)皮細胞延伸并開始形成細管，但應當指出在此基質(zhì)中存在殘余水平的生長因子。該試驗因此用作分化(血管生成路徑中的主要步驟之一)模型。隨后的細管形成通過細管所覆蓋的面積來測量，但分支的數(shù)目產(chǎn)生類似的圖形(數(shù)據(jù)未顯示)。在此試驗系統(tǒng)內(nèi)向培養(yǎng)基中加入VEGF(10ng/ml)或bFGF(10ng/ml)時，此分化活動顯著增強(p＜0.001)。向此系統(tǒng)中加入α1-24(β-轉(zhuǎn)角)顯著(p＜0.03)降低了存在或不存在生長因子時的細管形成，如在圖4中所示。
從圖4中顯示的結(jié)果可得出結(jié)論，肽α1-24含有纖維蛋白原E-片段的活性部位。與具有更復雜的多肽結(jié)構(gòu)的纖維蛋白原E-片段相比，24氨基酸的肽可能具有更大的治療用途，因為前者的制備需剪切源于血液的纖維蛋白原。相比而言，α1-24為較小的肽，可通過合成或重組技術(shù)制備。將其用作基因治療方案的一部分以治療癌癥或其他依賴血管生成的疾病也是可能的。我們因此測定了α1-24肽的體內(nèi)功效。
α1-24肽的體內(nèi)功效實施例1實驗動物(n＝6)每日腹腔內(nèi)施用α1-24且對照動物(n＝7)腹腔內(nèi)施用賦形劑。腫瘤的初始體積在兩組動物中相似(實驗組/對照組，235±30mm3/198±28mm3)。對照組的腫瘤在14天中繼續(xù)以穩(wěn)定的速率生長，并達到終腫瘤體積2245±371mm3。相反，實驗組動物的腫瘤在第4天前以相似的速率生長，此后生長減慢。繼而在第7天繼續(xù)以和對照組相似的速率生長，但具有較小的體積。到第10天時腫瘤生長再次穩(wěn)定直到第14天，腫瘤的終體積為1341±145mm3(p＜0.001)。
實施例2實驗組動物(n＝7)每日腹腔內(nèi)施用α1-24，且對照組動物(n＝7)腹腔內(nèi)施用賦形劑。腫瘤的初始體積在兩組動物中相似(實驗組/對照組，338±39mm3/300±65mm3)。對照組的腫瘤在12天中持續(xù)以穩(wěn)定的速率生長，并達到終腫瘤體積3072±225mm3。相反，實驗組動物的腫瘤以和對照組相似的速率生長至第7天，然后腫瘤穩(wěn)定生長直到第12天處死動物時，腫瘤的終體積為2029±504mm3(p＜0.001)。
該數(shù)據(jù)(見圖6)由此顯示了肽α1-24作為體內(nèi)抗血管生成劑的潛力。此外，α1-24的肽變體顯示了與未修飾的α1-24相似的抑制活性，見圖7-9。而且，α1-24的乙?；王０坊揎棽挥绊懣寡苌勺饔谩?br> 參考文獻1.Folkman J，癌、血管性、類風濕性疾病和其它疾病中的血管生成。自然醫(yī)學(Nature Medicine)，127-31，1995。
2.Leek R，Harris AL和Lewis CE，人實體瘤中的細胞因子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)血管生成。J.Leuk.Biol.，56423-35，1994。
3.Cao Y，內(nèi)源性血管生成抑制劑制管張素、內(nèi)皮抑素和其它蛋白水解片段。Prog Mol Subcell Biol.，20161-76，1998。
4.Doolittle R，纖維蛋白原和纖維蛋白?？茖W美國人(ScientificAmerican)，24592-101，1981。
5.Costantini V，Zacharski LR，Memoli VA，Kisiel W，Kudryk BJ和Rousseau SM，在原代人乳腺癌組織中無凝血酶產(chǎn)生的纖維蛋白原沉積作用。癌研究(Cancer Res.)，51349-53，1991。
6.Dvorak HF，Nagy JA，F(xiàn)eng D，Brown LF和Dvorak AM，血管通透因子/血管內(nèi)皮生長因子以及微血管通透性過高在血管生成中的重要性。微生物免疫學的最新專題(Curr Top Microbiol Immunol)，23797-132，1999。
7.Thompson WD，Wnag JEH，Wilson SJ和Ganesalingham N，人乳癌中的血管生成和纖維蛋白降解。血管生成分子生物學，臨床方面(AngiogenesisMolecular Biology，Clinical Aspects)，245-251，1994。
8.Thompson WD，Smith EB，Stirk CM，Marshall FI，Stout AJ和Kocchar A，纖維蛋白降解產(chǎn)物的生血管活性位于纖維蛋白片段E內(nèi)。J.Pathol，16847-53，1992。
9.Malinda KM，Ponce L，Kleinman HK，Shackelton LM和Millis AJ，一種由血管平滑肌細胞合成的蛋白質(zhì)Gp38k刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞的方向性遷移。實驗細胞研究(Exp Cell Res)250168-73，1999。
10.Shen J，Ham RG，Karmiol S，在培養(yǎng)的人肺微血管內(nèi)皮細胞中粘附分子的表達。微血管研究(Microvasc Res.)，50360-72，1995。
11.Liu J，Kolath J，Anderson J，Kolar C，Lawson TA，Talmadge J和Gmeiner WH，5-FU和FdUMP[10]在抑制人結(jié)腸腫瘤細胞增殖中的正相互作用。反義核酸藥物研發(fā)(Antisense Nucleic Acid Drug Dev.)，9(5)481-6，1999。
12.Dejano E，Languino LR，Polentarutti N，Balconi G，Ryckewaert JJ，Larrieu MJ，Donati MB，Mantovani A和Marguerie G，纖維蛋白原和培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞間的相互作用。臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)，7511-18，1985。
13.Bootle-Wilbraham CA，Tazzyman S，Marshall JM，Lewis CE.纖維蛋白原E片段體外抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細胞的遷移和細管形成。癌癥研究(Cancer Research)(2000)604719-4724。
14.Marsh HC，Meinwald YC，Lee S，Martinelli RA，Scheraga HA.凝血酶對纖維蛋白原的作用機制在纖維蛋白原AαGly(P5)-Gly(P4)位置或其附近的β-轉(zhuǎn)角的NMR證據(jù)，生物化學(Biochemistry)(1985)242806-2812。
權(quán)利要求
1.一種多肽，其包含選自以下的氨基酸序列i)肽序列A D SXEX XF L A E G G G VX XPXV V EXH其中X為任意的氨基酸殘基；ii)(i)中所述的肽，其中氨基酸殘基X選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸；和iii)(i)或(ii)中所述的肽，其具有抗血管生成活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含選自以下的一段氨基酸序列A D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V E R HA D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V EXHA D S G E G D F L A E G G G V R G PXV V E R HA D S G E G D F L A E G G G V RXP R V V E R HA D S G E G D F L A E G G G VXG P R V V E R HA D S G E GXF L A E G G G V R G P R V V E R HA D S G EXD F L A E G G G V R G P R V V E R HA D SXE G D F L A E G G G V R G P R V V E R HA D SXEXD F L A E G G G V RXP R V V E R HA D S G E GXF L A E G G G V R G PXV V E R H
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其中X為丙氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽包含序列A D S G E G D F L A E G G G V R G P R V V E R H.
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項的多肽，其中多肽的長度為至少24個氨基酸殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項的多肽，其中多肽為所述24氨基酸多肽的活性片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，其中多肽由氨基酸序列ADSGEGDFLAEGGGVRGPRVVERH組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項的多肽，其中多肽被乙酰化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的多肽，其中該乙?；挥谒龆嚯牡陌被恕?br> 10.根據(jù)權(quán)利要求9的多肽，其中α1-24肽氨基端的丙氨酸被乙?；?br> 11.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項的多肽，其中該多肽被酰胺化。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的多肽，其中該酰胺化位于所述多肽的羧基端。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的多肽，其中α1-24肽羧基端的組氨酸被酰胺化。
14.根據(jù)權(quán)利要求8-13中任意一項的多肽，其中該多肽通過乙?；王０坊M行修飾。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的多肽，其中該乙酰化位于α1-24肽氨基端的丙氨酸上，且該酰胺化位于α1-24肽羧基端的組氨酸上。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任意一項的多肽，其中該多肽進行環(huán)化修飾。
17.一種核酸分子，其包含選自以下的DNA序列i)如圖6中所示的DNA序列；ii)已通過在至少一個密碼子中加入、缺失或替換至少一個核苷酸堿基而進行了修飾的如圖6中所示的DNA序列，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項的多肽。iii)與圖6中所示編碼具有抗血管生成活性的肽的序列雜交的DNA序列；和iv)由于遺傳密碼的原因與(i)、(ii)或(iii)中定義的DNA序列簡并的DNA序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的核酸分子，其中該核酸分子在嚴格的雜交條件下退火。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的核酸分子，其中嚴格的雜交條件包括4-6xSSPE、5-10xDenhardts溶液、100μg-1.0mg/ml超聲的鮭魚/鯡魚DNA、0.1-1.0％十二烷基硫酸鈉、40-60％去離子甲酰胺，和42℃-65℃的溫度。
20.包含至少一種α1-24肽或其部分的藥物組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物，其由至少一種圖5B中所顯示的氨基酸序列表示的α1-24肽組成。
22.包含至少一種α1-24肽以及還包含至少一種化療劑的藥物組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所述化療劑選自新制癌素；順鉑；碳鉑；環(huán)磷酰胺；苯丙氨酸氮芥；卡氮芥；氨甲蝶呤；5-氟尿嘧啶；阿糖胞苷；巰基嘌呤；道諾霉素；阿霉素；表阿霉素；長春堿；長春新堿；放線菌素D；絲裂霉素C；紫杉酚；L-天冬酰胺酶；G-CSF；enediyne如chalicheamicin或埃斯波霉素；苯丁酸氮芥；ARA-C；長春堿酰胺；博來霉素和表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷。
24.含α1-24肽或其部分的多肽在制備用于癌癥治療的藥劑中的用途。
25.一種載體，其包括編碼含有α1-24肽或其部分的多肽的核酸分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的載體，其中該載體為原核表達載體。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的載體，其中該載體為真核表達載體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的載體，其中該載體為基因治療載體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的載體，其中該基因治療載體為基于選自以下的病毒的載體腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、慢病毒、痘苗病毒和桿狀病毒。
30.一種細胞，其已用根據(jù)權(quán)利要求17-19中任意一項的核酸或根據(jù)權(quán)利要求25-29中任意一項的載體進行了轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
31.用于制備含有α1-24的多肽的方法，包括i)提供根據(jù)權(quán)利要求30的細胞；ii)提供有利于產(chǎn)生含α1-24的多肽的條件；和iii)從細胞或細胞培養(yǎng)環(huán)境中純化該多肽。
32.非人轉(zhuǎn)基因動物，其特征在于所述動物的基因組中摻入了編碼含有α1-24的多肽的核酸分子。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中轉(zhuǎn)基因為人源的。
34.治療動物的方法，其中所述動物將受益于對血管生成的抑制，所述方法包括i)向待治療的動物施用有效量的含有α1-24的藥劑；ii)監(jiān)測該藥劑抑制血管生成的效果。
35.治療動物的方法，其中所述動物將受益于對血管生成的抑制，所述方法包括i)向待治療的動物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求20或21的藥物組合物；ii)監(jiān)測所述組合物抑制血管生成的效果。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或35的方法，其中包含α1-24肽的多肽與化療劑綴合、結(jié)合或交聯(lián)。
37.治療動物的方法，其中所述動物將受益于對血管生成的抑制，所述方法包括i)施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求17-19中任意一項的核酸或根據(jù)權(quán)利要求28或29的載體；和ii)監(jiān)測(i)中核酸的轉(zhuǎn)染對血管生成的抑制作用。
38.根據(jù)權(quán)利要求34-37中任意一項的方法，其中所述治療為抑制腫瘤的血管生成。
39.根據(jù)權(quán)利要求34-38中任意一項的方法，其中所述動物為人。
40.一種顯象劑，其含有與可檢測標簽綴合、偶聯(lián)、結(jié)合或交聯(lián)的α1-24多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自纖維蛋白原的抗血管生成的肽；包含該肽的藥物組合物；編碼該肽的核酸和治療患病動物(優(yōu)選人)的方法，其中所述動物將受益于對血管生成的抑制。
文檔編號A61K31/7068GK1592755SQ01816683
公開日2005年3月9日 申請日期2001年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月1日
發(fā)明者C·斯塔頓, C·劉易斯, J·魯濱遜 申請人:生物活性有限公司