細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因LcCIF及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因 ZcC//及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胚乳在被子植物種子中普遍存在。胚乳的發(fā)育是種胚發(fā)育的一個重要的組成，受 精的極核不經(jīng)過休眠，就開始進(jìn)行有絲分裂，經(jīng)過多次分裂形成大量的胚乳細(xì)胞。胚乳主要 的功能是為發(fā)育中的胚提供萱羞。荔枝開花授粉后3天，切片可見精細(xì)胞的融合，花后6天， 已有少量的胚乳(游離核)存在，在花后20~30天，胚囊內(nèi)胚乳已經(jīng)十分豐富，至花后50天 左右，胚乳細(xì)胞已全部被吸收。有研究認(rèn)為胚乳的發(fā)育直接影響到胚的發(fā)育進(jìn)程，胚乳富含 各種激素使種子成為代謝中心，吸引養(yǎng)份供本身和果實的其他部分生長發(fā)育之用所以胚乳 的發(fā)育對胚發(fā)育影響很大。
[0003] 本研究發(fā)現(xiàn)不同種子發(fā)育類型的荔枝品種液態(tài)胚乳的含量明顯不同，完全敗育型 的"糯米糍"液態(tài)胚乳量極少，可見液態(tài)胚乳的發(fā)育受阻可能是"糯米糍"敗育的主要原因； 相對其他荔枝品種來說，坐果低而且不穩(wěn)是糯米糍生產(chǎn)上的一個突出問題，嚴(yán)重影響了該 品種的產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。一般荔枝的坐果率達(dá)不到雌花數(shù)量的5%，而糯米糍的更低。最主 要的原因是糯米糍果實在發(fā)育的早期胚乳敗育使得坐果不良，現(xiàn)有技術(shù)對于糯米糍早期胚 乳敗育的分子機制研究不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種細(xì)胞壁酸 性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/F。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述基因的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的： 一種細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/F，其核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0007] 本發(fā)明還提供所述細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/7編碼的蛋白，其氨基酸序 列如SEQIDN0 :2所示。
[0008] 細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶活性的蛋白質(zhì)，屬于果膠 甲酯酶抑制子超基因家族，它可以在PH4. 5的條件下，緊密的與細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶活性位 點結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶無法與蔗糖結(jié)合，從而失去催化活性。
[0009] 本發(fā)明還提供用于擴增所述荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/7柏引物，其 引物序列如SEQIDN0 :3~4所示。
[0010] 本發(fā)明還提供含有權(quán)利要求1所述細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/7柏表達(dá)載 體。
[0011] 本發(fā)明還提供所述基因或所述表達(dá)載體在提高荔枝坐果率方面的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還提供所述基因或所述表達(dá)載體在制備提尚森枝坐果率的制劑方面的應(yīng) 用。
[0013] 優(yōu)選地，所述荔枝為糯米糍。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明首次克隆出細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/F，該抑制子可與細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn) 化酶相結(jié)合使其失去活性，通過短期沉默細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子提高細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶 活性，促進(jìn)液態(tài)胚乳早期發(fā)育，可用于提高糯米糍荔枝的坐果率，在生產(chǎn)上有這廣泛的應(yīng)用 前景。
【附圖說明】
[0015]圖1為部分荔枝組織RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道1~4為荔枝葉片 樣品，泳道5~8為蒸枝種皮樣品，泳道9~12為蒸枝種柄樣品，泳道13~14為蒸枝花的 樣品，泳道15~16為荔枝種仁樣品。
[0016] 圖2為ZcC/7氨基酸序列與其他物種同源性比對。
[0017] 圖3為TRV1 (a)和TRV2 (b)結(jié)構(gòu)示意圖；其中，RdRP為RNA依賴的RNA聚合酶； 16K為富含半胱氨酸的16kDa蛋白；Mp為運動蛋白；Cp為衣殼蛋白；MCS為多克隆位點。
[0018] 圖4為抑制子基因沉默處理后對糯米糍荔枝種胚的影響。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的常規(guī)手段。
[0020] 實施例1荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因的克隆 一、荔枝樣品RNA的提取以及質(zhì)量檢測 采用華越洋超快型RNA提取試劑盒(具體方法參照說明書）對"妃子笑"、"黑葉"和"糯 米糍"荔枝的葉片、花、果皮、果蒂、種皮、種仁等組織的RNA進(jìn)行提取，RNA的濃度用紫外核 酸蛋白檢測儀，取1μ1測定260nm與280nm的比值，若介于1. 80~2. 00之間則可以進(jìn) 行下一步實驗。如果RNA濃度較高，可以稀釋一定倍數(shù)后檢測。
[0021] 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1，可以看出RNA呈現(xiàn)出清晰的28S和18S兩條帶， 并且28S的亮度是18S的兩倍左右，沒有拖尾現(xiàn)象，無DNA污染。表明提取的RNA質(zhì)量比較 高，無明顯降解，滿足后續(xù)實驗的需要。
[0022] 二、細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因的克隆 根據(jù)荔枝基因組測序結(jié)果，調(diào)出所有有關(guān)果膠甲酯酶超級因家族的注釋基因，對擬 南芥細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶以及煙草的細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶的復(fù)合物晶體模型，與果膠甲酯酶 抑制子與果膠甲酯酶復(fù)合物的晶體模型對比發(fā)現(xiàn)，雖然兩種抑制子均屬于同一個超基因 家族，又均是對底物的活性位點進(jìn)行抑制，但是因為底物酶的活性位點不同，所以兩種抑 制子在活性位點上也有著很大的區(qū)別，根據(jù)與其他物種的比較，酸性轉(zhuǎn)化酶的抑制子一般 都包含有GXPKFXE這樣一個活性位點，根據(jù)這一點在荔枝的果膠甲酯酶超基因家族中比 對，發(fā)現(xiàn)三個具有這樣位點的基因。而又對三個基因進(jìn)行預(yù)測分析，只發(fā)現(xiàn)一個Litchi_ GLEAN_10013696是具有信號肽，并且定位于細(xì)胞外的（圖2)。通過荔枝基因組數(shù)據(jù)庫上Litchi_GLEAN_10013696的序列進(jìn)行設(shè)計全長引物，對其全長進(jìn)行克隆，最終得到477bp的 荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶的抑制子，命名為LcCIF，其基因序列如SEQIDNO:1所示，編碼的 蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，它與煙草的細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子的同源性達(dá)到 38% (擬南芥的抑制子基因與煙草的同源性為41%)，與數(shù)據(jù)庫比對，未發(fā)現(xiàn)差異。
[0023] 實施例2荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因的功能驗證 一、ZcC/7基因片段的克隆 以荔枝勺500bp左右片段設(shè)計引物，并在引物前加上與pTRV2的及mHI和 酶切位點同源的15bp的載體序列接頭，引物序列見下表1，PCR擴增條件為94°C，2min; 98°(：，1〇8,55°(：，3〇8,72°(：，3〇8,30個循環(huán)；72°(：，1〇1^11。取2以1進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢 測，并純化回收。
[0024] 二、病毒沉默載體pTRV2 (pYL156)的酶切 病毒沉默載體pTRVl(pYL192)，pTRV2 (pYL156