一種提高有機(jī)相中游離脂肪酶催化拆分性能的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于非水相脂肪酶催化手性拆分技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用膽汁酸鹽誘 導(dǎo)活化脂肪酶，提高有機(jī)相中游離脂肪酶催化拆分性能的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶是生物型催化劑，在催化拆分過程中表現(xiàn)出優(yōu)良的立體特異性，然而脂肪 酶活性區(qū)域含有"蓋子"結(jié)構(gòu)，因此隨著脂肪酶周圍環(huán)境的變化，其"蓋子"將發(fā)生不同程度 的張閉，運(yùn)將在一定程度下改變脂肪酶催化性能。
[0003] 此前，有研究者利用脂肪酶"蓋子"特征，采用各種表面活性劑進(jìn)行脂肪酶活性中 屯、誘導(dǎo)活化，增強(qiáng)脂肪酶催化活性。如化rnando等人利用表面活性劑Tritonx-100刺激BTL2 脂肪酶活性部位，使其構(gòu)象發(fā)生明顯變化。Borgstrom等人分析不同帶電性表面活性劑對膜 脂肪酶水解活性的影響，其研究表明：在低濃度陽離子及非離子型表面活性劑濃度下，脂肪 酶催化活性就已受到抑制；而陰離子表面活性劑其抑制范圍將變寬，運(yùn)對研究不同離子型 表面活性劑影響脂肪酶的催化具有深遠(yuǎn)意義。膽汁鹽作為醬醇族陰離子型生物表面活性 劑，在哺乳動物生命活動中能夠輔助膜脂肪酶對脂類的消化吸收。國外學(xué)者模擬人體內(nèi)膽 汁鹽作用脂肪酶催化機(jī)理，報(bào)道了許多關(guān)于在體外油/水界面膽汁鹽誘導(dǎo)脂肪酶構(gòu)象變化， "蓋子"張開提高脂肪酶水解活性的研究。
[0004] 近來，隨著非水相酶學(xué)的不斷深入與發(fā)展，彌補(bǔ)了因在水相中與有機(jī)底物接觸面 積的減少而導(dǎo)致催化性不高的缺陷，脂肪酶在有機(jī)相中能夠進(jìn)行醋交換與轉(zhuǎn)醋化反應(yīng)催化 拆分外消旋有機(jī)化合物，提高了酶在醫(yī)藥中間體等許多化合物的生產(chǎn)價值，如芳香醋、生物 柴油、手性化合物的合成。而對于生物型表面活性劑膽汁鹽作用于提高非水相介質(zhì)中脂肪 酶催化拆分效率少有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用膽汁酸鹽誘導(dǎo)脂肪酶構(gòu)象變化，提高 脂肪酶在非水相中催化手性醇類化合物拆分性能的方法。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種提高有機(jī)相中游離脂肪酶催 化拆分性能的方法，包括W下步驟：
[0007] S1，稱取催化量的脂肪酶放置于膽汁酸鹽的緩沖溶液中；
[0008] S2,將步驟S1得到的混合溶液混合均勻后，進(jìn)行真空冷凍干燥，并娠碎成粉末；
[0009] S3,將步驟S2制得的固體粉末與有機(jī)溶劑、手性醇W及乙酸乙締醋或乙酸異丙締 醋混合并反應(yīng)；
[0010] S4,反應(yīng)結(jié)束后，稀釋反應(yīng)液并用高效液相色譜儀檢測R型和S型手性醇醋的生成 量，確定膽汁酸鹽處理后的脂肪酶的手性拆分活性。
[0011] 在步驟S1中，可配置不同濃度梯度的膽汁酸鹽緩沖溶液，將催化量的脂肪酶依次 加入不同濃度梯度的膽汁酸鹽緩沖溶液中，并利用步驟S4依次測定不同濃度梯度的膽汁酸 鹽與脂肪酶作用后的脂肪酶催化拆分性能，繼而可w較好地篩選出有機(jī)相中脂肪酶催化性 能最佳的膽汁酸鹽的濃度。
[0012] 本發(fā)明利用脂肪酶催化拆分手性化合物的反應(yīng)機(jī)理如下式所示手性醇R，S-1-苯乙醇為例：在有機(jī)溶劑環(huán)己燒中，將R，S-1-苯乙醇與脂肪酶、乙酸乙締醋混合并反應(yīng)，得 到產(chǎn)物為R型乙酸苯乙醋和S型苯乙醇，將R型乙酸苯乙醋水解即可得到R型苯乙醇。
[0013]
[0014] 進(jìn)一步地，步驟S1中的膽汁酸鹽為膽酸鋼、碟去氧膽酸鋼、碟去氧膽酸鋼、石膽酸 鋼、牛橫膽酸鋼或牛橫碟去氧膽酸鋼中至少一種。其中，膽酸鋼可用縮寫符號:NaC表示;碟 去氧膽酸鋼可用縮寫符號:化DC表示;碟去氧膽酸鋼可用縮寫符號:化CDC表示;石膽酸鋼可 用縮寫符號:化LC表示；牛橫膽酸鋼可用縮寫符號:化TC表示；牛橫碟去氧膽酸鋼可用縮寫 符號：NaTDC表不。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟S1中，膽汁酸鹽緩沖溶液中膽汁酸鹽的溶度為C，0<C^ 20,單位為 mMo
[0016] 作為優(yōu)選，步驟S3中，混合物的反應(yīng)溫度為25-50°C，反應(yīng)時間為10-72小時。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟S3中的有機(jī)溶劑為T燒、戊燒、己燒、庚燒、辛燒、壬燒、癸燒、苯、甲 苯、乙苯或環(huán)己燒中的至少一種。
[0018] 作為優(yōu)選，步驟S1中的脂肪酶為膜脂肪酶，所述的膜脂肪酶為豬膜脂肪酶(P化)或 柱狀假絲酵母脂肪酶(邸L)，所述的豬膜脂肪酶(P化)或柱狀假絲酵母脂肪酶(邸L)來源于 根霉、曲霉、青霉、毛霉、假單胞菌、豬膜或牛膜中的至少一種。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟S1中的緩沖溶液為棚酸鹽緩沖溶液、巧樣酸鹽緩沖溶液、憐酸鹽緩 沖溶液或Ξ徑甲基甲燒緩沖溶液中的至少一種。
[0020] 作為優(yōu)選，本發(fā)明的底物手性醇選自：1-苯乙醇、薄荷醇、泛醇、雌馬醇、締挫醇、戊 挫醇、己挫醇或氨基醇中的任一種。
[0021] 本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0022] 1、脂肪酶是一種水溶性酶，其在有機(jī)溶劑中，溶解度低、易結(jié)塊、催化效率低，本發(fā) 明通過膽汁酸鹽預(yù)處理脂肪酶，可W較好地改善脂肪酶在有機(jī)相中的溶解度，提高脂肪酶 的催化效率。
[0023] 2、本發(fā)明通過膽汁酸鹽預(yù)處理脂肪酶，對脂肪酶活性中屯、進(jìn)行誘導(dǎo)活化，可W改 變脂肪酶的立體構(gòu)象，增強(qiáng)催化活性。
[0024] 3、本發(fā)明建立了一種在非水相中提高游離脂肪酶催化拆分外消旋化合物的方法， 實(shí)現(xiàn)了讓脂肪酶除在水環(huán)境中水解反應(yīng)外的醋交換、轉(zhuǎn)醋化等眾多其他反應(yīng)方式，充分利 用了脂肪酶作為生物催化劑的優(yōu)點(diǎn)，并且膽汁酸鹽的作用改善了脂肪酶在有機(jī)相中催化性 能不高的缺陷。同時膽汁酸鹽來源廣，價格適宜，少量酶獲取高產(chǎn)率的單一對映體生成物， 可滿足低成本、高收率的產(chǎn)業(yè)化模式生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0025] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 W根據(jù)運(yùn)些附圖獲得其他的附圖。
[0026] 圖1至圖6為6種膽汁酸鹽在不同濃度下對豬膜脂肪酶(P化）W及柱狀假絲酵母脂 肪酶(CRL)催化活性影響曲線圖。
[0027] 圖7至圖12為6種膽汁酸鹽在不同濃度下與豬膜脂肪酶(P化）W及柱狀假絲酵母脂 肪酶(CRL)作用后對對映體選擇率的影響曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，W下實(shí)施例是對本發(fā)明的解釋而 本發(fā)明并不局限于W下實(shí)施例。
[0029] 實(shí)施例1: 一種提高有機(jī)相中游離脂肪酶催化拆分性能的方法，包括W下步驟：
[0030] S1，稱取一定質(zhì)量的膽酸鋼溶于抑=7.5的憐酸鹽緩沖溶液中，配制膽酸鋼的濃度 為16mM，并將濃度為16mM的膽酸鋼緩沖溶液依次稀釋成溶度為211^、31111、411^、611^、811^的膽 酸鋼憐酸鹽緩沖溶液；
[0031] 稱取5份O.Olg的豬膜脂肪酶(P化)或柱狀假絲酵母脂肪酶(邸L)粗粉依次放置于5 個樣品瓶中，分別在5個樣品中加入5種不同濃度的膽酸鋼憐酸鹽緩沖溶液2ml;
[0032] 稱取O.Olg豬膜脂肪酶(P化)或柱狀假絲酵母脂肪酶(邸L)粗粉放置于樣品瓶中并 加入2ml憐酸鹽緩沖溶液，作為空白對照組1;
[0033] 移取2ml憐酸鹽緩沖溶液置于樣品瓶中，作為空白對照組2;
[0034] 所述的空白對照組1和空白對照組2用于作為不同濃度梯度的膽酸鋼憐酸鹽緩沖 溶液對脂肪酶活性影響的參考對照。
[003引S2,將步驟S1中5個樣品瓶中的脂肪酶和膽酸鋼憐酸緩沖溶液混合均，靜置10分 鐘，放入真空冷凍干燥機(jī)，干燥10小時至完全干燥并娠碎成粉末。
[0036] S3,將步驟S2干燥后含有粉末狀酶與膽酸鋼的樣品瓶做為反應(yīng)容器用移液管移入 2ml有機(jī)溶劑，同時加入Immol手性醇及2mmol乙酸乙締醋或2mmol乙酸異丙締醋，混合均勻， 密封置于37°C的恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)15h，轉(zhuǎn)數(shù)140-15化/min。
[0037] S4,步驟S3的反應(yīng)完成后，取出各小反應(yīng)器加入5ml有機(jī)溶劑稀釋反應(yīng)液，繼續(xù)振 蕩5min后取出靜置lOmin，吸取過濾后的反應(yīng)液0.2ml，再經(jīng)有機(jī)溶劑稀釋5倍，利用高效液 相色譜法化PLC)測定R型和S型手性醇脂的生成量，確定膽酸鋼處理后豬膜脂肪酶(P化)或 柱狀假絲酵母脂肪酶(CRL)的催化活性W及對映體的選擇率。
[0038] 本實(shí)施例1中，步驟S1所述的緩沖溶液還可W選自巧樣酸鹽緩沖溶液、棚酸鹽緩沖 溶液或Ξ徑甲基甲燒緩沖溶液中的至少一種。
[0039] 本實(shí)施例1中，步驟4中的有機(jī)溶劑為為下燒、戊燒、己燒、庚燒、辛燒、壬燒、癸燒、 苯、甲苯、乙苯、環(huán)己燒中的一種或一種w上混合。
[0040] 本實(shí)施例1中的豬膜脂肪酶(P化)或柱狀假絲酵母脂肪酶(邸L)來源于根霉、曲霉、 青霉、毛霉、假單胞菌、豬膜或牛膜中的至少一種。
[0041] 本實(shí)施例1，步驟S4中的底物手性醇優(yōu)選：1-苯乙醇