一種參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法，該方法包括采用超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)參芪扶正注射液進(jìn)行檢測(cè)，其中色譜條件包括：色譜柱：Agilent?Zorbax?Eclipse?Plus?C18，2.1mm×100mm，1.8μm；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液；采用梯度洗脫，洗脫程序如下：0~0.5min，流動(dòng)相A為95%，流動(dòng)相B為5%；0.5~10min，流動(dòng)相A為95%~75%，流動(dòng)相B為5%~25%；10~15min，流動(dòng)相A為75%~45%，流動(dòng)相B為25%~55%；15~18min，流動(dòng)相A為45%~0%，流動(dòng)相B為55%~100%；18~20min，流動(dòng)相A為0%，流動(dòng)相B為100%。
【專利說(shuō)明】一種參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥復(fù)方質(zhì)量控制是制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一。中醫(yī)理論強(qiáng)調(diào)中藥的整體效應(yīng)，重視在藥效上的協(xié)同作用，以中藥內(nèi)一、二個(gè)有效成分作為定性、定量指標(biāo)遠(yuǎn)不能有效地控制和評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量，更難以反映其安全性和有效性。中藥復(fù)方是兩味以上中藥組合應(yīng)用于疾病治療的復(fù)方制劑，其質(zhì)量控制的難度較單味中藥更甚。近年來(lái)，中藥指紋圖譜和特征指紋圖譜已廣泛應(yīng)用于質(zhì)量控制，其中中藥特征圖譜系指從中藥指紋圖譜中選取若干專屬性強(qiáng)的色譜峰或色譜峰組合組成特征指紋圖譜，通過(guò)特征指紋峰的有無(wú)及變化來(lái)監(jiān)控中藥質(zhì)量。在2010年版《中國(guó)藥典》中，特征指紋圖譜已被應(yīng)用于多種中藥中間體成分的質(zhì)量控制中。
[0003]超高效液相色譜技術(shù)(UHPLC)是色譜技術(shù)的一大突破，以超高速度、超高靈敏度、超高分離度為優(yōu)勢(shì)，利用更小的色譜柱填料技術(shù)得到了更快、更靈敏的檢測(cè)效果，在國(guó)外被廣泛利用于農(nóng)殘、藥物代謝等方面，在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用也越來(lái)越普遍。
[0004]色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)也是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種高端分析技術(shù)，其中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)是繼氣相 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)廣泛應(yīng)用后，逐漸被認(rèn)識(shí)和接受的另一種聯(lián)用技術(shù)，但由于儀器價(jià)格昂貴，還未得到廣泛應(yīng)用。液質(zhì)聯(lián)用儀采用的離子化技術(shù)，不僅能解決一些無(wú)紫外吸收成分的檢測(cè)問(wèn)題，如皂苷類成分，而且可以得到被離子化成分的精確分子量，對(duì)于成分及其結(jié)構(gòu)的鑒別和確認(rèn)提供了數(shù)據(jù)支撐。
[0005]參芪扶正注射液是中藥大輸液，具有益氣扶正的功效，用于肺脾氣虛引起的神疲乏力，少氣懶言，自汗眩暈以及肺癌、胃癌見(jiàn)上述證候者的輔助治療，為國(guó)家中藥保護(hù)品種，保護(hù)品種號(hào):ZYB2072004073。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，【指紋圖譜】項(xiàng)采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器檢測(cè)，有一定的局限性，如占主要含量的皂苷類成分在紫外無(wú)吸收，通過(guò)增加高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，可以對(duì)皂苷類成分進(jìn)行監(jiān)控，但樣品前處理復(fù)雜，分析時(shí)間也很長(zhǎng)，均不能全面、快捷地對(duì)其主要成分進(jìn)行監(jiān)控，有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是彌補(bǔ)已有技術(shù)的不足，目的在于提供一種參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法。由此方法建立的指紋圖譜可以作為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，能夠應(yīng)用于鑒別參芪扶正注射液。
[0007]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
[0008]一種參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法，該方法包括采用超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，例如超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)參芪扶正注射液進(jìn)行檢測(cè)，其中色譜條件包括:[0009]色譜柱:AgilentZorbax Eclipse Plus C18, 2.1mmX 100mm, 1.8 μ m ;
[0010]流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.1%體積的甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%體積的甲酸乙腈溶液；
[0011]采用梯度洗脫，洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比:
[0012](T0.5min,流動(dòng)相A為95%，流動(dòng)相B為5% ；
[0013]0.5?lOmin，流動(dòng)相A為95%?75%，流動(dòng)相B為5%?25% ；
[0014]l(Tl5min，流動(dòng)相 A 為 75%?45%，流動(dòng)相 B 為 25%?55% ；
[0015]15?18min，流動(dòng)相A為45%?0%，流動(dòng)相B為55%?100%。
[0016]18?20min，流動(dòng)相A為0%，流動(dòng)相B為100%。
[0017]優(yōu)選地，所述色譜條件還包括:
[0018]流速為0.35ml/min ；
[0019]柱溫為40 O;
[0020]進(jìn)樣量為5 μ I。
[0021]優(yōu)選地,上述參苗扶正注射液指紋圖譜的建立方法中,質(zhì)譜的條件包括:
[0022]離子源為ESI源，負(fù)離子方式檢測(cè)；
[0023]霧化氣壓力:35psig ；
[0024]干燥氣溫度:350°C ；
[0025]干燥氣流速:10L/min ;
[0026]毛細(xì)管電壓:3500V;
[0027]毛細(xì)管出口電壓:135V。
[0028]優(yōu)選地，上述參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法還包括通過(guò)以下步驟制備對(duì)照品溶液:取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品、黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ml各含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.004mg、黃芪甲苷0.006mg的溶液，即得。
[0029]優(yōu)選地，上述參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法還包括通過(guò)以下步驟制備供試品溶液:取參芪扶正注射液，用0.22um微孔濾膜濾過(guò)，即得。
[0030]優(yōu)選地，上述參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法包括如下步驟:
[0031](I)制備對(duì)照品溶液:取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品、黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ml各含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.004mg、黃苗甲苷0.006mg的溶液，即得;
[0032](2)制備供試品溶液:取參芪扶正注射液，用0.22um微孔濾膜濾過(guò)，即得；
[0033](3)測(cè)定:精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μ I注入超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，例如超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，根據(jù)以下條件進(jìn)行測(cè)定，得到參芪扶正注射液指紋圖譜:
[0034]其中，色譜條件包括:
[0035]色譜柱:AgilentZorbax Eclipse Plus C18, 2.1mmX 100mm, 1.8 μ m ;
[0036]流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.1%體積的甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%體積的甲酸乙腈溶液；
[0037]采用梯度洗脫，洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比:
[0038](T0.5min,流動(dòng)相A為95%，流動(dòng)相B為5% ；[0039]0.5?lOmin，流動(dòng)相A為95%?75%，流動(dòng)相B為5%?25% ；
[0040]l(Tl5min，流動(dòng)相 A 為 75%?45%，流動(dòng)相 B 為 25%?55% ；
[0041 ] 15?18min，流動(dòng)相A為45%?0%，流動(dòng)相B為55%?100%。
[0042]18?20min，流動(dòng)相A為0%，流動(dòng)相B為100%。
[0043]優(yōu)選地，所述色譜條件還包括:
[0044]流速為0.35ml/min ；
[0045]柱溫為40°C ；
[0046]優(yōu)選地，質(zhì)譜的條件包括:
[0047]離子源為ESI源，負(fù)離子方式檢測(cè)；
[0048]霧化氣壓力:35psig ；
[0049]干燥氣溫度:35(TC ；
[0050]干燥氣流速:10L/min ;
[0051]毛細(xì)管電壓:3500V;
[0052]毛細(xì)管出口電壓:135V。
[0053]優(yōu)選地,上述參苗扶正注射液指紋圖譜的建立方法還包括:對(duì)多個(gè)參苗扶正注射液指紋圖譜進(jìn)行比較，選出共有特征峰，得到參芪扶正注射液特征指紋圖譜。
[0054]優(yōu)選地，上述參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法中，所述參芪扶正注射液指紋圖譜或參芪扶正注射液特征指紋圖譜中包含18個(gè)特征峰，各特征峰的保留時(shí)間如下:
[0055]峰I:7.lmin、峰 2:7.5min、峰 3:8.lmin、峰 4:8.6min、峰 5:9.2min、峰 6:
9.9min、峰 7:10.9min、峰 8:11.3min、峰 9:11.7min、峰 10:12.7min、峰 11: 13.4min、峰 12:
13.7min、峰 13:14.4min、峰 14: 14.8min、峰 15:15.lmin、峰 16: 15.5min、峰 17:15.9min、峰 18: 16.3min。
[0056]優(yōu)選地，上述參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法中，所述參芪扶正注射液指紋圖譜或參芪扶正注射液特征指紋圖譜中，以對(duì)照品黃芪甲苷為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間如下:
[0057]峰I:0.52、峰 2:0.54、峰 3:0.59、峰 4:0.62、峰 5:0.66、峰 6:0.72、峰 7:0.79、峰8:0.82、峰 9:0.85、峰 10:0.92、峰 11:0.97、峰 12:1.00、峰 13:1.04、峰 14:1.07、峰 15:1.10、峰 16:1.13、峰 17:1.16、峰 18:1.19。
[0058]優(yōu)選地，在參芪扶正注射液指紋圖譜或參芪扶正注射液特征指紋圖譜中，峰2和峰12分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷；優(yōu)選地，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷峰面積與相應(yīng)參照物峰面積比值在0.5?1.5之間。
[0059]本發(fā)明還提供一種參芪扶正注射液的鑒定方法，該方法包括將根據(jù)上述方法建立待測(cè)樣品指紋圖譜或特征指紋圖譜與根據(jù)上述方法建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜或特征指紋圖進(jìn)行比較，以鑒別真?zhèn)巍?br> [0060]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法，該方法包括以下步驟:
[0061]制備毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的混合對(duì)照品溶液，濃度分別為含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.004mg/ml,含黃苗甲苷0.006mg/ml ；
[0062]取參芪扶正注射液濾過(guò)液作為供試品溶液；[0063]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀分析上述對(duì)照品溶液和供試品溶液，色譜條件為:
[0064]色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18, 2.1mmX 100mm, 1.8 μ m ；
[0065]流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，
[0066]梯度洗脫；
[0067]流速為0.35ml/min ；
[0068]柱溫為40°C ；
[0069]進(jìn)樣5 μ I ;
[0070]得到參芪扶正注射液超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜指紋圖譜(總離子流圖);
[0071]所述梯度洗脫步驟為:0~0.5分鐘，流動(dòng)相乙腈-水為5:95 ;0.5~10分鐘，流動(dòng)相乙腈-水由5:95漸變?yōu)?5:75 ; 10~15分鐘，流動(dòng)相乙腈-水為25:75漸變?yōu)?5:45 ；15~18分鐘，流動(dòng)相乙腈-水為55:45漸變?yōu)?00:0 ;18~20分鐘，流動(dòng)相乙腈-水為100:0。
[0072]根據(jù)指紋圖譜(總離子流圖)及從指紋圖譜(總離子流圖)中提取得到的特征指紋圖譜(提取離子流圖)，確定參芪扶正注射液特征指紋圖譜，以此監(jiān)控參芪扶正注射液的質(zhì)量。
[0073]所述梯度洗脫的步驟也可用表1表示:
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種參芪扶正注射液指紋圖譜的建立方法，該方法包括采用超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)參芪扶正注射液進(jìn)行檢測(cè)，其中色譜條件包括:
色譜柱:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18, 2.1mmX 100mm, 1.8 μ m ； 流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.1%體積的甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%體積的甲酸乙腈溶液； 采用梯度洗脫，洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比體積: (T0.5min,流動(dòng)相A為95%，流動(dòng)相B為5% ； .0.5~lOmin，流動(dòng)相A為95%~75%，流動(dòng)相B為5%~25% ； .l(Tl5min，流動(dòng)相A為75%~45%，流動(dòng)相B為25%~55% ； .15~18min，流動(dòng)相A為45%~0%，流動(dòng)相B為55%~100% ； .18~20min，流動(dòng)相A為0%，流動(dòng)相B為100% ； 優(yōu)選地，所述色譜條件還包括:
流速為 0.35ml/min ； 柱溫為40°C ； 進(jìn)樣量為5 μ I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，質(zhì)譜的條件包括: 離子源為ESI源，負(fù)離子方式檢測(cè)； 霧化氣壓力:35psig ； 干燥氣溫度:350°C ； 干燥氣流速:10L/min ； 毛細(xì)管電壓:3500V ； 毛細(xì)管出口電壓:135V。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過(guò)以下步驟制備對(duì)照品溶液:取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品、黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ml各含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.004mg、黃芪甲苷0.006mg的溶液，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過(guò)以下步驟制備供試品溶液:取參芪扶正注射液，用0.22um微孔濾膜濾過(guò)，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)制備對(duì)照品溶液:取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品、黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ml各含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.004mg、黃芪甲苷0.006mg的溶液，即得； (2)制備供試品溶液:取參芪扶正注射液，用0.22um微孔濾膜濾過(guò)，即得； (3)測(cè)定:精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μI注入超高壓液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，根據(jù)以下條件進(jìn)行測(cè)定，得到參芪扶正注射液指紋圖譜: 其中，色譜條件包括:
色譜柱:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18, 2.1mmX 100mm, 1.8 μ m ； 流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.1%體積甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%體積的甲酸乙腈溶液； 采用梯度洗脫，洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比: (T0.5min,流動(dòng)相A為95%，流動(dòng)相B為5% ； .0.5~lOmin，流動(dòng)相A為95%~75%，流動(dòng)相B為5%~25% ； .l(Tl5min，流動(dòng)相A為75%~45%，流動(dòng)相B為25%~55% ；15~18min，流動(dòng)相A為45%~0%，流動(dòng)相B為55%~100% ； 18~20min，流動(dòng)相A為0%，流動(dòng)相B為100% ； 優(yōu)選地，所述色譜條件還包括:
流速為 0.35ml/min ； 柱溫為40°C ； 優(yōu)選地，質(zhì)譜的條件包括: 離子源為ESI源，負(fù)離子方式檢測(cè)； 霧化氣壓力:35psig ； 干燥氣溫度:350°C ； 干燥氣流速:10L/min ； 毛細(xì)管電壓:3500V ； 毛細(xì)管出口電壓:135V。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括:對(duì)多個(gè)參芪扶正注射液指紋圖譜進(jìn)行比較，選出共有特征峰，得到參芪扶正注射液特征指紋圖譜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述參芪扶正注射液指紋圖譜或參芪扶正注射液特征指紋圖譜中包含18個(gè)特征峰，各特征峰的保留時(shí)間如下:
峰 1:7.lmin、峰 2:7.5min、峰 3:8.lmin、峰 4:8.6min、峰 5:9.2min、峰 6:9.9min、峰7:10.9min、峰 8:11.3min、峰 9:11.7min、峰 10: 12.7min、峰 11: 13.4min、峰 12: 13.7min、峰 13: 14.4min、峰 14: 14.8min、峰 15:15.lmin、峰 16: 15.5min、峰 17: 15.9min、峰 18:16.3min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述參芪扶正注射液指紋圖譜或參芪扶正注射液特征指紋圖譜中，以對(duì)照品黃芪甲苷為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間如下:
峰 1:0.52、峰 2:0.54、峰 3:0.59、峰 4:0.62、峰 5:0.66、峰 6:0.72、峰 7:0.79、峰8:0.82、峰 9:0.85、峰 10:0.92、峰 11:0.97、峰 12:1.00、峰 13:1.04、峰 14:1.07、峰 15:1.10、峰 16:1.13、峰 17:1.16、峰 18:1.19。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在參芪扶正注射液指紋圖譜或參芪扶正注射液特征指紋圖譜中，峰2和峰12分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷；優(yōu)選地，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷峰面積與相應(yīng)參照物峰面積比值在0.5~1.5之間。
10.一種參芪扶正注射液的鑒定方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述方法建立待測(cè)樣品指紋圖譜或特征指紋圖譜與根據(jù)上述方法建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜或特征指紋圖進(jìn)行比較。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103808840SQ201210436493
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月2日
【發(fā)明者】宋艷剛, 劉學(xué)華, 黃文華, 劉東來(lái) 申請(qǐng)人:麗珠集團(tuán)利民制藥廠