鴉蔥總黃酮的制備方法及其指紋圖譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鴉蔥總黃酮的制備方法；一種鴉蔥總黃酮指紋圖譜的建立方法， 以及由該方法所得的鴉蔥總黃酮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，屬于中藥分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴉蔥為菊科植物Scorzonera austriaca Wild的干燥全草。五月~六月米挖、 曬干。本品全長10~40厘米；根粗壯，倒圓錐狀，直徑約0. 3~3厘米；莖多數(shù)，簇生于 根頸頂端，不分枝，光滑無毛，莖基被稠密褐色的纖維狀撕裂的鞘狀殘遺；基生葉廣披針形 至長圓狀卵形，長20~30 (-40)厘米，寬1. 2~3. 5 (-5)厘米，邊緣平展，基部鞘狀擴(kuò)大， 鞘內(nèi)被稠密的棉毛，基部邊緣有棉毛；莖生葉少數(shù)，1~3枚，鱗片狀；頭狀花序單生莖頂， 瘦果無毛。鴉蔥作為傳統(tǒng)中藥，全草入藥，具有清熱解毒、消炎、通乳的功效，主治癰瘡、 淋病、婦女帶下、乳腺炎等癥。鴉蔥也是一味傳統(tǒng)藏藥（藏名：巴多拉）。關(guān)于鴉蔥化學(xué) 成分的研宄除本研宄室外，只有武全香、祝英、李娟等報道了鴉蔥中倍半萜類和三萜類化 學(xué)成分的研宄（Wu Q X，Su Y B, Zhu Y. Triterpenes and steroids from the roots of Scorzonera austriaca[J]. Fitoterapia. 2011, 82(3):493 - 496) > (Zhu Y, Hu P Z, He Z ff,et al. Sesquiterpene Lactones from Scorzonera austriaca[J]. Journal of Natural Products. 2010, 73(2):237 - 241)> (Zhu Y, Wu Q X, Hu P Z, et al. Biguaiascorzolides A and B:Two novel dimeric guaianolides with a rare skeleton from Scorzonera austriaca[J]. Food Chemistry. 2009, 114(4):1316 - 1320) > (Li J, Wu Q X, Shi Y P, et al. A new sesquiterpene lactone from Scorzonera austriaca[J]. Chinese Chemical Letters. 2004, 15 (11) : 1309 - 1310)，Ting-Fu Jiang 等報道了香豆素類化學(xué)成分的研 宄(T.F. Jiang et.al. Determination of kavalactones and flavonoid glycoside in Scorzonera austriaca by capillary zone electrophoresis[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007, 43 (3) :854-858)。本研宄室對鴉蔥中 黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行了研宄（李泉妙，王廣樹.鴉蔥中黃酮苷類成分的提取分離與結(jié)構(gòu) 鑒定[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010, 36(1): 10-12)、（劉欣，張子龍，王廣樹等.鴉蔥 中黃酮成分的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012, 38 (3) :595-597)、 (何碌.鴉蔥中黃酮類化合物的研宄[D].吉林大學(xué)研宄生學(xué)位論文，2012)、（李泉妙.鴉 蔥中化學(xué)成分的研宄及保肝活性的初探[D].吉林大學(xué)研宄生學(xué)位論文，2008)。迄今為 止，本研宄室從鴉蔥中分得了 10余種黃酮類化合物，對總黃酮提取物進(jìn)行了生物活性研 宄，發(fā)現(xiàn)鴉蔥總黃酮具有治療肝炎和保肝作用，于2013年獲得了中國發(fā)明專利（一種鴉蔥 總提取物及其在制備治療肝炎或保肝藥物中的用途，專利號ZL 201110255235. 1，授權(quán)公告 日2013-06-04)。本研宄室正在進(jìn)行以鴉蔥為原料，以鴉蔥總黃酮為有效部位，以治療病毒 性肝炎為目標(biāo)的新藥創(chuàng)制的研宄，并獲得了國家科技重大專項(xiàng)的資助（國家科技重大專項(xiàng) "重大新藥創(chuàng)制"，治療病毒性肝炎創(chuàng)新藥物-YCZT的研宄，2013ZX09103002-007)。中藥指紋 圖譜技術(shù)是目前國內(nèi)外公認(rèn)的用來控制中藥、天然藥物或中藥材整體質(zhì)量最有效、最準(zhǔn)確、 最直接的手段，是一種綜合的、宏觀的和可量化的鑒別方法，其基本屬性是"整體性"和"模 糊性"。"整體性"是指完整地比較色譜的特征"面貌"；"模糊性"強(qiáng)調(diào)的是對照物與待測樣 品指紋圖譜的相似性。運(yùn)用指紋圖譜技術(shù)可以鑒別中藥材和中成藥的真?zhèn)?，評價原料藥材、 半成品和成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。
[0003] 綜上所述，為了開發(fā)以鴉蔥總黃酮為有效部位，以治療病毒性肝炎為目標(biāo)的新藥， 有必要研宄鴉蔥總黃酮的制備方法及其質(zhì)量控制方法。為此本研宄室發(fā)明了一種鴉蔥總黃 酮的制備方法，以此方法制備的鴉蔥總黃酮中黃酮類成分含量提高至90%以上，同時發(fā)明 一種鴉蔥總黃酮的指紋圖譜建立方法及標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，該方法操作簡便、穩(wěn)定和重現(xiàn)性好， 能全面、準(zhǔn)確地控制鴉蔥總黃酮的質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明的目的是為了開發(fā)以鴉蔥總黃酮為有效部位，以治療病毒性肝炎為目標(biāo)的新 藥，提供一種穩(wěn)定可行的鴉蔥總黃酮的制備方法和一種由該方法制得的鴉蔥總黃酮質(zhì)量控 制方法，其特點(diǎn)是（1)由該方法制備的鴉蔥總黃酮中黃酮類成分含量提高至90%以上；（2) 將鴉蔥總黃酮制備成供試品溶液后，經(jīng)過高效液相色譜儀分離檢測，獲得鴉蔥總黃酮的指 紋圖譜，該方法操作簡便，穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、特征峰多，能全面、準(zhǔn)確地控制鴉蔥總黃酮 的質(zhì)量。
[0005] 1.本發(fā)明鴉蔥總黃酮的制備方法具體包括如下步驟：
[0006] 1)鴉蔥全草用70%乙醇冷浸提取3次，每次7d，提取液過濾后濃縮除醇，過濾，經(jīng) DlOl型大孔樹脂柱吸附，水、60%乙醇洗脫，收集60 %乙醇洗脫組分，減壓回收乙醇，干燥， 得鴉蔥提取物；
[0007] 2)將鴉蔥提取物用水溶解，上樣于D4020型大孔樹脂柱色譜，先以5%乙醇除雜， 再收集10%~30%乙醇洗脫的黃酮類成分組分，合并后減壓回收溶劑，干燥至恒重，即得 鴉蔥總黃酮。
[0008] 2.本發(fā)明一種鴉蔥總黃酮指紋圖譜的建立方法具體包括如下步驟：
[0009] 1)供試品溶液的制備：取鴉蔥總黃酮，60%乙醇超聲溶解并定容，作為供試品溶 液；
[0010] 2)參照物溶液的制備：取鴉蔥黃酮苷A對照品，60%乙醇超聲溶解并定容，作為參 照物溶液；
[0011] 3)制作鴉蔥總黃酮指紋圖譜：分別精密吸取供試液溶液和參照物溶液，經(jīng)高效液 相色譜儀分離檢測，其中，流動相的組成為乙腈-0.1%甲酸水溶液；采用梯度洗脫；得到鴉 蔥總黃酮指紋圖譜。
[0012] 其中，供試品溶液按如下步驟制備：精密稱定各批次經(jīng)干燥至恒重的鴉蔥總黃酮 0. 0020g，60%乙醇超聲溶解并定容于IOml容量瓶中，搖勻后，作為供試品溶液。
[0013] 對照物溶液按如下步驟制備：精密稱定鴉蔥黃酮苷A 0. 0020g，60 %乙醇超聲溶 解并定容于IOml容量瓶中，搖勻后備用。
[0014] 色譜條件為：Phenomenex Gemini 5 μ m C18110A，250mmX 4. 6mm，5 μ m 色譜柱；流 動相A為色譜乙腈，B為0. 1 %甲酸-水；流速0. 8mL · min-1;柱溫30°C ;檢測波長337nm ; 進(jìn)樣量 10 yL。梯度洗脫程序：0· 01 ~L 00min，97%~86% B ;7· 01 ~30. 00min，86%~ 83% B ;30· Ol ~60. 00min，83%~65% B ;60· Ol ~65. 00min，65%~0% B。
[0015] 本發(fā)明還提供由上述鴉蔥總黃酮指紋圖譜的建立方法得到的鴉蔥總黃酮標(biāo)準(zhǔn)指 紋圖譜。
[0016] 將12份鴉蔥總黃酮樣品按上述方法制備成供試品溶液，在高效液相色譜儀上分 離檢測，使用國家藥典委員會的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版》軟件分析，得 到鴉蔥總黃酮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0017] 所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜有14個特征峰，第5號色譜峰對應(yīng)鴉蔥黃酮苷A，圖譜總長度為 65min，5號峰平均保留時間為32. 17min，以5號峰為參照峰，計(jì)算特征峰的相對保留時間和 相對峰面積，平均相對保留時間和相對峰面積如下：
[0018] 1號峰，平均相對保留時間為0. 7942,平均相對峰面積為0. 3068 ;
[0019] 2號峰，平均相對保留時間為0. 8936,平均相對峰面積為0. 3782 ;
[0020] 3號峰，平均相對保留時間為0. 9338,平均相對峰面積為1. 4074 ;
[0021] 4號峰，平均相對保留時間為0. 9565,平均相對峰面積為0. 4556 ;
[0022] 5號峰，平均相對保留時間為1. 0000,平均相對峰面積為1. 0000 ;
[0023] 6號峰，平均相對保留時間為1. 0516,平均相對峰面積為0. 5007 ;
[0024] 7號峰，平均相對保留時間為1. 1694,平均相對峰面積為0. 0639 ;
[0025] 8號峰，平均相對保留時間為1. 2372,平均相對峰面積為0. 3296 ;
[0026] 9號峰，平均相對保留時間為1. 2631，平均相對峰面積為0. 0802 ;
[0027] 10號峰，平均相對保留時間為1. 5411，平均相對峰面積為0. 0527 ;
[0028] 11號峰，平均相對保留時間為1. 5724,平均相對峰面積為0. 5788 ;
[0029] 12號峰，平均相對保留時間為1. 5893,平均相對峰面積為0. 0602 ;
[0030] 13號峰，平均相對保留時間為1. 6623,平均相對峰面積為0. 2276 ;
[0031] 14號峰，平均相對保留時間為1. 7810,平均相對峰面積為0. 0527。
[0032] 本發(fā)明鴉蔥總黃酮的制備方法和鴉蔥總黃酮的指紋圖譜建立方法及標(biāo)準(zhǔn)指紋圖 譜有如下顯著的優(yōu)點(diǎn)：
[0033] (1)本發(fā)明鴉蔥總黃酮的制備方法中所采用的大孔吸附樹脂具有機(jī)械強(qiáng)度高、吸 附性能好、選擇性高、價格低廉、預(yù)處理及再回收方法簡單等，純化方法穩(wěn)定可行，純化后黃 酮類成分含量提高至90%以上。
[0034] (2)色譜條件容易實(shí)現(xiàn)，乙腈系統(tǒng)柱壓較低，有利于系統(tǒng)的穩(wěn)定。
[0035] (3)本發(fā)明色譜條件下的各特征色譜峰均實(shí)現(xiàn)了基線分離，不僅能從整體上對鴉 蔥總黃酮進(jìn)行模糊識別，也可對比參照物色譜對鴉蔥總黃酮進(jìn)行清晰鑒別及鴉蔥總黃酮的 多組分定量分析；
[0036] (4)本發(fā)明方法穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、特征峰多，能全面、準(zhǔn)確地控制鴉蔥總黃酮的 質(zhì)量。
【附圖說明】
[0037] 附圖1 5種大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線；
[0038] 附圖2不同濃度乙醇對黃酮的解吸情況；
[0039] 附圖3是鴉蔥總黃酮特征指紋圖譜，圖中從左到右分別是第1至14號特征峰；
[0040] 附圖4是鴉蔥總黃酮的參照物鴉蔥黃酮苷A圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 實(shí)施例1 :鴉蔥總黃酮的制備方法
[0042] 1)藥品、試劑和儀器
[0043] SHIMADZU LC