一種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酮的hplc指紋圖譜及其建立方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及中藥材檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酮的HPLC指紋圖譜及其建立方法和應(yīng)用。所述的指紋圖譜的建立方法包含如下步驟：S1.精密稱取多枝霧水葛藥材，制備得到供試品溶液；S2.將供試品溶液采用高效液相色譜儀分析，得到指紋圖譜。所述的指紋圖譜可以更全面的反應(yīng)樣品的特征峰信息，且該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好；利用該指紋圖譜可以對(duì)多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酮進(jìn)行真?zhèn)位蚱焚|(zhì)鑒別。
【專利說明】
-種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPLC指紋圖譜及 其建立方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及中藥材檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總 黃酬的HPlX指紋圖譜及其建立方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多枝霧水葛（學(xué)名：Pouzolzia zeylanica var.microphylla)為等麻科霧水葛屬 下的一個(gè)變種。亞洲熱帶地區(qū)廣布，產(chǎn)于中國云南東南部，廣西，廣東，福建，江西南部，臺(tái) 灣;具有解毒消炎功效；用于治療巧瘡炎腫。黃酬類成分是多枝霧水葛的有效成分之一。目 前，缺乏一種精確的檢測(cè)多枝霧水葛藥材真?zhèn)魏唾|(zhì)量，W及多枝霧水葛總黃酬質(zhì)量的方法。
[0003] 中藥指紋圖譜是指某種(或某產(chǎn)地）中藥材或中成藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分 析手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥材或中成藥藥物特性的共有峰的圖譜。指紋圖譜從中醫(yī)整 體觀念和中藥藥效來自多種化學(xué)物質(zhì)綜合作用的觀點(diǎn)出發(fā)，能夠建立比較客觀、整體和多 指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)體系，并通過圖譜的整體特征，能夠比較全面地反映出中藥所含化學(xué)成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種 多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPlX指紋圖譜。
[0005] 本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題，通過W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPlX指紋圖譜的建立方法，包含如下 步驟：
[0007] Sl.精密稱取多枝霧水葛藥材，制備得到供試品溶液；
[000引S2.將供試品溶液采用高效液相色譜儀分析，得到指紋圖譜。
[0009]優(yōu)選地，所述的供試品溶液通過包含如下步驟的方法制備得到：
[0010] S11.稱取多枝霧水葛藥材，加入5~15倍量(ml/g)石油酸回流提取1~5次，每次 0.5~化，濾過，棄去石油酸提取液，得濾渣；
[001 U S12.將濾渣服~15倍量(ml/g)乙醇回流提取1~5次，每次0.5~化，濾過，合并濾 液，濃縮至無醇味，加水溶解、離屯、，取上清液加水調(diào)整濃度至0.1~0.5g生藥/ml并調(diào)節(jié)pH 至4.5~5.5,得樣品溶液；
[0012] S13.吸取步驟S12制備得到的樣品溶液，用AB-8大孔樹脂柱富集總黃酬，上樣流速 0.5~3BVA，上樣完畢后，用1~5BV的水洗脫除雜，在用2~5BV體積分?jǐn)?shù)為50~70%的乙醇 W1~3BVA的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，用濾膜濾過，得供試品溶液。
[0013] 優(yōu)選地，所述的HPLC指紋圖譜的建立方法，選自如下的A~M項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者 多項(xiàng)：
[0014] A.步驟S11.中，加入8~12倍量(例如8、9、10、11或12倍量)石油酸；
[001引 B.步驟Sll.中，回流提取2~4次(例如2、3或4次）；
[0016] C.步驟S11.中，每次回流提取的時(shí)間為0.5~化(例如0.5、I、1.5或化）；
[0017] D.步驟S12.中，加入8~12倍量(例如8、9、10、11或12倍量)乙醇；
[001引 E.步驟S12.中，乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50~95% (例如50%、60%、70%、80%、90%或 95%)；
[0019] F.步驟S12.中，回流提取2~4次(例如2、3或4次）；
[0020] G.步驟S12.中，每次回流提取的時(shí)間為0.5~化(例如0.5、1、1.5或化）；
[0021] H.步驟S12.中，離屯、的時(shí)間為5~50min，轉(zhuǎn)速1500~5000巧m(例如時(shí)間為5~ 20min，轉(zhuǎn)速為2000~4000巧m;或者時(shí)間為IOmin，轉(zhuǎn)速為3000巧m);
[0022] I.步驟S12.中，取上清液加水調(diào)整濃度至0.2~0.4g生藥/ml (例如0.2、0.3或0.4g 生藥/ml);
[0023] 1步驟512.中，調(diào)節(jié)抑至4.5、4.8、5.0、5.2或5.5。
[0024] K.步驟S13.中，上樣流速為1~3BVA(例如lBV/h、2BV/h或3BVA);
[00巧]L.步驟S13.中，用2~4BW例如2BV、3BV或4BV)的水洗脫除雜；
[0026] M.步驟S13.中，用2~4BV(例如2BV、3BV或4BV)體積分?jǐn)?shù)為50%、60%或70%的乙 醇WIBVA或IBVA的流速洗脫。
[0027] 上述的倍量表示每克多枝霧水葛藥材中加入石油酸或乙醇的毫升數(shù)。
[0028] 上述的單位IBV為體積單位，表示體積相當(dāng)于1倍大孔樹脂柱體積。
[0029] 優(yōu)選地，步驟S13.中在用AB-8大孔樹脂柱富集總黃酬前，精密吸取步驟S12制備得 到的樣品溶液;在用濾膜濾過前，將收集乙醇洗脫液，用體積分?jǐn)?shù)為50~70% (例如50%、 60%或70%)的乙醇定容。
[0030] 優(yōu)選地，步驟S2中高效液相色譜儀分析的色譜條件為：采用ACQUITY U化C BEH SHI化D RP18色譜柱；W乙臘-0.2 %甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.2~0.5mL/ min,檢測(cè)波長為30~330nm;進(jìn)樣量為0.2~IOiil;
[0031] 相梯度洗脫條件為:〇~22min，乙臘的體積分?jǐn)?shù)變化為15%~19%;22~26111111，乙 臘的體積分?jǐn)?shù)變化為19 %~24 % ; 26~32min，乙臘的體積分?jǐn)?shù)變化為24%~24 % ; 32~ 40min，乙臘的體積分?jǐn)?shù)變化為24%~38%。
[0032] 更優(yōu)選地，步驟S2中高效液相色譜儀分析的色譜條件為：采用規(guī)格為21mm X 150mm，l.7皿的AC卵口 Y UPLC邸H SHI化D RP18色譜柱；W乙臘-0.2%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn) 行梯度洗脫;流速為0.3mL/min，檢測(cè)波長為330nm;進(jìn)樣量為0.化1;
[0033] 相梯度洗脫條件為:0~22min，乙臘的體積分?jǐn)?shù)變化為15%~19%;22~26111111，乙 臘的體積分?jǐn)?shù)變化為19 %~24 % ; 26~32min，乙臘的體積分?jǐn)?shù)變化為24%~24 % ; 32~ 40min，乙臘的體積分?jǐn)?shù)變化為24%~38%。
[0034] 上述0.2%甲酸水表示水中含有體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸。
[0035] 本發(fā)明還提供一種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPlX指紋圖譜，是通過 上述任一項(xiàng)所述的建立方法建立得到。
[0036] 本發(fā)明還一種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜，選自 (1)~(3)中的任一項(xiàng)：
[0037] (1)使用單批次或多批次多枝霧水葛道地藥材并且按照上述任一項(xiàng)所述的建立方 法得到的多枝霧水葛藥材HPlX指紋圖譜；
[0038] (2)將使用多批次多枝霧水葛道地藥材并且按照上述任一項(xiàng)所述的建立方法得到 的HPlX指紋圖譜通過平均數(shù)法或者中位數(shù)法制成對(duì)照譜圖；
[0039] (3)其有 11 個(gè)特征峰，保留時(shí)間分別為 6.814±0.05min，11.737±0.05min，12.307 ±0.05min，12.987±0.05min，18.821±0.05min，19.888±0.05min，21.115±0.05min， 24.684±0.05min，26.924±0.05min，27.643±0.05mi^P30.297±0.05min。
[0040] 按照本發(fā)明提供的方法，測(cè)定了多枝霧水葛藥材，確定了上述11個(gè)特征峰。
[0041] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)多枝霧水葛藥材質(zhì)量或多枝霧水葛總黃酬質(zhì)量的方法，包 括如下步驟:首先按上述任一項(xiàng)所述的HPlX指紋圖譜的建立方法，建立待檢測(cè)多枝霧水葛 藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPlX指紋圖譜;然后與上述多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃 酬的標(biāo)準(zhǔn)HPlX指紋圖譜進(jìn)行比較，最后判斷多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的質(zhì)量是 否合格。
[0042] 所述的判斷可W根據(jù)指紋圖譜的相似度來判斷，若二者指紋圖譜的相似度不低于 0.85，則為質(zhì)量合格;如果低于0.85，則為不合格;所述相似度通過國家藥監(jiān)局頒布的指紋 圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件得到。
[0043] 本發(fā)明還提供一種上述多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPlX指紋圖譜，或 上述多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的標(biāo)準(zhǔn)HPlX指紋圖譜在鑒別多枝霧水葛藥材或 多枝霧水葛總黃酬的真?zhèn)位蛸|(zhì)量中的應(yīng)用。
[0044] 有益效果：（1)本發(fā)明首次建立了多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPlX指 紋圖譜W及多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的標(biāo)準(zhǔn)HPlX指紋圖譜；（2)該指紋圖譜W 及標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可W更全面的反應(yīng)樣品的特征峰信息，且該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好；（3) 利用該指紋圖譜W及標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可W對(duì)多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬進(jìn)行真?zhèn)?或品質(zhì)鑒別。
【附圖說明】
[0045] 圖1為多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0046] 圖2為多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的精密度試驗(yàn) 圖。
[0047] 圖3為多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 圖。
[0048] 圖4為多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
[0049] 圖5為多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜與液-質(zhì)（譜)聯(lián) 用總離子流圖比較圖；其中A為總離子流圖，B為指紋圖譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050] W下結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例對(duì)本發(fā)明不做任何形式的限 定。
[0051] 實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。其中，所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0052] 實(shí)施例1多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPlX指紋圖譜的建立
[0化3] I、儀器與試劑
[0化4] Waters SYNAPT G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀（美國Waters公司）
[0化日]AC卵口Y UPLC型超高效液相色譜儀(美國waters公司）
[0056] AC卵口Y UPLC 邸H 甜IELD RP18色譜柱（21mmX150mm，1.7曲1)
[0057] AY120型托盤電子分析天平（日本島津公司）
[005引DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）
[0化9] LAB0R0TA4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidol地）。
[0060] 乙臘為色譜純(歐普森牌），液相用水為屈臣氏蒸饋水，乙醇為工業(yè)乙醇，其它試劑 為分析純。
[0061] 多枝霧水葛藥材購自廣西玉林，經(jīng)廣東藥學(xué)院劉基柱教授鑒定均為等麻科霧水葛 屬多枝霧水葛化uzolzia zeylanica(L. )Benn.va;r.mic;rophylla(Wedd. )W.T.Wang的全草。
[0062] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0063] 2.1供試品溶液的制備
[0064] 取多枝霧水葛藥材進(jìn)行粉碎，稱量藥材粗粉25g，置于圓底燒瓶中，分別加入8倍量 石油酸80°C回流提取2次，每次化。濾渣揮去石油酸后，加入8倍量70%乙醇回流提取3次，每 次化，合并3次濾液，減壓濃縮至無醇味，加水使充分溶解，離屯、（300化/min) IOmin，取上清 液加水調(diào)整濃度至〇.3g生藥/ml并調(diào)節(jié)抑至5。精密吸取75ml上述樣品溶液加在AB-8大孔樹 脂柱（巫1.5 X 8cm)，上樣流速2BVA，加水2BV除雜，加60 %乙醇2BVW2BVA洗脫，收集洗脫 液，加60%乙醇定容至100mL容量瓶中，搖勻，0.22皿濾膜濾過，即得。所述的乙醇百分含量 均為體積百分含量。
[00化]2.2色譜條件
[0066] 采用規(guī)格為21mmX 150mm，1.7皿的AC卵ITY IMX B邸細(xì)I化D RP18色譜柱；W乙 臘-0.2 (體積）％甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫;流速為0.3mL/min，檢測(cè)波長為330nm;進(jìn)樣 量為0.化1;
[0067] 相梯度洗脫條件為:0~22min，乙臘的體積分?jǐn)?shù)變化為15%~19%;22~26111111，乙 臘的體積分?jǐn)?shù)變化為19 %~24 % ; 26~32min，乙臘的體積分?jǐn)?shù)變化為24%~24 % ; 32~ 40min，乙臘的體積分?jǐn)?shù)變化為24%~38%。
[0068] 將供試品溶液，按照2.2所述的色譜條件檢測(cè)，得到的多枝霧水葛藥材或多枝霧水 葛總黃酬的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖1所示。圖1顯示該指紋圖譜有11個(gè)特征峰，保留時(shí)間分 別為 6.814min，11.737min，12.307min，12.987min，18.821min，19.888min，21.115min， 24.684min，26.924min，27.643min和30.297min。
[0069] 3、方法學(xué)考察
[0070] 3.1精密度實(shí)驗(yàn)
[0071] 精密稱量藥材粗粉25g，按2.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.2的色譜條件進(jìn)行 測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，各色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD小于2.0%，相對(duì)保留時(shí)間RSD小于2.0%， 按2.4項(xiàng)下方法計(jì)算指紋圖譜的相似度，分別為0.993、0.996、0.992、0.997、0.995、0.996 (見圖2)，表明儀器精密度良好。
[0072] 3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
[0073] 精密稱量藥材粗粉25g，按2.1項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液6份，按2.2的色譜 條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于7%，相對(duì)峰面積的RSD均 小于5%，按2.4項(xiàng)下方法計(jì)算指紋圖譜的相似度，分別為0.997、0.998、0.998、0.995、0.997 (見圖3)，說明該方法的重復(fù)性良好。
[0074] 3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0075] 精密稱量藥材粗粉25g，按2.1項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液，室溫下放置，分別 在0,2,4,12,24時(shí)按2.2的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于3%;相 對(duì)峰面積的RSD小于5 %，按2.4項(xiàng)下方法計(jì)算指紋圖譜的相似度，分別為0.993、0.987、 0.997、0.994、0.997、0.996 (見圖4 )，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
[0076] 實(shí)施例2多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酬的HPlX指紋圖譜特征峰的鑒定
[0077] 供試品溶液制備參照實(shí)施例1中的2.1項(xiàng)。
[007引色譜條件參照實(shí)施例1中的2.2項(xiàng)。
[00巧]對(duì)照品溶液制備:精密稱取6,7-二甲基-1,4-二氨-2,3-哇喔嘟二酬、芹菜素-6-C- 曰-心阿拉伯糖8-C-0-D-葡萄糖巧、芹菜素-6-(：-[0-心阿拉伯糖（1 一6)-e-D-葡萄糖]、山奈 酪-3-0-[a-k鼠李糖（1 一6)-e-D-葡萄糖]-7-0-日寸-葡萄糖巧、搬皮素-3-0-[aA-鼠李糖 (1 一6) -P-D-葡萄糖]-7-0-aA-鼠李糖巧、搬皮素-3，7-2-0-aA-化喃鼠李糖巧、山奈酪-3- 0- [ CtA-鼠李糖（1 一6) -P-D-葡萄糖]-7-0-aA-鼠李糖巧和山奈酪-3，7-2-0-日寸-化喃鼠李 糖巧對(duì)照品適量，用適量甲醇溶解配置成對(duì)照品溶液，即得。
[0080]質(zhì)譜檢測(cè)條件：電噴霧離子源化SI),負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓（capillary voltage)3000V;碰撞電壓山〇11131〇11，〔6)為30~40V;錐孔電壓（sampling cone)40V;去溶 劑溫度(TEM)為350°C ;氮?dú)鉃檩o助噴霧電離與去溶劑氣體，去溶劑氣體積流量為S(K)LA;錐 孔氣流cone gas flow)為50L/h。
[0081 ]通過UPLC-ESI-Q-TOF-MS檢測(cè)得到多枝霧水葛藥材中各化學(xué)成分的總離子流圖與 指紋圖譜圖（見圖5)，并結(jié)合各化學(xué)成分的提取離子流圖及與對(duì)照品色譜圖、相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù) 對(duì)比，對(duì)指紋圖譜中11個(gè)特征峰進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)成分確認(rèn)，結(jié)果見表1。
[0082] 表1色譜峰的鑒別與鑒定
[00831
[0084] 表1結(jié)果表明，本發(fā)明的指紋圖譜W及標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中包含了多枝霧水葛中已知 的多個(gè)化合物，具有高度的可靠性。
[0085] 實(shí)施例3利用標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜檢測(cè)多枝霧水葛藥材真?zhèn)蔚姆椒?br>[0086] 隨機(jī)從市場(chǎng)上購買一批多枝霧水葛藥材檢測(cè)其真?zhèn)巍?br>[0087] 首先按實(shí)施例1所述的HPLC指紋圖譜的建立方法，建立待檢測(cè)多枝霧水葛藥材的 HPLC指紋圖譜;然后與按實(shí)施例1方法建立得到的多枝霧水葛藥材HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行 比較;通過國家藥監(jiān)局頒布的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件測(cè)得該批藥材的HPlX指紋圖譜與標(biāo) 準(zhǔn)HPlX指紋圖譜的相似度為0.9，可W判定，該批藥材為合格的多枝霧水葛藥材。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酮的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在 于，包含如下步驟：51. 精密稱取多枝霧水葛藥材，制備得到供試品溶液；52. 將供試品溶液采用高效液相色譜儀分析，得到指紋圖譜。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的供試品溶液通過包含如下步驟 的方法制備得到：511. 稱取多枝霧水葛藥材，加入5~15倍量(ml/g)石油醚回流提取1~5次，每次0.5~ 3h，濾過，棄去石油醚提取液，得濾渣；512. 將濾渣用5~15倍量(ml/g)乙醇回流提取1~5次，每次0.5~3h，濾過，合并濾液， 濃縮至無醇味，加水溶解、離心，取上清液加水調(diào)整濃度至〇. 1~〇. 5g生藥/ml并調(diào)節(jié)pH至 4.5~5.5,得樣品溶液；513. 吸取步驟S12制備得到的樣品溶液，用AB-8大孔樹脂柱富集總黃酮，上樣流速0.5 ~3BV/h，上樣完畢后，用1~5BV的水洗脫除雜，在用2~5BV體積分?jǐn)?shù)為50~70 %的乙醇以1 ~3BV/h的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，用濾膜濾過，得供試品溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于，選自如下的A~M項(xiàng)中 的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)： A. 步驟S11.中，加入8~12倍量(例如8、9、10、11或12倍量)石油醚； B. 步驟Sll.中，回流提取2~4次(例如2、3或4次）； C. 步驟SI 1.中，每次回流提取的時(shí)間為0.5~2h(例如0.5、I、1.5或2h); D. 步驟S12.中，加入8~12倍量(例如8、9、10、11或12倍量）乙醇； E .步驟S12 .中，乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50~95% (例如50%、60%、70%、80%、90%或 95%)； F. 步驟S12.中，回流提取2~4次(例如2、3或4次）； G. 步驟S12.中，每次回流提取的時(shí)間為0.5~2h (例如0.5、I、1.5或2h); Η.步驟S12.中，離心的時(shí)間為5~50min，轉(zhuǎn)速1500~5000rpm(例如時(shí)間為5~20min，轉(zhuǎn) 速為2000~4000rpm;或者時(shí)間為IOmin，轉(zhuǎn)速為3000rpm); I.步驟SI2.中，取上清液加水調(diào)整濃度至0.2~0.4g生藥/ml (例如0.2、0.3或0.4g生 藥/ml); 了.步驟312.中，調(diào)節(jié)口!1至4.5、4.8、5.0、5.2或5.5。 K. 步驟Sl3.中，上樣流速為1~3BV/h(例如lBV/h、2BV/h或3BV/h); L. 步驟S13.中，用2~4BV (例如2BV、3BV或4BV)的水洗脫除雜； M. 步驟Sl3 .中，用2~4BV(例如2BV、3BV或4BV)體積分?jǐn)?shù)為50 %、60 %或70 %的乙醇以 I BV/h或I BV/h的流速洗脫。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于，步驟S13.中在用AB-8 大孔樹脂柱富集總黃酮前，精密吸取步驟S12制備得到的樣品溶液;在用濾膜濾過前，將收 集乙醇洗脫液，用體積分?jǐn)?shù)為50~70% (例如50%、60%或70% )的乙醇定容。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于，步驟S2中高效液相色 譜儀分析的色譜條件為:采用ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18色譜柱；以乙腈-0.2%甲酸 水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫;流速為0.2~0.5mL/min，檢測(cè)波長為30~330nm;進(jìn)樣量為0.2~ ΙΟμΙ; 相梯度洗脫條件為:〇~22min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)變化為15 %~19% ; 22~26min，乙腈的 體積分?jǐn)?shù)變化為19 %~24 %; 26~32min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)變化為24 %~24 %; 32~40min， 乙腈的體積分?jǐn)?shù)變化為24%~38%。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的HPLC指紋圖譜的建立方法，其特征在于，步驟S2中高效液相色 譜儀分析的色譜條件為：采用規(guī)格為21mmX150mm，1.7ym的ACQUITY UPLC BEH SHIELD RP18色譜柱；以乙腈-0.2%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫;流速為0.3mL/min，檢測(cè)波長為 330nm;進(jìn)樣量為0·2μ1; 相梯度洗脫條件為:〇~22min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)變化為15 %~19% ; 22~26min，乙腈的 體積分?jǐn)?shù)變化為19 %~24 %; 26~32min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)變化為24 %~24 %; 32~40min， 乙腈的體積分?jǐn)?shù)變化為24%~38%。7. -種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酮的HPLC指紋圖譜，其特征在于，通過權(quán)利 要求1~6任一項(xiàng)所述的建立方法建立得到。8. -種多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜，其特征在于，選自 (1)~(3)中的任一項(xiàng)： (1) 使用單批次或多批次多枝霧水葛道地藥材并且按照權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的 建立方法得到的多枝霧水葛藥材HPLC指紋圖譜； (2) 將使用多批次多枝霧水葛道地藥材并且按照權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的建立方 法得到的HPLC指紋圖譜通過平均數(shù)法或者中位數(shù)法制成對(duì)照譜圖； (3) 其有11 個(gè)特征峰，保留時(shí)間分別為 6.814±0.05min，11.737±0.05min，12.307 土 0.05min，12.987±0.05min，18.821±0.05min，19.888±0.05min，21.115±0.05min， 24.684±0.05min，26.924±0.05min，27.643±0.05mir^P30.297±0.05min。9. 一種檢測(cè)多枝霧水葛藥材質(zhì)量或多枝霧水葛總黃酮質(zhì)量的方法，其特征在于，包括 如下步驟:首先按權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的HPLC指紋圖譜的建立方法，建立待檢測(cè)多枝 霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酮的HPLC指紋圖譜;然后與權(quán)利要求8所述的多枝霧水葛藥 材或多枝霧水葛總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較，最后判斷多枝霧水葛藥材或多枝霧 水葛總黃酮的質(zhì)量是否合格。10. 權(quán)利要求7所述的多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酮的HPLC指紋圖譜，或權(quán)利要 求8所述的多枝霧水葛藥材或多枝霧水葛總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜在鑒別多枝霧水葛藥 材或多枝霧水葛總黃酮的真?zhèn)位蛸|(zhì)量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK105954450SQ201610171641
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年3月23日
【發(fā)明人】郭麗冰, 陶曙紅, 陳卓瀚
【申請(qǐng)人】廣東藥學(xué)院