蒙藥漏蘆花指紋圖譜建立方法以及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物分析領(lǐng)域，具體設(shè)及中藥材指紋圖譜建立方法和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著蒙藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，資源不合理利用和環(huán)境變遷等原因帶來(lái)的野生資源日 益減少的問(wèn)題凸顯，嚴(yán)重制約了蒙藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。蒙藥材的自采自用也很普遍，目前市 場(chǎng)上有一些蒙醫(yī)專用的道地產(chǎn)藥材并沒(méi)有商品流通，有的有市場(chǎng)流通的商品藥材，但品種 混亂，臨床使用情況不清，運(yùn)就給合理有效的使用蒙藥材造成很大困擾。漏蘆花就是其中一 種，其同名異物現(xiàn)象非常普遍，多被誤用同科其他植物頭狀花序入藥。所W選擇一種能快 速、高效、全面的反映蒙藥材質(zhì)量信息的手段是非常必要和重要的，而指紋圖譜技術(shù)就是符 合運(yùn)些特點(diǎn)的技術(shù)手段，且化學(xué)成分指紋圖譜亦可鑒別飲片的品質(zhì)，也可輔助對(duì)品種鑒定， 能基本反映中藥全貌，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥內(nèi)在質(zhì)量的控制。
[0003] 蒙藥漏蘆花為菊科漏蘆屬植物祁州漏蘆I^iaponticum unif lo;rum(L. )DC.的干燥 花。蒙藥名：洪古爾-珠爾，分布于我國(guó)內(nèi)蒙古、東北、河北、陜西、甘肅、青海、山西、河南、四 川、山東等地。入蒙藥可殺"粘"、止刺痛、清熱、解毒、解表等，主治感冒、屯、熱頻疾、血熱及傳 染性熱癥等。漏蘆花為蒙醫(yī)臨床常用藥，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分 冊(cè)），但無(wú)鑒別、檢查、含量測(cè)定項(xiàng)，《中國(guó)藥典》2015版中只有關(guān)于中藥漏蘆(祁州漏蘆的根） 的質(zhì)量控制方法，但并不適用于漏蘆花。運(yùn)不僅制約了漏蘆花資源的有效利用，也無(wú)法保證 用藥的安全性和有效性。
[0004] 本發(fā)明首次建立了蒙藥漏蘆花指紋圖譜，標(biāo)識(shí)了 13個(gè)共有峰中的8個(gè)峰。研究所用 的HPLC法操作簡(jiǎn)單，分離度高，重現(xiàn)性好。建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜典型、全面、有代表性，能真 實(shí)、客觀地反映漏蘆花所含化學(xué)成分的類型、數(shù)量和相對(duì)含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提出一種漏蘆花指紋圖譜的建立方法，包括W下步驟：
[0006] 1)供試品溶液的制備：取藥材粉末，置lOOmL具塞錐形瓶中，加70%甲醇，超聲提 取，放置到室溫后，再稱定重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取濾液W0.45WI1微孔濾膜濾 過(guò)，備用；
[0007] 2)將供試品溶液注入高效液相色譜儀中，獲得指紋圖譜，采用的色譜條件為:色譜 柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱;流動(dòng)相：乙臘(A)-0.2%憐酸水溶液(B)，采用梯度洗脫 85%B(0min)~78%B(12min)~74%B(13min)~60%B(60min);檢測(cè)條件:DAD 檢測(cè)器，檢測(cè) 波長(zhǎng)230~400nm;柱溫：20~40°C ;進(jìn)樣量：5~30yL。
[000引作為優(yōu)選，色譜柱采用規(guī)格為250mmX4.6mm，5wIl的YMC-Pack0DS-A色譜柱或者島 津1116的311005-5?冊(cè)1(：色譜柱。
[0009] 進(jìn)一步的優(yōu)選是，步驟1)中，取藥材粉末約0.2g，精密稱定，加入70%甲醇25mL，超 聲提取40min，放置到室溫后，再稱定重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取濾液wo.45皿 微孔濾膜濾過(guò)。
[0010] 更優(yōu)選地，流速為1.2ml/min;采用DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;柱溫25 °C ;進(jìn)樣量 10化。
[0011] 本發(fā)明還提供一種利用指紋圖譜評(píng)價(jià)黃花列當(dāng)藥材質(zhì)量的方法，包括W下步驟： 步驟一:建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，包括:a)供試品溶液的制備:分別制備11個(gè)不同批次的漏蘆花 樣品供試品溶液，取樣品粉末，置lOOmL具塞錐形瓶中，加70%甲醇，超聲提取，放置到室溫 后，再稱定重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取濾液W0.45M1微孔濾膜濾過(guò)，備用;b)對(duì) 照品溶液的制備:稱取1)蟻皮醬酬、2)搬皮素-3-0-a-k鼠李糖巧、3)芹菜素-7-0-β-0-葡萄 糖醒酸巧、4)山奈酪-3-0-a-k鼠李糖巧、5)泥胡木脂素 Β巧、6)木犀草素、7)芹菜素、8)5,7， 4'-Ξ徑基-3'-甲氧基黃酬共8種對(duì)照品，用甲醇溶解定容，制成一定濃度的單一對(duì)照溶液， 微孔濾膜0.45WI1濾過(guò)，備用;C)先后將各供試品溶液和對(duì)照品溶液注入高效液相色譜儀中， 分別獲得指紋圖譜，色譜條件為:色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱;流動(dòng)相：乙臘(Α)- 0.2%憐酸水溶液(8)，采用梯度洗脫85%6(0111111)~78%6(12111111)~74%8(13111111)~60%6 (60min);檢測(cè)條件:DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)230~400皿;柱溫:20~40°C ;進(jìn)樣量:5~30化;d) 用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算11個(gè)樣品的相似度，從中確定一個(gè)相似度最高的作為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖 譜。步驟二：用上述相同的方式獲得一個(gè)待評(píng)價(jià)樣品的指紋圖譜;步驟Ξ:用前述相似度評(píng) 價(jià)軟件評(píng)價(jià)所述待評(píng)價(jià)樣品指紋圖譜和所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，相似度大于0.9則判 定所述待評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量符合要求。
[0012] 進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包含W下13個(gè)共有峰，各峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為： 5.40,11.24,16.47,17.46,18.53,18.91,20.92,22.62,23.01,25.43,27.66,33.59,35.22〇
[0013] 更進(jìn)一步地，其中，所述13個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積分別為0.164,1.280,0.378， 0.115,0.061,0.617,0.056,0.251,0.446,0.491,0.268,0.038。
[0014] 更進(jìn)一步地，用所述共有峰中標(biāo)識(shí)出的8個(gè)對(duì)照品對(duì)應(yīng)峰的峰面積，與待測(cè)樣品對(duì) 應(yīng)的峰面積進(jìn)行比較，后者峰面積越大，說(shuō)明樣品質(zhì)量越好。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的供試品溶液制作方法操作溶液，具有較高的精密度、穩(wěn)定性、和重現(xiàn) 性，系統(tǒng)適用性強(qiáng)，可適用于該屬藥材的制作。所建立的漏蘆花指紋圖譜分析方法靈敏度 高，重現(xiàn)性好;所獲得的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜具有典型性、代表性，能較全面的反映漏蘆花藥材中 所含的化學(xué)成分種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥材的整體評(píng)價(jià)和描述提供一個(gè)更為全面的依據(jù)。本 發(fā)明建立的漏蘆花藥材高效液相指紋圖譜技術(shù)，彌補(bǔ)了現(xiàn)今尚屬空白的漏蘆花藥材質(zhì)量控 制的方法，使漏蘆花藥材的質(zhì)量控制技術(shù)更加科學(xué)全面。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；
[0017] 圖2和圖3顯示8個(gè)單一對(duì)照品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的對(duì)照?qǐng)D譜；
[0018] 圖4是11批漏蘆花藥材HP1X指紋圖譜疊加圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 供試品溶液的制備
[0020] 該環(huán)節(jié)中，取干燥的漏蘆花粉碎，取藥材粉末，精密加入計(jì)算量的甲醇溶液，超聲 處理，放置至室溫，溶劑補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45皿微孔濾膜，作為供試品溶 液。
[0021] 本發(fā)明中，使用甲醇水溶液作為供試品溶劑，甲醇溶液的濃度范圍可W在50~ 100 %之間，優(yōu)選在60~80 %之間，最優(yōu)選70 %的甲醇溶液。
[0022] 優(yōu)選將漏蘆粉碎，使用時(shí)過(guò)65目篩，提取方法可W是回流或者超聲處理，優(yōu)選通過(guò) 超聲提取，提取時(shí)間可W是30~60min，優(yōu)選提取40min。
[0023] 本發(fā)明中，取樣的量可W在0.1~0.4g的范圍，在采用上述最優(yōu)選方式的情況下， 優(yōu)選取樣0.2g，加70 %甲醇25ml，稱定重量，超聲處理40min，放置到室溫后，再稱定重量，用 溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液W0.45WI1微孔濾膜濾過(guò)，得到供試品溶液。
[0024] 因此，本發(fā)明最優(yōu)選的漏蘆花供試品溶液的制備方法為:取藥材粉末約0.2g，精密 稱定，置lOOmL具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇25mL，超聲提取40min，放置到室溫后，再稱 定重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取濾液W〇.45ym微孔濾膜濾過(guò)，即得。采用該最優(yōu)選 的制備方法，在色譜圖的峰數(shù)、峰高、峰面積和分離度方面表現(xiàn)最佳。
[00巧]對(duì)照品溶液的制備
[0026] 精密稱取各對(duì)照品約0.5mg，分別置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖 勻，制成對(duì)照品溶液，進(jìn)樣前用〇.45μπι微孔濾膜濾過(guò)。對(duì)照品均為漏蘆花化學(xué)成分研究中得 到并經(jīng)光譜解析鑒定結(jié)構(gòu)。如下8種：
[0027] 1)蟻皮醬酬
[002引 2)搬皮素-3-0-日寸-鼠李糖巧 [00巧]3)芹菜素-7-0-β-0-葡萄糖醒酸巧
[0030] 4)山奈酪-3-0-日寸-鼠李糖巧
[0031] 5)泥胡木脂素 Β巧
[0032] 6)木犀草素
[0033] 7)芹菜素
[0034] 8)5,7,4'-Ξ徑基-3'-甲氧基黃酬 [003引色譜條件
[0036] 本發(fā)明中使用的色譜條件優(yōu)選為:色譜柱是十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱;流動(dòng) 相是乙臘(Α)-0.2%憐酸水溶液(Β)，采用梯度洗脫85%B(0min)~78%B(12min)~74%Β (13min)~60%B(60min);采用DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)230~400nm;柱溫20~40°C;進(jìn)樣量5~ 30化。
[0037] 在本發(fā)明的最佳實(shí)施例中，確定漏蘆花HP1X指紋圖譜分析的最優(yōu)色譜條件為:色 譜柱：YMC-化ck 0DS-A色譜柱（250mmX4.6mm，5皿）或者島津Inertsil 0DS-SP HPLC色譜 柱；流動(dòng)相：乙臘-〇.2%憐酸水溶液，梯度洗脫：85%8(〇111111)~78%8(12111111)~74%6 (13min)~60%B(60min);流速：1.2血/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;柱溫25°C;進(jìn)樣量20yL。采用該 最佳流動(dòng)相系統(tǒng)和洗脫比例，色譜圖中峰信息全面，峰形好，基線平穩(wěn)。采用254nm的檢測(cè)波 長(zhǎng)可W獲得最佳的各色譜圖中的峰數(shù)、峰高、峰面積和分離度。流速為1.2mL/min時(shí)色譜圖 分離度較好，且在不影響分離度和峰數(shù)的情況下洗脫時(shí)間更短。
[00；3引共有峰的標(biāo)定
[0039] 取不同產(chǎn)地采集的11批漏蘆花藥材樣品，按照上述已經(jīng)建立的操作方法分別進(jìn)樣 分析，得到各批次藥材的HP1X指紋