血府逐瘀湯及膠囊的uplc指紋圖譜檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于柱色譜法領(lǐng)域，具體是一種血府逐瘀湯及膠囊的UPLC指紋圖譜檢測(cè) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 指紋圖譜是建立在中藥化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)多種分析技術(shù)對(duì)中藥復(fù)雜體 系進(jìn)行系統(tǒng)研究，從而表征藥品質(zhì)量的一種方法。中藥指紋圖譜研究從藥材的生產(chǎn)、粗加 工、中間體、成品等各個(gè)方面開(kāi)展相似性和相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量的變異和缺陷，從而全面、 特異地控制中藥的質(zhì)量，特別適用于中藥及復(fù)方制劑復(fù)雜體系的質(zhì)量控制研究。中藥及中 藥制劑組方藥味多，成分復(fù)雜，很難用其中一個(gè)或幾個(gè)有效成分的含量來(lái)控制中藥制劑的 質(zhì)量。截至目前，在中藥的生產(chǎn)和流通中，中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制主要通過(guò)單成分定量，并不能 對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行全面控制。因此建立一種綜合評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的方法是必然趨勢(shì)。
[0003] 血府逐瘀湯源自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，是諸活血化瘀方中最具代表性的經(jīng) 方，具有活血化瘀，行氣止痛的功效，臨床應(yīng)用廣泛。原方由當(dāng)歸、地黃、桃仁、枳殼、牛膝、赤 芍、柴胡、甘草、川芎、桔梗、紅花十一味藥組成，是在桃紅四物湯(活血化瘀而養(yǎng)血)、四逆散 (行氣和血而舒肝）基礎(chǔ)上加桔梗、牛膝而成。方中當(dāng)歸、桃仁、紅花活血化瘀兼和血，為君 藥；赤芍、川芎增強(qiáng)君藥活血化瘀作用，地黃滋陰養(yǎng)血為臣藥；桔梗能載藥上行入血府(胸 中）；柴胡疏肝解郁，升舉清陽(yáng)，與枳殼配伍，理氣散結(jié)之力尤著；牛膝行血逐瘀，引瘀血下 行，同為佐藥；甘草緩急和中，為使藥；全方體現(xiàn)了血藥與氣藥的配伍、升藥與降藥的有機(jī) 結(jié)合。血府逐瘀湯作為經(jīng)典名方，臨床療效確切，基于血府逐瘀湯研究開(kāi)發(fā)了多個(gè)現(xiàn)代制 劑，包括血府逐瘀片、泡騰片、丸、顆粒、口服液、膠囊、軟膠囊等劑型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)不能全面、科學(xué)評(píng)價(jià)血府逐瘀湯及膠囊的質(zhì)量的問(wèn) 題，所提出的一種血府逐瘀湯及膠囊的UPLC指紋圖譜檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明是按照以下技術(shù)內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的。
[0006] -種血府逐瘀湯及膠囊的UPLC(超高效液相色譜）指紋圖譜檢測(cè)方法，包括以下 步驟： a. 對(duì)照品洛液的制備 分別稱取芍藥苷、野漆樹(shù)苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草素、柚皮素、竹節(jié)參皂苷IVa、柚皮苷、沒(méi) 食子酸、甘草苷、甘草酸、綠原酸、蛻皮留醇、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚、羥基紅花黃色素 A 對(duì)照品并溶于50%甲醇水溶液，制成I mg*mL 1的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取各對(duì)照品儲(chǔ)備液100 μ L，置于2 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液； b. 供試品溶液的制備 分別取血府逐瘀湯粉末或膠囊內(nèi)容物，用50%甲醇水溶液溶解，超聲處理后，再加入 50%甲醇水溶液，制成0. 02g · mL 1的供試品溶液； C.色譜條件 色譜柱：2. 1X100 mm，l. 7 μL?，ACQUITY UPLC? BEH C18 ;流動(dòng)相以乙腈為流動(dòng)相A，以 0. 1%甲酸水溶液為流動(dòng)相B，其體積比為流動(dòng)相A占3~97%，流動(dòng)相B占97%~3%，進(jìn)行梯 度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，柱溫：30~50°C，流速：0. 3~0. 5 mL · min \進(jìn)樣量：2 yL ; d.將步驟a和b所制備的溶液按照步驟c的色譜條件進(jìn)行超高效液相色譜測(cè)定。
[0007] 本發(fā)明獲得了如下有益效果。
[0008] 本發(fā)明有效的解決了現(xiàn)有技術(shù)不能全面、科學(xué)評(píng)價(jià)血府逐瘀湯及膠囊質(zhì)量的問(wèn) 題。本發(fā)明建立的血府逐瘀湯及膠囊的UPLC指紋圖譜的檢測(cè)方法符合指紋圖譜方法學(xué)研 究要求，進(jìn)一步闡明了血府逐瘀湯及膠囊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)；本發(fā)明所述方法可用于血府逐 瘀湯及膠囊的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)，有效的保證了血府逐瘀產(chǎn)品的質(zhì)量，對(duì)血府逐瘀湯及膠囊 的質(zhì)量控制具有重要意義。本發(fā)明所述方法精密度高、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好，對(duì)血府逐瘀湯及 膠囊質(zhì)量進(jìn)行了全面評(píng)價(jià)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1是本發(fā)明血府逐瘀湯對(duì)照指紋圖譜； 圖2是本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖； 圖3是本發(fā)明3批血府逐瘀湯的指紋圖譜； 圖4是本發(fā)明13批血府逐瘀膠囊的指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0011] 本發(fā)明所述血府逐瘀膠囊，由天津宏仁堂藥業(yè)有限公司提供； 本發(fā)明所述血府逐瘀湯，由本實(shí)驗(yàn)室自制。
[0012] 具體的制備方法如下： 血府逐瘀湯：當(dāng)歸9克、生地9克、桃仁12克、枳殼6克、牛膝9克、赤芍6克、柴胡3 克、甘草6克、川芎4. 5克、桔梗4. 5克、紅花9克，8倍量蒸餾水浸泡1小時(shí)，加熱回流提取 2小時(shí)，冷卻后倒出提取液；藥渣加8倍量蒸餾水再加熱回流提取2小時(shí)；合并兩次提取液， 減壓濃縮得浸膏；浸膏40 °C真空干燥得血府逐瘀湯干浸膏，粉碎，即可。
[0013] 血府逐瘀膠囊：當(dāng)歸81克、生地81克、桃仁108克、枳殼54克、牛膝81克、赤芍54 克、柴胡27克、甘草27克、川芎40克、桔梗40克、紅花81克，以上^^一味，取桃仁半量，當(dāng) 歸、赤芍、麩炒枳殼、川芎、柴胡，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻；其余紅花等五味及剩余桃仁加水 煎煮三次，煎液濾過(guò)，合并濾液，濃縮成稠膏，與上述粉末混勻，制成顆粒，干燥，粉碎，過(guò)篩， 裝入膠囊，制成1000粒即得。
[0014] 實(shí)施例1 :血府逐瘀湯指紋圖譜測(cè)定方法的建立 1. 1儀器 ACQUITY超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司，包括Waters ACQUITY二元栗，DAD檢 測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，在線脫氣機(jī)，柱溫箱，Empower色譜工作站）；超純水儀（Milli-Q，美國(guó) Millipore公司）;V〇rteX-5渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司）J25低溫高速 離心機(jī)（美國(guó) Thermo Forma 公司）;十萬(wàn)分之一天平（METTLER TOLEDO XS205 Jf^iMETTLER 公司）；萬(wàn)分之一天平（METTLER TOLEDO AL204,瑞士 METTLER 公司）；SCIENTZ SB 25-12DTN 超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司）JSP-200粉粹機(jī)(浙江永康金穗機(jī)械制造 廠)。
[0015] 1. 2試藥與試劑 樣品：血府逐瘀膠囊：天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)為E03051、E03052、E03053、 E03054、E03055、E03056、E03057、E03058、E03059、E03060、E03061、E03062、E03063。
[0016] 血府逐瘀湯：實(shí)驗(yàn)室自制。
[0017] 標(biāo)準(zhǔn)品：芍藥苷（RS0453 )、野漆樹(shù)苷（THB-TS40S )、芍藥內(nèi)酯苷（RS0042 )、柚皮 素（THB-2S340)、竹節(jié)參皂苷IVa (THB-1S375)購(gòu)自于天津拓海生物科技有限公司；柚 皮苷（110722-200610)、沒(méi)食子酸（110831-200803)、甘草苷（111610-201106)、甘草酸 (110731-201317)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；綠原酸（W0Z-4-2)、蛻皮甾醇、橙皮苷、 新橙皮苷、山奈酚、甘草素(純度多98%)購(gòu)自天津中新藥業(yè)研究中心；羥基紅花黃色素 A (Q-008-14073)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。
[0018] 試劑：乙腈(美國(guó)Sigma-Aldrich有限公司），甲酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，純凈 水(實(shí)驗(yàn)室自制)。
[0019] 1.3供試品溶液的制備 取血府逐瘀湯粉末適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于25 mL棕色量瓶中，加入50% 甲醇水溶液適量，超聲20 min，取出，放涼，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，即可。
[0020] 1. 4對(duì)照品溶液的制備： 取芍藥苷、野漆樹(shù)苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草素、柚皮素、竹節(jié)參皂苷IVa、柚皮苷、沒(méi)食子酸、 甘草苷、甘草酸、綠原酸、蛻皮留醇、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚、羥基紅花黃色素 A對(duì)照品適 量，精密稱定，分別加入50%甲醇水溶液，制成I mgmL1的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取各 對(duì)照品儲(chǔ)備液100 yL，置于2 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，即得 混合對(duì)照品溶液。
[0021] 1.5對(duì)照試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液2 μ L，注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖和保留時(shí)間，即得。
[0022] 1. 6色譜條件： 色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18 (2.1X100 mm, 1.7 μπι);以乙腈為流動(dòng)相 Α，以 0. 1%甲酸水溶液為流動(dòng)相Β，其體積配比為流動(dòng)相A占3~97%，流動(dòng)相B占97%~3%，進(jìn) 行梯度洗脫；具體洗脫體積濃度配制比為： 0~8 min，流動(dòng)相A所占的體積比3~8%，流動(dòng)相B占的體積比為97%~92% ; 8~24 min，流動(dòng)相A所占的體積比8~19%，流動(dòng)相B占的體積比為92%~81% ; 24~35 min，流動(dòng)相A所占的體積比19~45%，流動(dòng)相B占的體積比為81%~55% ; 檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，柱溫：50 °C，流速：0. 3 mL ·π?η \精密吸取供試品溶液2 μ L注入 超高效液相色譜儀，記錄35 min色譜圖，得到血府逐瘀湯指紋圖譜。
[0023] 1. 7共有峰的確定 分析血府逐瘀湯指紋圖譜信息(如圖1所示)，獲得30個(gè)共有峰，以21號(hào)峰(野漆樹(shù)苷） 為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品（如圖2所示）比對(duì)的方 法，鑒定了 16個(gè)共有峰。
[0024] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：供試品指紋圖譜中共有30個(gè)特征峰，以參照峰野漆樹(shù)苷的保留時(shí) 間和峰面積為1，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)為規(guī)定值 的± 5%之內(nèi)。
[0025] 依照該方法生成的指紋圖譜中有30個(gè)共有峰，以野漆樹(shù)苷為參照峰，其相對(duì) 保留時(shí)間應(yīng)為規(guī)定值的±5% :1號(hào)峰：0. 076±0. 004 ;2號(hào)峰：0. 098±0. 005 ;3號(hào)峰： 0· 119±0· 006 ;4 號(hào)峰：0· 153±0· 008 ;5 號(hào)峰：0· 178±0· 009 ;6 號(hào)峰：0· 203±0· 010 ;7 號(hào) 峰：0· 296±0· 015 ;8 號(hào)峰：0· 308±0· 015 ;9 號(hào)峰：0· 332±0· 017 ;10 號(hào)峰：0· 359±0· 018 ; 11 號(hào)峰：0.384±0.019;12 號(hào)峰：0.459±0.023;13 號(hào)峰：0.527±0.026;14 號(hào)峰： 0· 550±0· 027 ;15 號(hào)峰：0· 596±0· 030 ;16 號(hào)峰：0· 699±0· 035 ;17 號(hào)峰：0· 829±0· 041 ; 18 號(hào)峰：0· 892±0· 045 ;19 號(hào)峰：0· 920±0· 046 ;20 號(hào)峰：0· 974±0· 049 ;21 號(hào)峰（S)號(hào)峰： L 000 ;22 號(hào)峰：L 042±0· 052 ;23 號(hào)峰：L 065±0· 053 ;24 號(hào)峰：L 096±0· 055 ;25 號(hào)峰： L 308±0· 065 ;26 號(hào)峰：1· 318±0· 066 ;27 號(hào)峰：L 349±0· 067 ;28 號(hào)峰：1· 376±0· 069 ; 29 號(hào)峰：1· 389±0· 069 ;30 號(hào)峰：1· 592±0· 080。
[0026] 依照本發(fā)明測(cè)定方法生成的指紋圖譜中有30個(gè)特征峰，以野漆樹(shù)苷為參照峰，得 到血府逐瘀湯的共有峰(峰面積占總峰面積> 3%)的相對(duì)峰面積為：1號(hào)峰：1. 385±0. 007 ; 16 號(hào)峰：1· 067±0· 016 ;19 號(hào)峰：1· 301±0· 037 ;20 號(hào)峰：11· 286±0· 064 ;21 號(hào)峰（S): L 000 ;24 號(hào)峰：9· 2