專利名稱：顯色試劑、濃度測定試劑盒、濃度測定方法和在該方法中使用的傳感器芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在酶反應(yīng)中使用的顯色試劑(coloring reagent)、一種濃度測定試劑盒、一種測定待測物質(zhì)的濃度的方法以及在該方法中使用的傳感器芯片(sensor chip)。特別地，本發(fā)明涉及一種在酶反應(yīng)中使用的顯色試劑，所述酶反應(yīng)用于通過利用衰減波(evanescentwave)，使用非常少量的樣品以高靈敏度和高準(zhǔn)確性迅速測定待測物質(zhì)的濃度，本發(fā)明還涉及一種濃度測定試劑盒、一種測定待測物質(zhì)的濃度的方法以及在該方法中使用的傳感器芯片。
背景技術(shù)：
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法已經(jīng)作為一種通過利用抗原抗體之間的特異性反應(yīng)而測定微量成分的方法而被特別地應(yīng)用于臨床檢測中。
通常稱做微孔板(microplate)的具有96凹孔(孔)的樹脂平板用于ELISA方法。例如，在夾心ELISA方法中，基于測試物質(zhì)，將初級抗體固定在每個(gè)孔上。在該方法中，將測試樣品溶液分散于每個(gè)孔中，使固定于平板上的抗體(初級抗體)與測試樣品溶液中的待測物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)(此后稱為初級反應(yīng))，隨后通過清洗除去含有未反應(yīng)測試樣品的溶液。然后，將酶標(biāo)記的次級抗體溶液分散到平板的每個(gè)孔中，使與次級抗體反應(yīng)的待測物質(zhì)與次級抗體發(fā)生特異性反應(yīng)(此后稱為次級反應(yīng))。除去未反應(yīng)的次級抗體溶液后，將顯色試劑溶液分散于每個(gè)孔中，進(jìn)行酶反應(yīng)(此后稱為酶反應(yīng))，使酶反應(yīng)產(chǎn)物顯色，并且通過使用微孔板閱讀儀測定來自通過孔的透射光的強(qiáng)度的吸收，由校準(zhǔn)曲線測定待測物質(zhì)的濃度。
例如，胰島素是一種胰腺β-細(xì)胞分泌的激素，已知其具有降低血糖水平的作用。因此，應(yīng)測定血液中胰島素的濃度以診斷糖尿病及識別患者的病理。胰島素的濃度通過與上面描述相同的使用具有固定有抗胰島素抗體的凹孔的微孔板的ELISA方法測定，所述測定通過將測試樣品溶液分散到所述凹孔中，使所述抗胰島素抗體與測試樣品溶液中的胰島素發(fā)生反應(yīng)來進(jìn)行。
然而，采用微孔板的ELISA需要數(shù)十微升到100微升的測試樣品的量，最少為5μL或者更多，并且在上述濃度中僅僅每毫升數(shù)百皮克的數(shù)量級中，其測定靈敏度會降低。此外，當(dāng)增加進(jìn)行測定的測試樣品量以增加其靈敏度時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)受到測試樣品溶液中含有的抗原-抗體反應(yīng)的抑制物質(zhì)的增加的量的影響。由于增加測試樣品的量會降低測定的靈敏度，其只能保持在大約每毫升數(shù)百皮克。
ELISA的另一個(gè)問題是測定花費(fèi)很長的時(shí)間，因?yàn)樵谛枰罅繙y試樣品的ELISA中，抗原抗體需要更長時(shí)間完成反應(yīng)。例如，初級反應(yīng)所需的時(shí)間通常為數(shù)小時(shí)，最長可達(dá)24小時(shí)，次級反應(yīng)和底物反應(yīng)需要數(shù)十分鐘。
當(dāng)從嬰兒或較小的動物收集樣品時(shí)，人們希望測試樣品(血液、血漿)的量盡可能少。在ELISA中，分配到微孔板的孔中的樣品量需要很精確，但是很難精確測定小于5μL的樣品。因此，為了精確的測定，需要使用大于所需的量的測試樣品，盡管人們希望以較少的樣品量來進(jìn)行測定。
利用抗原抗體反應(yīng)的傳感器芯片是已知的。

圖1是顯示具有光波導(dǎo)(optical waveguide)的傳感器芯片構(gòu)造的示意圖。所述傳感器芯片包括一個(gè)在玻璃基板16上形成的由氮化硅膜制成的光波導(dǎo)層1、分別設(shè)置于光波導(dǎo)層兩側(cè)的一對入射側(cè)光柵(grating)13a(衍射光柵)和出射側(cè)光柵13b，或者棱鏡(未顯示)，以及一個(gè)在光波導(dǎo)層1上形成的抗體固定化層14。
通過將含有抗原的測試樣品溶液與所述傳感器芯片中的抗體固定化層14接觸，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。通過在抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)中加入熒光色素標(biāo)記的抗體溶液，在所述基板上形成包含抗體/抗原/熒光色素標(biāo)記的抗體的免疫復(fù)合物。測試樣品溶液中抗原的量通過下列步驟測定，包括用激光穿透入射側(cè)光柵13a進(jìn)入光波導(dǎo)層1發(fā)射出衰減波(evanescent wave)；通過衰減波激發(fā)光波導(dǎo)層1上的抗體固定化層14中的熒光色素；通過采用光接受元件(photo-acceptanceelement)測定熒光色素發(fā)出的熒光強(qiáng)度來分析測試樣品溶液中抗原的量(例如，參見日本公開專利申請(JP-A)No.8-285851)。
衰減波指的是一種位于光波導(dǎo)層和外層之間的界面附近的電磁波，在該界面處光被全反射。除采用熒光色素標(biāo)記測試樣品的方法之外(參見例如KOKOKU
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