專(zhuān)利名稱(chēng)：高靈敏度顯色鱟試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型公開(kāi)一種高靈敏度顯色鱟試劑盒，按國(guó)際專(zhuān)利分類(lèi)表(IPC)劃分屬于檢測(cè)試劑盒類(lèi)制造技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑盒。
背景技術(shù)：
細(xì)菌內(nèi)毒素又稱(chēng)熱原，進(jìn)入人體后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生熱原反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)引起內(nèi)毒素血癥、內(nèi)毒素休克，危及生命。鱟試驗(yàn)法是檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的最佳方法。其原理為鱟試劑中含有對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素敏感的蛋白酶系統(tǒng)，此酶系統(tǒng)包含C因子、B因子、凝固酶原及凝固蛋白原等。在細(xì)菌內(nèi)毒素的作用下，C因子活化后引發(fā)B因子活化，B因子活化后引發(fā)凝固酶原活化為凝固酶，而凝固酶又引發(fā)凝固蛋白原活化為凝固蛋白，凝固蛋白最后聚合成凝膠。為了準(zhǔn)確定量細(xì)菌內(nèi)毒素，可以在反應(yīng)體系中加入人工合成的顯色基質(zhì)。此顯色基質(zhì)為凝固酶的底物，在凝固酶的作用下會(huì)生成黃色的對(duì)硝基苯胺。在一定的時(shí)間內(nèi)，對(duì)硝基苯胺的生成量與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，對(duì)硝基苯胺的生成量可以利用光學(xué)儀器在0D405nm檢測(cè)。因此，可以準(zhǔn)確定量樣品中的內(nèi)毒素濃度。此方法為顯色基質(zhì)法。顯色基質(zhì)法的靈敏度一般為0. lEU/ml。在應(yīng)用顯色法鱟試劑進(jìn)行生物樣品的內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)，常常會(huì)受到有色樣品自身顏色對(duì)鱟試驗(yàn)的干擾。如臨床上常有的黃疸樣品也呈黃色，本底OD值高，無(wú)法用顯色鱟試劑來(lái)檢測(cè)。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本實(shí)用新型提供了一種高靈敏度顯色鱟試劑盒，是通過(guò)在鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)結(jié)束后將顯色產(chǎn)物對(duì)硝基苯胺進(jìn)行偶氮化反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該試劑盒檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的靈敏度達(dá)到0. 01EU/ml。為達(dá)到上述目的，本實(shí)用新型是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種高靈敏度顯色鱟試劑盒，包括盒體及其內(nèi)的鱟試劑瓶、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品瓶、顯色基質(zhì)瓶、兩支以上的偶氮化試劑瓶、反應(yīng)終止劑瓶及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水瓶，顯色反應(yīng)的顏色為玫瑰紅色，最高吸收峰為^5nm。進(jìn)一步，所述的盒體內(nèi)有二瓶鱟試劑，二瓶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，二瓶顯色基質(zhì)，三組偶氮化試劑瓶，一瓶反應(yīng)終止劑以及二瓶細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。進(jìn)一步，所述的三組偶氮化試劑瓶分別為亞硝酸鈉瓶、氨基磺酸銨瓶及萘乙二胺瓶且數(shù)量均為二瓶。進(jìn)一步，所述顯色基質(zhì)瓶?jī)?nèi)的顯色基質(zhì)為帶有對(duì)硝基苯胺基團(tuán)的三肽或四肽，裝量為 0. 5ml-2. 2ml。進(jìn)一步，所述的反應(yīng)終止劑瓶?jī)?nèi)裝有0. 48N鹽酸，裝量為50ml。進(jìn)一步，所述的鱟試劑瓶、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品瓶、顯色基質(zhì)瓶、偶氮化試劑瓶、 反應(yīng)終止劑瓶及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水瓶均為玻璃管制瓶或安瓿瓶。本實(shí)用新型是通過(guò)在鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)結(jié)束后將顯色產(chǎn)物對(duì)硝基苯胺進(jìn)行偶氮化反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，顯色反應(yīng)的顏色為玫瑰紅色，靈敏度達(dá)到0. 01EU/ml，特別適用于臨床樣品、生物樣品及有色樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素定量法檢測(cè)。本實(shí)用新型具有如下有益效果1、本試劑盒檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的靈敏度達(dá)到0. 01EU/ml,比普通顯色法鱟試劑提高 10倍；2、本實(shí)用新型顯色反應(yīng)的顏色為玫瑰紅色，最高吸收峰為545nm，而不是傳統(tǒng)的 405nm，避開(kāi)了大部分生物樣品自身顏色對(duì)顯色法鱟試驗(yàn)的干擾。

圖1是本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例請(qǐng)參閱圖1，一種高靈敏度顯色鱟試劑盒，其盒體1內(nèi)包含二瓶鱟試劑2， 二瓶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品3，二瓶顯色基質(zhì)9，二瓶第一偶氮化試劑4，二瓶第二偶氮化試劑5，二瓶第三偶氮化試劑6，一瓶反應(yīng)終止劑7，二瓶細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水8，其中鱟試劑裝量為0. 5ml-2. ^iil，經(jīng)冷凍干燥后密封于玻璃管制瓶或安瓿中；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，效價(jià)為5EU-200EU，經(jīng)冷凍干燥后密封于玻璃管制瓶或安瓿中；顯色基質(zhì)為帶有對(duì)硝基苯胺基團(tuán)的三肽或四肽，裝量為0. 5ml-2. &ι1，經(jīng)冷凍干燥后密封于玻璃管制瓶或安瓿中；第一偶氮化試劑，為0. 04%亞硝酸鈉，經(jīng)冷凍干燥后密封于玻璃管制瓶或安瓿中；第二偶氮化試劑，為0. 3%氨基磺酸銨，經(jīng)冷凍干燥后密封于玻璃管制瓶或安瓿中；第三偶氮化試劑，為0. 07%萘乙二胺，經(jīng)冷凍干燥后密封于玻璃管制瓶或安瓿中；反應(yīng)終止劑為0. 48Ν鹽酸，裝量為50ml，密封于玻璃瓶中；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，裝量為50ml，密封于玻璃瓶中。本實(shí)用新型的使用方法1.取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一瓶，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，溶解后稀釋成 0. lEU/ml, 0. 05EU/ml, 0. 025EU/ml, 0. 01EU/ml 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；2.按試劑盒標(biāo)示量用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解鱟試劑、顯色基質(zhì)、第二偶氮化試劑和第三偶氮化試劑；3.按試劑盒標(biāo)示量用反應(yīng)終止劑鹽酸溶解第一偶氮化試劑；4.取無(wú)熱原試管，各管分別加入ΙΟΟμΙ陰性對(duì)照(即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水)、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，或樣品；5.各管分別加入ΙΟΟμΙ鱟試劑溶液，混勻，37° C溫育30_60分鐘；6.各管分別加入ΙΟΟμΙ顯色基質(zhì)溶液，混勻，37° C溫育3_8分鐘；7.溫育結(jié)束，各管分別加入500μ1第一偶氮化試劑溶液，混勻；8.各管分別加入500μ1第二偶氮化試劑溶液，混勻；[0035]9.各管分別加入500μ1第三偶氮化試劑溶液，混勻，靜置5分鐘，利用光學(xué)檢測(cè)儀器(如分光光度計(jì))于M5nm波長(zhǎng)處讀取OD值；10.根據(jù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = b X + a，其中處 OD值，X為內(nèi)毒素溶液的濃度，b為直線斜率，a為Y軸截距；11.根據(jù)樣品在M5nm處的OD值讀數(shù)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品的內(nèi)毒素濃度。本實(shí)用新型配套偶氮化染色劑，使顯色鱟試劑產(chǎn)生的顏色由黃色改變?yōu)槊倒寮t色，可以避開(kāi)有色樣品(如黃疸等)的顏色對(duì)顯色反應(yīng)的干擾，最高吸收峰為545nm，檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的靈敏度達(dá)到0. 01EU/ml。以上所記載，僅為利用本創(chuàng)作技術(shù)內(nèi)容的實(shí)施例，任何熟悉本項(xiàng)技藝者運(yùn)用本創(chuàng)作所做的修飾、變化，皆屬本創(chuàng)作主張的專(zhuān)利范圍，而不限于實(shí)施例所揭示者。
權(quán)利要求1.一種高靈敏度顯色鱟試劑盒，其特征在于包括盒體及其內(nèi)的鱟試劑瓶、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品瓶、顯色基質(zhì)瓶、兩支以上的偶氮化試劑瓶、反應(yīng)終止劑瓶及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水瓶，顯色反應(yīng)的顏色為玫瑰紅色，最高吸收峰為M5nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏度顯色鱟試劑盒，其特征在于所述的盒體內(nèi)有二瓶鱟試劑，二瓶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，二瓶顯色基質(zhì)，三組偶氮化試劑瓶，一瓶反應(yīng)終止劑以及二瓶細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高靈敏度顯色鱟試劑盒，其特征在于所述的三組偶氮化試劑瓶分別為亞硝酸鈉瓶、氨基磺酸銨瓶及萘乙二胺瓶且數(shù)量均為二瓶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高靈敏度顯色鱟試劑盒，其特征在于所述顯色基質(zhì)瓶?jī)?nèi)的顯色基質(zhì)為帶有對(duì)硝基苯胺基團(tuán)的三肽或四肽，裝量為0. 5ml-2. 2mL·
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高靈敏度顯色鱟試劑盒，其特征在于所述的反應(yīng)終止劑瓶?jī)?nèi)裝有0. 48N鹽酸，裝量為50ml。
專(zhuān)利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)一種高靈敏度顯色鱟試劑盒，包括盒體及其內(nèi)的二瓶鱟試劑、二瓶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、二瓶顯色基質(zhì)、二瓶第一偶氮化試劑、二瓶第二偶氮化試劑、二瓶第三偶氮化試劑、一瓶反應(yīng)終止劑和二瓶細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。本實(shí)用新型檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的靈敏度高達(dá)0.01EU/ml，比普通顯色鱟試劑的靈敏度高十倍。本實(shí)用新型配套偶氮化染色劑，使顯色鱟試劑產(chǎn)生的顏色由黃色改變?yōu)槊倒寮t色，可以避開(kāi)有色樣品(如黃疸等)的顏色對(duì)顯色反應(yīng)的干擾，具有靈敏度高及干擾性小等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/31GK202189009SQ20112021529
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
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