一組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試劑盒中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學生物檢測、神經退行性病變技術領域，本發(fā)明提供了一組阿爾茲海默病早期診斷或篩查的分子標記物，所述的分子標記物是miR?101?3p、miR?144?5p和let?7g?5p。本發(fā)明還提供了這組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試劑盒中的應用，以及一種無創(chuàng)性、特異性、高靈敏度的對阿爾茲海默氏癥進行早期診斷及篩查的試劑盒和檢測方法。
【專利說明】
一組mi croRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試劑 盒中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學生物檢測、神經退行性病變技術領域，尤其涉及一組microRNAs在 制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試劑盒中的應用，該組microRNAs具體為miR-101-3p、 miR-144-5p和let-7g-5p，本發(fā)明還涉及一種無創(chuàng)性、特異性、高靈敏度的對阿爾茲海默氏 癥進行早期診斷及篩查的試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 阿爾茲海默病(AD)是一種神經退行性病變相關的疾病，約占老年人癡呆病例中 50-60% JD主要的臨床表現為記憶和其他認知功能的缺失。通常，AD患者會遭受10年或更 長時間的病程，最終死于無助的狀態(tài)。AD這么長的持續(xù)患病時間給AD患者，家庭，社會帶來 了經濟和心理上的負擔。AD據統(tǒng)計在2010年就花費了6040億美元。另有統(tǒng)計顯示65歲以上 人群中有5%的人患AD，80歲以上人群中有超過20%的人患AD，90歲以上人群中超過1/3的 人患AD，而且隨著現代的人的生命期望值越來越高，AD將會變成更加流行的一種老年類疾 病，到2050年，全世界將會有超過1.15億的AD患者。AD代表的是一種主要的并且日益嚴重的 公共健康問題，所以很必要去發(fā)現AD新的病理機制為AD患者提供新的治療靶點，并且為AD 的早期診斷和病程預測確定一個新的檢測指標(World Health Organization .Dementia:a Public Health Priority World Health Organization,Geneva,2012)。
[0003] 而目前，AD診斷唯一的金標準是腦組織中淀粉樣蛋白A邱勺沉積。但是，這一過程需 要有創(chuàng)性的腦活檢才能實現。
[0004] MicroRNA(miRNA)是由21-25個核苷酸構成的分子，MicroRNA通過抑制其靶分子 mRNA的翻譯或者促進其降解而起到負性基因表達調控作用。隨著近年研究的不斷深入，人 們發(fā)現血清中大部分微小RNA分子存在于外泌體中并且可以通過外泌體途徑釋放入血，并 且可以穩(wěn)定存在，利于檢測，這就有可能使血清外泌體中的miRNA成為一種新型無創(chuàng)性診斷 分子。與傳統(tǒng)的活檢相比，微創(chuàng)(抽血)或無創(chuàng)(使用尿液或唾液)診斷方法減少了患者的痛 苦和不便，也降低了分析成本。近兩年，多個研究團隊對血液、尿液和唾液中的e xo s ome進行 研究，發(fā)現了多種疾病的生物標志物，有望指導疾病的個性化治療（Lorea Manterola， Elizabeth Guruceaga,et al.A small noncoding RNA signature found in exosomes of GBM patient serum as a diagnostic tool.Neuro-Oncology·2014;0，1-8)〇
[0005] MicroRNA與阿爾茲海默氏癥的研究越來越多，但目前尚無有報道研究利用血清外 泌體中的一組111丨1?熟8(111丨1?-101-3。、111丨1?-144-5。、161：-78-5。)從而替代40診斷的金標準淀粉 樣蛋白仙的水平從而實現對阿爾茲海默氏癥(AD)進行早期診斷。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于尋找到能夠有效用于阿爾茲海默病早期診斷和篩查的一組特 異性分子標記物。本發(fā)明的另一目的在于提供一組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷 試劑或診斷試劑盒中的應用。本發(fā)明的第三目的在于提供一種早期檢測阿爾茲海默氏癥的 檢測方法。
[0007] 本發(fā)明為了解決有創(chuàng)性的阿爾茲海默氏癥診斷的金標準的瓶頸，且能在正常人患 病之前做出風險評估和防治策略，本發(fā)明利用血清外泌體中的mi croRNAs特異性強、靈敏度 高，且在血清中穩(wěn)定存在利于檢測從而作為阿爾茲海默氏癥早期診斷的生物標志物。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供了一組阿爾茲海默病早期診斷或篩查的分子標記物，所 述的分子標記物是 11^1?-101-3。、11111?-144-5。和161：-78-5卩。
[0009] miR-101-3p：uacaguacugugauaacugaa(SEQ ID N0:1)
[0010] miR-144-5p：ggauaucaucauauacuguaag(SEQ ID NO:2)
[0011] let-7g-5p：ugagguaguaguuuguacaguu(SEQ ID N0:3)
[0012] 本發(fā)明通過研究阿爾茲海默氏癥的發(fā)病機理，尋找可以替代診斷金標準淀粉樣蛋 白Αβ水平的miRNAs，并驗證了腦組織中的miRNAs通過外泌體途徑釋放進入外周血中，最終 通過檢測血清外泌體中的mi croRNAs (miR-101_3p、miR-144_5p、let_7g_5p)從而是實現AD 的早期診斷和早期篩查。
[0013]本發(fā)明通過查找AD腦組織的microRNA表達譜芯片結果、生物信息學預須_相關 致病基因（ΑΡΡ、ΑΡ0Ε等）的直接靶向microRNA兩種策略綜合分析，篩選一批AD患者相關的 microRNA作為候選研究基因。
[0014] 本發(fā)明在體外驗證了 Αβ與miRNAs之間的相關性，從而證明我們篩選出的一組 miRNAs(miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p)確實可以替代腦組織中的淀粉樣蛋白Αβ水 平。首先我們選用人神經系統(tǒng)來源的細胞株添加Αβ刺激作為體外模型，發(fā)現ΑΡΡ等Αβ生成基 因的mRNA顯著上調。而3條候選microRNA均呈現明顯下調，二者存在良好負相關性。但是， microRNA和這些靶基因究竟誰調控誰呢？于是，我們首先通過瞬時轉染細胞進行了 miRNA的 過表達和干擾研究，發(fā)現三條候選microRNA均可以引起Αβ生成基因的反向變化。但是，當我 們過表達Αβ生成基因3 ' UTR時，發(fā)現ΑΡΡ，BACE1。也可以引起miRNAs的顯著下調，于是我們進 一步進行了 miRNAs的半衰期分析，證實的確可以促進miRNAs的降解。這就提示我們，Αβ生成 基因也可以反向調控miRNAs的表達豐度。因此，我們初步提出了 miRNAs與Αβ之間的負向調 控機制。m i RNA s可以結合Αβ生成基因的mRNA，促進mRNA降解，但是如果m i RNA s發(fā)生下調。這 種抑制作用就會消失，最終導致Αβ生成與沉積增多。而Αβ增多時，又會促進BACE1，APP的轉 錄，它們又可以反過來結合111；[(^01?嫩8，并促進其降解。這樣11^1?^8與仙有著良好的負相關 性因此可以替代Α邱勺水平從而有可能成為阿爾茲海默氏癥早期診斷的生物標志物。
[0015] 本發(fā)明的第二方面，提供了一組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診 斷試劑盒中的應用，所述的一組 microRNAs 是 11111?-101-3。、11111?-144-5。和161：-78-5卩。
[0016] 所述的診斷試劑，為檢測生物樣品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和 let-7g-5p的含量的試劑的組合。
[0017]所述的診斷試劑盒，包含了檢測生物樣品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含 量和let-7g-5p的含量的試劑。
[0018] 所述的檢測生物樣品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含 量的試劑，選自：對miR-101-3p、miR-144-5p、let-7g-5p具有檢測特異性的PCR引物。
[0019] 較優(yōu)的，miRNA逆轉錄和實時定量PCR檢測引物序列如下：
[0020] miRNA逆轉錄引物：
[0021] miR-101-3p：AAATATGCGGCCGCTCATG(SEQ ID NO:4)
[0022] miR-144-5p：AAATATGCGGCCGCCGAGA(SEQ ID N0:5)
[0023] let-7g-5p：AAATATGCGGCCGCAATTT(SEQ ID N0:6)
[0024] 實時定量PCR檢測引物：
[0025] miR-101-3p：AGTACTTACCGACGAT(SEQ ID NO:7)
[0026] miR-144-5p：GCTCTAAGGCAACGA(SEQ ID N0:8)
[0027] let-7g-5p：TTAAAGGCGAATCGGA(SEQ ID NO:9)
[0028] 通用實時定量PCR引物：TTTATACGCCGGCGAAT(SEQ ID N0:10)
[0029] 所述的生物樣品選自：獲自對象的新鮮組織或細胞、福爾馬林固定或石蠟包埋組 織或細胞、血液或體液等。較優(yōu)的為血漿或血清。
[0030] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種阿爾茲海默氏癥的診斷試劑盒，該試劑盒包含了 檢測生物樣品中miR-101-3p的含量的試劑、miR-144-5p的含量的試劑和let-7g-5p的含量 的試劑。
[0031]本發(fā)明所述的阿爾茲海默氏癥的診斷試劑盒，是由反轉錄系統(tǒng)、引物系統(tǒng)和擴增 系統(tǒng)組成，所述的引物系統(tǒng)包括：
[0032] 通用實時定量PCR引物如SEQ ID N0:10所示；
[0033] miR-101-3p實時定量PCR引物如SEQIDN0:7所示；
[0034] miR-144-5p實時定量PCR引物如SEQIDN0:8所示；
[0035] let-7g-5p實時定量PCR引物如SEQIDN0:9所示。
[0036] 所述的生物樣品選自：獲自對象的新鮮組織或細胞、福爾馬林固定或石蠟包埋組 織或細胞、血液或體液等。較優(yōu)的為血漿或血清。
[0037] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種利用上述診斷試劑盒進行阿爾茲海默氏癥的檢測 方法，所述的檢測方法為:按常規(guī)抽血取血清或血漿，用總RNA提取試劑處理血清或血漿，加 氯仿離心后取上層水相，經異丙醇沉淀及酒精沉淀富集血清或血漿中的小RNA;由反轉錄系 統(tǒng)反轉錄小RNA成cDNA;用擴增系統(tǒng)進行Real-time PCR擴增，測定miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量。
[0038]本發(fā)明通過對100例不同年齡的正常人血樣進行了檢測，證實我們的3條microRNA 有隨年齡逐漸下調的趨勢。
[0039] 本發(fā)明又在正常小鼠上進行了驗證，通過miRNA熒光原位雜交，我們首先發(fā)現小鼠 腦組織中的miRNA隨年齡逐漸下調。而與此同時，Αβ蛋白水平隨年齡上調。但在正常小鼠 心、肺組織中，這些microRNAs隨年齡變化趨勢不明顯，這提示這些microRNA下調具有組織 特異性。
[0040] 隨后，本發(fā)明又在了小鼠外周血的外泌體進行了microRNA的檢測，發(fā)現其與腦組 中的miRNA有著同樣的變化趨勢，所以我們可以看出在正常人和小鼠的外周血中miRNA都有 隨年齡逐漸下調的趨勢。
[0041] 本發(fā)明提供了一種可以無創(chuàng)性的、特異性強、高靈敏度的對阿爾茲海默氏癥進行 早期診斷的方法。該方法主要通過對50例AD患者的血清樣本進行診斷鑒別從而證明由這一 組miRNAs構成的試劑盒的診斷效能及臨床應用價值。
[0042] 本發(fā)明的miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p這三個分子聯(lián)合檢測敏感性及特 異性均高于單個分子單獨檢測（圖3)。
[0043] 本發(fā)明通過檢測血漿或血清中的miR-101-3p、miR-144-5p和let-7g-5p含量的變 化，可以對阿爾茲海默氏癥進行早期診斷和篩查，以便盡早進行臨床干預，防止病情進展。 本發(fā)明為早期診斷阿爾茲海默氏癥、評估正常人患阿爾茲海默氏癥的風險提供了新的手 段。
【附圖說明】
[0044] 圖1:通過高通量測序及生物信息學分析對腦組織及外周血中miRNA進行篩選，其 中A:為利用GE0數據庫的AD患者腦組織和外周血的高通量測序數據進行生物信息學分析， 篩選了 15條共同下調的miRNAs;B:通過生物信息學分析軟件miRanda預測革E1向Αβ生成基因 的miRNAs及它們之間的結合位點;C:通過二者取交集，篩選出3條miRNA作為候選研究對象， 這些miRNA既在AD中是下調的，又同時可以靶向Αβ生成基因。
[0045] 圖2:在體外驗證Αβ與miRNAs的相關性及機制分析，其中Α:人神經系統(tǒng)來源的細胞 株添加Αβ5ιιΜ刺激作為體外模型，HSA作為對照，發(fā)現APP等Αβ生成基因的mRNA顯著上調，而3 條候選microRNA均呈現明顯下調，二者存在良好負相關性；B:通過瞬時轉染細胞進行了 miRNA的過表達和干擾研究，發(fā)現三條候選microRNA均可以引起Αβ生成基因的反向變化;C: 通過過表達Αβ生成基因3 ' UTR時，發(fā)現ΑΡΡ，BACE1，也可以引起miRNAs的顯著下調，于是我們 進一步通過鵝膏覃堿處理抑制體內轉錄進行了 miRNA的半衰期分析，這些基因的3'UTR證實 的確可以促進miRNA的降解;這就提示我們，Αβ生成基因也可以反向調控miRNA的表達豐度。
[0046] 圖3:外周血exo-miRNAs對AD的診斷價值，熒光定量PCR 3條microRNA在AD患者血 清中均出現下調;R0C診斷模型中，3條miRNA聯(lián)合診斷時，診斷效能可以達到0.88。
[0047] 圖4:外周血Exo-microRNA隨年齡的改變，其中A:通過熒光定量PCR對100例不同年 齡的正常人血樣進行了檢測，證實我們的3條microRNA確實有隨年齡下調的趨勢;B:通過熒 光原位雜交，我們將正常小鼠按照月齡分成5個年齡段，結果表明小鼠腦組織中的miRNAs隨 年齡逐漸下調；C:正常小鼠心、肺組織中的microRNA隨年齡變化趨勢不明顯，這提示這些 microRNA下調具有組織特異性。
【具體實施方式】
[0048] 現結合實施例和附圖，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。
[0049] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻方法制備。下列實施例中未注明具 體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克?。簩嶒炇抑改稀罚∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0050] 實施例1:
[0051] 通過高通量測序及生物信息學分析對腦組織及外周血中miRNA進行篩選通過對 PUBMED中GE0數據庫 ：GSE48552、GSE46579、GSE46131高通量測序數據進行分析篩選出在AD 患者腦組織和外周血中15條共同下調的miRNAs，如圖1A所示。
[0052] 然后通過microRNA與RNA相互結合分析軟件miRanda可以從如下網址下載： http://www · microrna · org/microrna/getDownloads · do。下載后按照網站提供的軟件使用 說明使用，具體的，我們將目前廣泛的AD致病基因（APP、PSEN1 /2、APOE BACE1等）的mRNA序 列導入分析軟件，分析其與軟件所收錄的所有人的microRNA的相互結合情況，我們采用 Score Threshold: 140的條件控制指標，得到了與AD致病基因可能有結合的所有miRNA，如 圖1B所示。
[0053] 通過二者取交集，篩選出3條miRNA作為候選研究對象，這些miRNA既在AD中是下調 的，又同時可以靶向Αβ生成基因，如圖1C所示。最終篩選出來的3條11^熟(11^-101-3?、11^-144-5p、let-7g-5p)作為候選研究AD診斷的檢測標志物。
[0054] 實施例2:在體外驗證Αβ與miRNAs的相關性及機制分析
[0055] 1、人神經系統(tǒng)來源細胞系SHSY-5Y細胞培養(yǎng)
[0056]人神經系統(tǒng)來源的神經母細胞瘤細胞（SHSY-5Y，購自中科院細胞所）培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
[0057] 2、在AD的體外模型中Αβ與miRNA呈現出良好的負相關性
[0058] 當細胞密度達到約70%，對SHSY-5Y細胞添加A抑太(Bachem，Torrance CA)5uM刺激 作為體外AD模型，模擬體內環(huán)境，同濃度的人血清白蛋白（HAS)作為陽性陰性對照。
[0059] 48h后收集細胞抽提RNA后逆轉錄誠cDNA后進行qRT-PCR檢測。結果如圖2A所示在 轉染過A抑太的細胞中，Αβ的生成基因與miRNA呈現出良好的負相關性，Αβ的生成基因表達增 加，miRNA表達降低。
[0060] 3、當細胞密度達到約50%，利用Lipofectamine2000試劑（美國Invitrogene公 司），按照轉染試劑說明書的步驟和試劑比例，在SHSY-5Y細胞中轉入miRNA的mimics，結果 如圖2B所示，A邱勺生成基因發(fā)生明顯的下調。
[0061 ] 4、當細胞密度達到約50%，利用Lipofectamine2000試劑（美國Invitrogene公 司），按照轉染試劑說明書的步驟和試劑比例，在SHSY-5Y細胞中轉入Αβ的生成基因的3 ' UTR，結果如圖2C所示，3條miRNA均發(fā)生明顯的下調。
[0062] U6的引物：
[0063] P1：GTAACCCGTTGAACCCCATT(SEQ ID NO:11)
[0064] P2:CCATCCAATCGGTAGTAGCG(SEQ ID NO:12)
[0065] PCR 產物：200bp。退火溫度：55°C
[0066] miRNA的引物如下：
[0067] miR-101-3p：AGTACTTACCGACGAT(SEQ ID NO:7)
[0068] miR-144-5p：GCTCTAAGGCAACGA(SEQ ID N0:8)
[0069] let-7g-5p：TTAAAGGCGAATCGGA(SEQ ID NO:9)
[0070] 通用實時定量PCR引物：TTTATACGCCGGCGAAT(SEQ ID N0:10)
[0071] PCR 產物：135bp。退火溫度：55°C
[0072] 5、合成引物及構建pcDNA3.1-APP 3'UTR真核表達載體
[0073] (1)設計引物
[0074] APP 3'UTR XhoIF:
[0075] 5，CCGCTCGAG GCCTGGTCGGCTCACCGCCTATC 3，（SEQ ID N0:13)APP 3，UTR NotIR:
[0076] 5'ATAAGAATGCGGCCGCTAAAGAATTGGATATTTTTTAATGCAAATTG 3'（SEQ ID N0:14)
[0077]酶切位點為Xhol和Notl，分別加入引物的5'端，并加入酶切位點的保護堿基。
[0078] (2)PCR擴增目的片段
[0079] 在0.2mL EP管中配制以下體系，基因組DNA模板原液稀釋20倍后取0.5yL擴增 F11R：
[00811 取5ylPCR產物，做1%瓊脂糖凝膠電泳(含EB 0.5μg/ml;電壓:80V)鑒 [0082]定;其余用于回收、純化目的片段。
[0083] (3)回收純化目的片段
[0084] PCR產物經1%凝膠電泳后，在紫外燈下，用手術刀切取含目的基因片段的凝膠條 帶至干凈1.5ml0D管中，稱重后，按100mg凝膠對應100yL溶液BD的比例向離心管中加入溶液 BD。60 °C水浴1 Omin至凝膠完全溶化，水浴期間振蕩混合3次。將溶液轉移至DNA純化柱中，靜 置2min，室溫12 OOOrpm離心lmin，棄濾液。向柱上加入500yL溶液PE，室溫12000rpm離心 lmin，棄濾液。重復上一操作一次。室溫空柱12000rpm離心lmin以徹底去除純化柱中殘留的 液體。將柱子置于新的1.5mL EP管上，向柱中央加入30yL 60°C預熱的無菌水，13400g離心 lmin以洗脫出DNA。
[0085] (4)重組質粒的鑒定及保存
[0086]分別回收、純化經Xhol和Notl雙酶切后的載體片段和目的片段。所得DNA各自溶于 30μ1 ddH20中，1%瓊脂糖凝膠電泳(含EB 0.5μg/ml;電壓:80V)鑒定，-20°C保存。
[0087]用T4DNA連接酶重組連接酶切后的載體片段和目的片段，形成pcDNA3.1-APP 3' UTR重組質粒。用上述重組質粒轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，擴增細菌并測序，測序正確。 [0088] 轉化步驟如下：
[0089]用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μ1轉移到無菌的微量離心管 中，每管加10μ1連接液，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。將管放到預加溫到42 °C的循環(huán)水浴中放好的ΕΡ管架上，恰恰放置90秒，不要搖動ΕΡ管架。快速將管轉移到冰浴 中，使細胞冷卻1-2分鐘。每管加800μ1 LB培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37°C，然后將管轉 移到37°C搖床上，溫育45分鐘使細菌復蘇。將150μ1已轉化的感受態(tài)細胞轉移到氨芐抗性 (100ug/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
[0090]將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，16小時。長出的克隆進 行后續(xù)PCR鑒定。
[0091] 6、pcDNA3.1-APP 3'UTR感染人人神經系統(tǒng)來源細胞系SHSY-5Y。
[0092]實驗前保證細胞的良好生長狀態(tài)，實驗前一天接種5 X104個目的細胞于12孔培養(yǎng) 板中，所加培養(yǎng)基體積為〇. 5ml。待細胞生長至60-70%時準備進行pcDNA3.1-APP 3 'UTR和 pcDNA3.1-NC 轉染。
[0093] 轉染步驟如下：
[0094] 取97ulDMEM到lml 0D管中，加入3ul fugen-6到DMEM中，用加樣槍混勻或拿手指輕 輕彈動，之后室溫放置5分鐘。同時去1微克質粒加入到總體積100微升的DMEM中，輕輕混勻， 靜置5分鐘。5分鐘后，將兩種液體用槍混勻，室溫放置30分鐘。30分鐘后用100ul槍吸出反應 液，均勻的滴入12孔板中，輕輕拍打，放入培養(yǎng)箱。培養(yǎng)過夜后，第二天早上換正常培養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng)并用G418篩選陽性克隆。
[0095] 實施例3:外周血exo-miRNAs對AD的診斷價值
[0096] 50例AD患者的病例資料如下表所示。
[0097] 50例AD患者及年齡匹配健康人基本信息
[0099] **P < 0.01 compared to controls
[0100] 50例AD患者及年齡匹配健康人基本信息，通過同年齡匹配的人作為對照，對照與 患者之間除了 MMSE分數(精神狀態(tài)評分)其余指標都沒有統(tǒng)計學差異。
[0101] 用SBI公司的EX0Q5A-1血清外泌體提純試劑盒對AD患者血清中的外泌體進行純 化，后對外泌體中的miRNA進行提取，通過熒光定量PCR對50例AD患者及年齡匹配健康人的 血清外泌體中3條microRNA進行檢測
[0102] 具體方法如下：
[0103] 1)按照SB I公司EX0Q5A-1血清外泌體提純試劑盒的標準說明書對血清中的外泌體 進行純化，后對其中的miRNA進行提取。
[0104] 2)實時PCR檢測的AD患者及年齡匹配健康人的血清外泌體中3條microRNA表達量。 [0105] (1)抽提不同樣本血清外泌體中的總RNA，逆轉錄為cDNA。
[0106] (2)設計引物，檢測3條miRNA表達水平。U6作為檢測用內參。
[0107]引物序列如下：
[0108] U6的引物：
[0109] P1:GTAACCCGTTGAACCCCATT(SEQ ID NO:11)
[0110] P2:CCATCCAATCGGTAGTAGCG(SEQ ID NO:12)
[0111] PCR 產物：200bp。退火溫度：55°C
[0112] miRNA的引物如下：
[0113] miR-101-3p：AGTACTTACCGACGAT(SEQ ID NO:7)
[0114] miR-144-5p：GCTCTAAGGCAACGA(SEQ ID N0:8)
[0115] let-7g-5p：TTAAAGGCGAATCGGA(SEQ ID NO:9)
[0116] 通用實時定量PCR引物：TTTATACGCCGGCGAAT(SEQ ID N0:10)
[0117] PCR 產物：135bp。退火溫度:55°C
[0118] 熒光定量PCR體系如下：
[0122] PCR產物含量計算采用比較Ct值法進行相對定量。比較Ct值法前提是假設每個循 環(huán)增加一倍的產物數量，在PCR反應的指數期得到Ct值來反應起始模板的量，一個循環(huán)(Ct =1)的不同相當于起始模板數2倍的差異。
[0123] 定義：Δ Ct = Ct_<^|-Ct|^示
[0124] Δ Δ Ct = (Ct目白麵-Ctftt示睡_(Ct目白麵-Ctftt示)刺涯
[0125] RQ = 2-A Δ Ct
[0126] 利用EXCEL里面的統(tǒng)計分析工具，計算各組的平均值和標準差，兩組之間用T檢驗， Ρ〈0.05認為有統(tǒng)計學意義，Ρ〈0.01認為差異顯著。將第3天、5天和7天分別和第1天進行比 較，進行Τ檢驗分析。如圖3所示。
[0127] 實驗結果表明，通過同年齡匹配的正常人作為對照，可以看出AD患者血清外泌體 中的miRNA均發(fā)生明顯下調，通過R0C模型看出，當3條miRNAs同時做為AD診斷標志物的時候 診斷效能最尚。
[0128] 實施例4:外周血Exo-microRNA隨年齡的改變
[0129] 首先對100例不同年齡段的正常人的血清外泌體中的miRNA按上述方法進行檢測， 結果如圖4A所示，可以發(fā)現正常人血清外泌體中的miRNAs隨著年齡表達量逐漸降低。
[0130] 而后我們在小鼠的腦組織和血清外泌體也進行了 mi RNA的檢測，動物實驗接近臨 床試驗，結果如圖4B所示。同時我們也對小鼠的其他器官進行了 miRNA的檢測，結果如圖4C 所示，可以看出隨著小鼠月齡的增加，miRNA并沒有表現出一個很明顯的變化趨勢，這就提 示小鼠腦組織和血清外泌體中的miRNA隨年齡的變化是具有組織特異性的。
[0131] 實驗所用小鼠C57品系，SPF級。體重約15~45g，1-9月齡均有，購自上海實驗動物 中心。共30只小鼠，分5組，每組6只。
[0132] 小鼠腦組織中miRNA的熒光原位雜交實驗，探針為自己體外轉錄合成。
[0133] 具體方法如下：
[0134] 1)探針變性
[0135] 將探針在75°C恒溫水浴中溫育5min，立即置0°C，5~1 Omin，使雙鏈DNA探針變性。
[0136] 2)標本變性
[0137] ①將制備好的染色體玻片標本于50°C培養(yǎng)箱中烤片2~3h。（經Giemsa染色的標本 需預先在固定液中退色后再烤片）。
[0138] ②取出玻片標本，將其浸在70~75°C的體積分數70%甲酰胺/2 XSSC的變性液中 變性2~3min。
[0139] ③立即按順序將標本經體積分數70%、體積分數90%和體積分數100 %冰乙醇系 列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
[0140] 3)雜交
[0141] 將已變性或預退火的DNA探針10yL滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18X18 蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37°C雜交過夜(約15~17h)。由于雜交液較少，而 且雜交溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進行。
[0142] 4)洗脫
[0143] 此步驟有助于除去非特異性結合的探針，從而降低本底。
[0144] (1)雜交次日，將標本從37°C溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。（2)將已雜交 的玻片標本放置于已預熱42~50°C的體積分數50%甲酰胺/2 X SSC中洗滌3次，每次5min。
[0145] (3)在已預熱42~50°C的1XSSC中洗滌3次，每次5min。
[0146] (4)在室溫下，將玻片標本于2 XSSC中輕洗一下。
[0147] (5)取出玻片，自然干燥。
[0148] (6)取200yL復染溶液(ΡΙ/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻片標本上，蓋 上蓋玻片。
[0149] 5)雜交信號的放大(適用于使用生物素標記的探針）
[0150] (1)在玻片的雜交部位加150yL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37°C溫育20min。
[0151] (2)去掉保鮮膜，再加150yL avidin-FITC于標本上，用保鮮膜覆蓋，37°C繼續(xù)溫育 40min〇
[0152] (3)取出標本，將其放入已預熱42~50 °C的洗脫液中洗滌3次，每次5min。
[0153] (4)在玻片標本的雜交部位加150yL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37°C溫育20min。
[0154] (5)去掉保鮮膜，加150yL antiavidin于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37°C溫育 40min〇
[0155] (6)取出標本，將其放入已預熱42~50°C的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。
[0156] (7)重復步驟(1)、（2)、（3)，再于2父55(：中室溫清洗一下。
[0157] (8)取出玻片，自然干燥。
[0158] (9)取200yL ΡΙ/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。
[0159] 6)封片
[0160] 可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol (可使封片液產生自封閉 作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標 本可以在-20~-70 °C的冰箱中的暗盒中保持數月之久。
[0161] 7)熒光顯微鏡觀察FISH結果
[0162] 先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，FITC的激 發(fā)波長為490nm。細胞被PI染成紅色，而經FITC標記的探針所在的位置發(fā)出綠色熒光。結果 如圖4B所示隨著小鼠月齡增加，綠色熒光強度越來越弱，提示miRNA表達水平下調。
[0163] 以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。
【主權項】
1. 一組阿爾茲海默病早期診斷或篩查的分子標記物，所述的分子標記物是miR-101-3p、miR-144_5p和let_7g_5p。2. -組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試劑盒中的應用，所述的一 組 microRNAs 是 11111?-101-3卩、11111?-144-5卩和161：-7區(qū)-5卩〇3. 根據權利要求2所述的一組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試劑 盒中的應用，其特征在于，所述的診斷試劑為檢測生物樣品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量的試劑的組合。4. 根據權利要求2所述的一組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試劑 盒中的應用，其特征在于，所述的診斷試劑盒包含了檢測生物樣品中miR-101-3p的含量、 miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量的試劑。5. 根據權利要求3或4所述的一組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試 劑盒中的應用，其特征在于，所述的檢測生物樣品中miR-101-3p的含量、miR-144-5p的含量 和let-7g-5p的含量的試劑為對miR-101-3p、miR-144-5p、let-7g-5p具有檢測特異性的PCR 引物。6. 根據權利要求6所述的一組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試劑 盒中的應用，所述的引物序列如下： miRNA逆轉錄引物： miR-10l-3p：AAATATGCGGCCGCTCATG(SEQ ID N0:4) miR-144-5p：AAATATGCGGCCGCCGAGA(SEQ ID N0:5) let-7g-5p：AAATATGCGGCCGCAATTT(SEQ ID NO:6) 實時定量PCR檢測引物： miR-101-3p：AGTACTTACCGACGAT(SEQ ID NO:7) miR-144-5p：GCTCTAAGGCAACGA(SEQ ID N0:8) let-7g-5p：TTAAAGGCGAATCGGA(SEQ ID NO:9) 通用實時定量PCR引物：TTTATACGCCGGCGAAT(SEQ ID N0:10)。7. 根據權利要求3或4所述的一組microRNAs在制備阿爾茲海默氏癥診斷試劑或診斷試 劑盒中的應用，其特征在于，所述的生物樣品選自：獲自對象的新鮮組織或細胞、福爾馬林 固定或石蠟包埋組織或細胞、血液或體液。8. -種阿爾茲海默氏癥的診斷試劑盒，該試劑盒包含了檢測生物樣品中miR-101-3p的 含量的試劑、miR-144-5p的含量的試劑和let-7g-5p的含量的試劑。9. 根據權利要求8所述的一種阿爾茲海默氏癥的診斷試劑盒，其特征在于，該試劑盒是 由反轉錄系統(tǒng)、引物系統(tǒng)和擴增系統(tǒng)組成，所述的引物系統(tǒng)包括： 通用實時定量PCR引物如SEQ ID NO: 10所示； miR-101-3p實時定量PCR引物如SEQ ID N0:7所示； miR-144-5p實時定量PCR引物如SEQIDN0:8所示； let-7g-5p實時定量PCR引物如SEQIDN0:9所示。10. -種利用如權利要求8或9所述的阿爾茲海默氏癥的診斷試劑盒進行的檢測方法， 其特征在于，所述的檢測方法為：按常規(guī)抽血取血清或血漿，用總RNA提取試劑處理血清或 血漿，加氯仿離心后取上層水相，經異丙醇沉淀及酒精沉淀富集血清或血漿中的小RNA;由 反轉錄系統(tǒng)反轉錄小RNA成cDNA;用擴增系統(tǒng)進行Real-time PCR擴增，測定miR-101-3p的 含量、miR-144-5p的含量和let-7g-5p的含量。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950705SQ201510163639
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2015年4月8日
【發(fā)明人】張鳴科, 徐辰, 劉厚奇, 王越, 尹又, 吳曦, 李耀明, 方碩
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學