專利名稱：蘆薈色苷d和有效組分，及其制法、藥物組合物與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，確切地說蘆薈中有效成份蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物和富含蘆薈色苷D有效組分，可期待制成對(duì)抗老年癡呆癥的有效藥物。
背景技術(shù)：
老年癡呆癥，又名阿爾茲海默氏癥(Alzheimer‘s disease，AD)的發(fā)病在人口老齡化的中國(guó)成為越來越嚴(yán)重的問題，病理機(jī)制研究認(rèn)定β-淀粉樣蛋白(Aβ)的非正常堆積是老年癡呆癥最重要的成因。β-分泌酶是與老年癡呆癥的發(fā)病和進(jìn)行密切相關(guān)的一個(gè)新靶點(diǎn)。它可將淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)裂解成40肽或42肽的Aβ；在動(dòng)物體內(nèi)證明，β-分泌酶的抑制劑可以大大降低Aβ的水平，并改善與AD類似的發(fā)病癥狀?，F(xiàn)已報(bào)道的β-分泌酶抑制劑絕大多數(shù)是多肽和擬肽類化合物，僅有少數(shù)是合成的小分子雜環(huán)化合物。從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的抑制劑僅在2003年11月才有第一次報(bào)道(兒茶酚類化合物，IC5010-6M水平)。在藥理篩選過程中，我們發(fā)現(xiàn)蘆薈屬植物蘆薈的提取物具有較好的抑制β-分泌酶的活性(10-5μg/mL水平)，雖然蘆薈的化學(xué)成分因品種而有很大差異，而且對(duì)蘆薈已有不少化學(xué)成分研究，但從中發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)的β-分泌酶抑制劑卻尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們對(duì)其β-分泌酶抑制活性進(jìn)行了考察，結(jié)果表明色原酮苷類化合物蘆薈色苷D為蘆薈中抑制β-分泌酶的主要有效成份，而蘆薈色苷D含量在80％的有效組分也具有顯著的β-分泌酶抑制活性和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性，可用于治療老年癡呆癥。其特點(diǎn)是1)有效成份和有效組分明確；2)作用顯著，機(jī)制明確；3)結(jié)果穩(wěn)定，各實(shí)驗(yàn)結(jié)果均可重復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供蘆薈中有效成份蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物和有效組分的制備方法、藥理活性和醫(yī)藥用途，它包括1.蘆薈有效成份蘆薈色苷D，其特征為蘆薈有效成分——蘆薈色苷D，結(jié)構(gòu)式如下 蘆薈色苷D2.上述蘆薈有效成份蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其特征在于蘆薈色苷D的三維空間化學(xué)結(jié)構(gòu)，蘆薈色苷D的色原酮苷類衍生物的三維空間化學(xué)結(jié)構(gòu)。
3.上述蘆薈有效成份及其衍生物和有效組分的藥理活性，其特征在于上述有效成分及其衍生物和有效組分不僅具有較好的β-分泌酶抑制活性，還具有抗氧化活性(蘆薈色苷D的活性水平在10-6μg/mL)，可對(duì)抗Aβ聚合過程中產(chǎn)生的游離基對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。因此，上述有效成分及其衍生物和有效組分有可能從減少Aβ生成和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞兩個(gè)機(jī)理對(duì)抗老年癡呆癥4.上述蘆薈有效成份及其衍生物和有效組分的醫(yī)藥用途，其特征為上述有效成分及其衍生物和有效組分可作為制備治療和預(yù)防老年癡呆癥的有效藥物。
5.上述蘆薈有效成份及其衍生物和有效組分的制備方法、檢測(cè)方法和有效成份含量測(cè)定方法。其特征在于a.蘆薈有效組分AV(蘆薈色苷D含量為30％～50％)的制備方法，95％的乙醇水溶液熱回流提取三次，回收乙醇水溶液，提取液濃縮后用5％的乙醇水溶液溶解，用大孔吸附樹脂作為層析材料，經(jīng)過不同濃度的乙醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，定量收集洗脫液，濃縮，薄層層析檢查，收集40％～60％乙醇洗脫液，即含蘆薈色苷D的組分，回收溶劑即得。(其中所用醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、碳鏈小于32烷醇、碳鏈小于32烯醇及苯酚等；其中所用大孔樹脂包括各種非極性、弱極性、中極性、極性的國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口大孔吸附樹脂。)b.蘆薈有效組分AV中有效成份蘆薈色苷D的薄層檢查方法薄層板為GF254正相硅膠薄層板，展開劑為氯仿∶甲醇∶水(80∶20∶2)三相溶劑系統(tǒng)，觀察方法是在波長(zhǎng)為254nm的紫外燈下，蘆薈色苷D呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。
c.蘆薈有效組分AV中有效成份蘆薈色苷D的HPLC含量測(cè)定方法分析柱為反相C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水(40∶60)系統(tǒng)，流速1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，用外標(biāo)法法確定有效成分蘆薈色苷D的含量。
6.上述蘆薈有效成份及其衍生物和有效組分，其特征為a.上述蘆薈有效成份蘆薈色苷D的及其衍生物和有效組分，包括加入各種輔料的各種片劑、顆粒劑、膠囊劑、緩釋劑等口服制劑和注射水針劑、粉針劑、凍干劑等注射制劑。
b.各種輔料包括葡萄糖、蔗糖、微晶纖維素、各種高分子輔料等。
c.其緩釋制劑包括緩釋包衣微丸劑、緩釋骨架片劑、緩釋脈沖釋放片劑、緩釋滲碳透泵片劑、緩釋包衣片劑等口服緩釋、控釋劑型。其中應(yīng)用的緩釋包衣技術(shù)包括PH依賴型緩釋包衣技術(shù)、溶蝕延遲包衣技術(shù)、基于結(jié)腸酶降解緩釋包衣技術(shù)等。
d.在制備工藝和制劑中加入抗氧化劑，防止蘆薈有效組分的分解和變化，抗氧化劑包括各種水溶性抗氧化劑和脂溶性抗氧化劑，及其混合使用。水溶性的抗氧化劑包括Vc、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鹽、硫代硫酸鈉、甲醛合亞硫酸氫鈉、硫脲、半胱氨酸、蛋氨酸、硫代乙酸、硫代甘油等；脂溶性抗氧化劑包括叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)、二丁甲苯酚(BHT)、培酸丙酯(PG)、生育酚(Ve)、卵磷脂等，抗氧化劑的加入量為制劑總量的0.01％-95％。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將蘆薈醇提物精制提純得到有效成份蘆薈色苷D和制備為有效成份含量在30％-50％的有效組分，可以除去大量蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、有機(jī)酸等雜質(zhì)，藥效明確，副作用小，提供了可期待用于治療和預(yù)防老年癡呆癥的醫(yī)藥用途的有效部位，本實(shí)驗(yàn)發(fā)明的制備方法，為進(jìn)一步制成藥物劑型奠定了基礎(chǔ)。


圖1.有效組分AV對(duì)靜息狀態(tài)下PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響在無Mg2+的Hanks液中，各種不同濃度有效組分AV對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無影響；在有Mg2+的Hanks液中，10ug/ml的有效組分AV能降低Hanks液中PC12細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度。結(jié)果用平均值±SD表示，n＝4，*P＜0.05。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)圖2.有效組分對(duì)于由KCl刺激引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升的影響將預(yù)先給AV或不給AV的細(xì)胞經(jīng)Fura-2負(fù)載后用含100mmol/L KCl的培養(yǎng)液吻孵。結(jié)果用平均值±SD表示，**P＜0.01。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)
圖3.SH-SY5Y細(xì)胞用64mmol NaN3孵育4小時(shí)后，再用10μmol/L JC-1負(fù)載。用Polarstar在激發(fā)波長(zhǎng)490nm處檢測(cè)535nm和595nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度。結(jié)果用紅色熒光/綠色熒光值的平均值±SD表示。n＝4，*P＜0.05。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)圖4.在96孔板中加入線粒體，用不同濃度的有效組分溫孵，然后在孔中加入5μmol/L resazurin，經(jīng)孵育30分鐘后檢測(cè)熒光強(qiáng)度(530nm激發(fā)光/590nm發(fā)射光)。結(jié)果用平均值±SD表示，n＝4，*P＜0.05。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)圖5.有效組分AV對(duì)由半胱氨酸亞鐵誘導(dǎo)的大鼠腦組織中MDA生成量的影響的體外實(shí)驗(yàn)。半胱氨酸亞鐵50μmoL/L硫酸亞鐵，200μmol/L半胱氨酸。結(jié)果用平均值±SD表示，n＝4，**P＜0.01。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)。
圖6.在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，有效組分對(duì)大鼠尋找平臺(tái)時(shí)間的影響。結(jié)果用平均值±SD表示，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)。
圖7.在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的最后一天，將平臺(tái)撤走后，觀察有效組分AV對(duì)大鼠停留在原來放置平臺(tái)象限的停留時(shí)間的影響。結(jié)果用平均值±SD表示，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)。
圖8.在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的最后一天，將平臺(tái)撤走后，觀察有效組分AV對(duì)大鼠尋找平臺(tái)總距離的影響。結(jié)果用平均值±SD表示，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)。
圖9.在穿梭箱實(shí)驗(yàn)中，有效組分AV對(duì)大鼠被動(dòng)反應(yīng)次數(shù)的影響。結(jié)果用平均值±SD表示，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)。
圖10.在穿梭箱實(shí)驗(yàn)中，有效組分AV對(duì)大鼠被動(dòng)反應(yīng)時(shí)間的影響。結(jié)果用平均值±SD表示，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01。(有效組分AV的3個(gè)濃度，AV10.1ug/ml，AV21ug/ml，AV310ug/ml)。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例具體顯示本發(fā)明的應(yīng)用。但本實(shí)施例不限定本發(fā)明的使用范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1.庫(kù)拉索蘆薈有效組分AV的制備庫(kù)拉索蘆薈(Aloe vera L.)粗提取物干粉20g粉碎后過60目篩。樣品先用130ml乙醇溶解，再用2600ml水稀釋，即將樣品溶解于5％乙醇水溶液中。按樣品∶層析材料(1∶30)的倍數(shù)，用SP825型大孔樹脂(三菱公司產(chǎn)品)600g裝柱。將溶解好的樣品加到柱上，先依次用水(5L)、10％乙醇(13L)、30％乙醇洗脫(45L)，然后用50％乙醇(1.8L)洗脫，每1000ml收集一份，每份用薄層層析檢查，展開劑為氯仿∶甲醇∶水(80∶20∶2)，在254nm紫外燈下觀察，收集含有aloeresinD呈現(xiàn)藍(lán)色熒光斑點(diǎn)的組分，為庫(kù)拉索蘆薈有效組分5g。
實(shí)施例2.有效組分中有效成份蘆薈色苷D的含量測(cè)定方法色譜條件分析柱為反相C18柱(kromasil，5μm)，流動(dòng)相為甲醇∶水(40∶60)系統(tǒng)，流速1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，方法外標(biāo)法操作用蘆薈色苷D標(biāo)準(zhǔn)品配制5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度范圍在0.1mg/ml～1.0mg/ml之間。以樣品濃度和峰面積的相關(guān)關(guān)系，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程。精密稱取有效部分樣品1.18mg，溶解于1ml甲醇，配制成1.18mg/mll待測(cè)樣品，根據(jù)線性方程，以峰面積計(jì)算有效部分中蘆薈色苷D的含量。
線性方程y＝8784x-668.26(R2＝0.9965)有效部分中蘆薈色苷D的峰面積為4188.78076有效部分中蘆薈色苷D的含量為46.86％。
實(shí)施例3.蘆薈色苷D的制備及光譜數(shù)據(jù)庫(kù)拉索蘆薈(Aloe vera L.)粗提取物，經(jīng)硅膠柱層析(200目)，氯仿-甲醇-水(80∶20∶2)溶劑系統(tǒng)洗脫，分成I-V五個(gè)部分。第II部分進(jìn)一步硅膠柱層析(200目)，氯仿-甲醇梯度洗脫得到化合物蘆薈色苷D。
化合物蘆薈色苷D，白色無定型粉末，m.p.154℃；[α]22D-156.3°(c 0.71，MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)＝213(4.52)，228(4.58)，242 sh(4.28)，252(4.34)，300(4.54)nm；IR(KBr)vmax＝3400，1700，1640，1600，1510，1380，1170cm-1；C29H32O11，F(xiàn)ABMS m/z＝557[M+H]+，308，290，154，136；，713.2017)；1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)，見附表I。
附表I.蘆薈色苷D的核磁共振光譜數(shù)據(jù)(500兆赫茲，溶劑氘代甲醇)

藥理實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1 β-分泌酶抑制實(shí)驗(yàn)試劑a重組人BACE-1b熒光底物IVc0.1M醋酸緩沖液(PH 4.0)儀器384孔熒光測(cè)定微板Fluostar galaxy微板光學(xué)測(cè)定儀實(shí)驗(yàn)步驟在384孔板中依次加入樣品5ul、緩沖液5ul、酶稀釋液20ul、底物稀釋液20ul?？瞻卓字胁患訕悠芳懊赶♂屢海镁彌_液代替。標(biāo)準(zhǔn)孔中不加樣品，用緩沖液代替。于384孔板中混勻，25℃條件下Ex＝320nm，Em＝405nm處測(cè)熒光，2分鐘一個(gè)循環(huán)，共測(cè)10個(gè)循環(huán)，計(jì)算熒光值變化斜率作為酶活性。與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照比較計(jì)算化合物對(duì)β-分泌酶的抑制率。
結(jié)果評(píng)價(jià)β-分泌酶抑制率＝〔(標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照酶活性-空白酶活性)-(樣品酶活性-空白酶活性)〕/(標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照酶活性-空白酶活性)*100％結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)例有效部位和有效成分的神經(jīng)保護(hù)藥理實(shí)驗(yàn)?zāi)夸?.Glu誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型2.[Ca]2+i測(cè)定靜息狀態(tài)①Hanks solution[Ca]2+i降低②Hanks solution(Mg2+free)[Ca]2+I無明顯影響③D-Hanks solution[Ca]2+I無明顯影響KCl誘導(dǎo)鈣內(nèi)流+Glu誘導(dǎo)鈣內(nèi)流-3.對(duì)疊氮鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響線粒體膜電位測(cè)定(MMP)+刃天青法測(cè)定AV對(duì)線粒體氧化還原能力的影響+4.對(duì)線粒體氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用MDA生成測(cè)定GSH含量測(cè)定H-ATP酶活性測(cè)定5.細(xì)胞凋亡抑制活性1)血清撤除誘導(dǎo)原代神經(jīng)細(xì)胞凋亡-2)MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡-3)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷+6.抗衰老體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1)Morris水迷宮2)穿梭箱實(shí)驗(yàn)注+為有效，-為無效細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)定靜息狀態(tài)于96孔板加入PC12細(xì)胞懸液90μl/孔，與5μmol.L-1Fura-2/AM在37℃恒溫震蕩35min。負(fù)載結(jié)束后，分別以含0.2％BSA Hanks、不含Mg2+的0.2％BSA Hanks液洗兩次，調(diào)細(xì)胞懸液為2×106個(gè)/ml。Fura-2的最大激發(fā)波長(zhǎng)是380nm，與Ca2+結(jié)合后的最大激發(fā)波長(zhǎng)是340nm，發(fā)射波長(zhǎng)是500nm。用FLUO-STAR熒光計(jì)進(jìn)行熒光檢測(cè)。加入Triton X-100破碎細(xì)胞膜，震蕩混勻后測(cè)定熒光，此時(shí)為Ca2+飽和時(shí)熒光強(qiáng)度。加入EGTA絡(luò)合細(xì)胞內(nèi)鈣，震蕩混勻后測(cè)定熒光，此時(shí)為零Ca2+時(shí)熒光強(qiáng)度。
按下式計(jì)算Ca2+濃度[Ca2+]＝KDa*(R-Rmin)/(Rmax-R)*(Ff2/Fb2)R＝F340/F380其中KDa是Fura-2與Ca2+的解離常數(shù)，為224nmol.L-1。
Ff2、Fb2分別是零Ca2+和Ca2+飽和時(shí)380nm處熒光值。
藥物處理細(xì)胞負(fù)載結(jié)束后，預(yù)先加入AV(終濃度分別為0.1ug/ml，1ug/ml，10ug/ml)溫孵5分鐘后，分別加入刺激劑KCl，谷氨酸(Glu)，立即測(cè)定熒光變化。
結(jié)果見圖1表1圖1的原始數(shù)據(jù)


結(jié)果見圖2
表2圖2的原始數(shù)據(jù)

對(duì)疊氮鈉誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響線粒體膜電位測(cè)定(MMP)細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所提供。SH-SY5Y細(xì)胞以完全1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml)，于37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液一次。
線粒體膜電位(Δψ)的測(cè)定JC-1為一種特異性的陽離子熒光染料，可定位在線粒體膜上，其激發(fā)光為490nm，單體發(fā)射光為527nm，聚集體發(fā)射光為590nm，其聚集程度與膜電位成正比。當(dāng)線粒體膜電位增高時(shí)，紅色熒光增強(qiáng)，紅色熒光和綠色熒光的比值可代表膜電位的高低。細(xì)胞處理如上所示，與64mmol·L-11疊氮鈉孵育4小時(shí)后，用Hank’s液漂洗細(xì)胞一次，然后與10μmol·L-1的JC-1 37℃負(fù)載15min，PBS洗二次后于熒光顯微鏡下觀察拍照。并在Polastar上測(cè)定其熒光值(Fluostar galaxy software)，以紅色熒光值與綠色熒光值的比值的大小來表示膜電位的高低。
刃天青法測(cè)定AV對(duì)線粒體氧化還原能力的影響腦線粒體提取取大腦皮層，稱重，轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中，加入MSETB緩沖液10ml/g組織，(MSETB緩沖液210mmol·L-1mannitol，70mmol·L-1sucrose，0.5m mol·L-1EDTA，10m mol·L-1Tris-HCl and 0.2％bovine serum albumin，pH 7.4)，手動(dòng)勻漿10次。所得勻漿液以2000g離心3min，取上清離心12000g，8min。以MSETB緩沖液將所得沉淀洗滌一次(離心12000g×10)，所得沉淀即為線粒體。將沉淀按10∶1(v/w)懸于SET緩沖液中，SET緩沖液(280mmol·L-1sucrose，0.5mmol·L-1EDTA and 10mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.4)，離心10min。最后將沉淀懸于SET緩沖液中，整個(gè)線粒體制備過程均在4℃進(jìn)行。以Lowry法測(cè)定蛋白含量。
刃天青法檢測(cè)線粒體氧化還原能力在96孔板中加入線粒體5μg蛋白/孔，加入不同濃度的紅景天甙，resazurin 5μmol·L-1，立即在Polastar測(cè)定儀上測(cè)定熒光強(qiáng)度。(激發(fā)波長(zhǎng)530nm，發(fā)射波長(zhǎng)590nm)。96孔板于37℃繼續(xù)孵育30min后測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化。以熒光強(qiáng)度的增長(zhǎng)率表示線粒體功能的變化。另取線粒體蛋白5μg加入到96孔板中，加入不同濃度的紅景天甙及線粒體功能抑制劑(NaN3650μmol·L-1)，37℃作用30min，加入resazurin5μmol·L-1，Polastar微板測(cè)定儀測(cè)定熒光強(qiáng)度F0(激發(fā)波長(zhǎng)530nm，發(fā)射波長(zhǎng)590nm)。96孔板于37℃繼續(xù)孵育60min，檢測(cè)熒光F60。
熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)率＝(F60-F0)/F0×100％F0，F(xiàn)60分別為resazurin加入0min和60min時(shí)的熒光強(qiáng)度。
結(jié)果見圖3表3圖3的原始數(shù)據(jù)


結(jié)果見圖4表4圖4的原始數(shù)據(jù)

對(duì)大鼠腦線粒體氧化應(yīng)激損傷的體外保護(hù)作用脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA測(cè)定測(cè)定在96孔板中進(jìn)行，以0.2mol/L組氨酸緩沖液為緩沖體系，反應(yīng)總體積為100μl，含線粒體蛋白100μg，50μmol/L FeSO4，500μmol/L半胱胺酸和不同濃度的紅景天甙。混勻后置37℃溫育20min，然后加入100μl的TBA反應(yīng)液，60℃加熱30min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定。
還原型谷胱甘肽(GSH)的測(cè)定反應(yīng)體系以0.1mol/L磷酸鹽-0.5mmol/LEDTA為緩沖液，線粒體蛋白0.5mg/ml，加入不同濃度的紅景天甙37℃溫育10min，加入H2O2(100μmol/L)繼續(xù)溫育5min，加入Triton破膜后，加入20％的偏磷酸終止反應(yīng)。取上清經(jīng)OPT熒光顯示法測(cè)定GSH的含量。
H+-ATP酶活性測(cè)定用定磷法測(cè)定氧化應(yīng)激損傷后的線粒體H+-ATP酶活性。反應(yīng)體系為100μl，50mM Tris緩沖液，5mM MgCl2，5mM ATP，pH7.95，25℃溫育2min后加入線粒體蛋白，終濃度為0.2mg/ml，25℃溫育2min。加三氯醋酸中止反應(yīng)。3000rpm離心2min，取上清。加入2.5％FeSO4和2％鉬酸胺，振蕩均勻后于690nm處測(cè)定吸光度。H+-ATP酶活性單位μmol.Pi/min.mg.pro結(jié)果見圖5表5圖5的原始數(shù)據(jù)

表6還原型谷胱甘肽(GSH)的測(cè)定的篩選結(jié)果

表7H+-ATP酶活性測(cè)定結(jié)果

H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷PC12細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞以完全1640培養(yǎng)基(含10％馬血清，5％胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100ug/ml)，于37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液一次。
細(xì)胞處理①正常對(duì)照組PC12細(xì)胞在含血清DMEM培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)；②H2O2作用組PC12細(xì)胞鋪成單層后，吸除原培養(yǎng)基，加入含有終濃度為100μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、500μmol/l的H2O2的無血清培養(yǎng)基于37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)③藥物處理組PC12細(xì)胞鋪成單層后，吸除原培養(yǎng)基，加入含有終濃度為的0.1ug/ml，1ug/ml，10ug/mlAV預(yù)處理4h后，加入終濃度為200μmol/l的H2O2無血清培養(yǎng)12小時(shí)。
細(xì)胞活力測(cè)定每孔加入100ul MTT液，終濃度為0.5mg/ml，于37℃5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入DMSO 100ul，振蕩后于540nm處測(cè)定吸光度OD值。
表8細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

抗衰老體內(nèi)實(shí)驗(yàn)——有效組分AV對(duì)由疊氮化鈉和D-半乳糖誘發(fā)衰老的大鼠模型的作用在D-半乳糖致衰老模型的基礎(chǔ)上，加用線粒體復(fù)合酶IV抑制劑疊氮鈉來模擬老年癡呆。
實(shí)驗(yàn)材料D-半乳糖；疊氮鈉或魚藤酮；鄰苯二甲醛(OPT)；偏磷酸HPO3；TBA；鄰苯三酚；鉬酸胺；ATP；Wistar雄性大鼠實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物模型的建立Wistar雄性大鼠隨機(jī)分成7組，每組10只Sham腹腔注射生理鹽水5周+腦室插管注射人工腦脊液一周Model-3腹腔注射D-galactose 5周+腦室插管注射NaN3一周
AV1Model 3+腹腔注射10mg/kg·day AV，第4周開始給藥，共給藥3周。
AV2Model 3+腹腔注射30mg/kg·day AV，第4周開始給藥，共給藥3周。
AV3Model 3+腹腔注射100mg/kg·day AV，第4周開始給藥，共給藥3周。
陽性對(duì)照Model 3+腹腔注射腦復(fù)康30mg/kg·day指標(biāo)測(cè)定1、Morris水迷宮水迷宮裝置由直徑120cm的圓形水池和一可移動(dòng)位置的直徑10cm的平臺(tái)組成。將水池均勻分成四個(gè)象限，平臺(tái)放置于某一象限的中間位置并使其沒于水下1.5cm，水溫保持22±2℃并加入奶粉使其不透明。實(shí)驗(yàn)第一天動(dòng)物自由游泳60s后放置于平臺(tái)上60s作為預(yù)訓(xùn)練。從第二天開始認(rèn)知訓(xùn)練，每天訓(xùn)練2次持續(xù)5天，每次訓(xùn)練時(shí)間為60s，記錄潛伏期和游泳距離。在最后一次認(rèn)知訓(xùn)練結(jié)束后，將平臺(tái)撤去，測(cè)試動(dòng)物60s內(nèi)在原來放置平臺(tái)象限的停留時(shí)間作為空間記憶形成指標(biāo)。
見圖6表9圖6的原始數(shù)據(jù)

見圖7表10圖7的原始數(shù)據(jù)

見圖8表11圖8的原始數(shù)據(jù)

2、穿梭箱實(shí)驗(yàn)采用穿梭箱法測(cè)定其學(xué)習(xí)記憶能力。每只動(dòng)物每日訓(xùn)練20次，以蜂鳴音響后10秒內(nèi)自動(dòng)逃到另一側(cè)為一次主動(dòng)回避反應(yīng)，記錄連續(xù)5天內(nèi)主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)及被動(dòng)回避反應(yīng)時(shí)間，以此作為學(xué)習(xí)記憶成績(jī)。
見圖9表12圖9的原始數(shù)據(jù)

表13圖10的原始數(shù)據(jù)

附表II庫(kù)拉索蘆薈有效成分以及有效部位的藥理活性結(jié)果


權(quán)利要求
1.蘆薈中的有效成份蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理活性和醫(yī)藥用途，它包括蘆薈中的有效成份蘆薈色苷D，其特征為蘆薈有效成份——蘆薈色苷D，結(jié)構(gòu)式如下 蘆薈色苷D
2.蘆薈中有效組分AV的制備方法、藥理活性和醫(yī)藥用途，其特征為它包括蘆薈中的有效成份蘆薈色苷D，其含量在30％～50％。
3.根據(jù)權(quán)利1要求所述的蘆薈中有效成份蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其特征在于蘆薈色苷D的三維空間化學(xué)結(jié)構(gòu)，蘆薈色苷D的色原酮苷類衍生物的三維空間化學(xué)結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆薈中活性成分蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物，和權(quán)利要求2所述的蘆薈中主要包括蘆薈色苷D的有效組分的藥理活性，其特征在于上述有效成分及其衍生物和有效組分不僅具有較好的β-分泌酶抑制活性，還具有抗氧化活性(蘆薈色苷D的活性水平在10-6μg/mL)，可對(duì)抗Aβ聚合過程中產(chǎn)生的游離基對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。因此，上述有效成分及其衍生物和有效組分能有效對(duì)抗老年癡呆癥
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆薈中活性成分蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物，和權(quán)利要求2所述的蘆薈中主要包括蘆薈色苷D的有效組分的醫(yī)藥用途，其特征在于上述有效成分及其衍生物和有效組分可作為制備治療和預(yù)防老年癡呆癥的藥物。
6.一種如權(quán)利要求2所述的蘆薈中的有效組分AV(蘆薈色苷D含量為30％～50％)的制備方法，檢測(cè)方法和有效成份含量測(cè)定方法，其特征在于包括a.蘆薈有效組分AV(蘆薈色苷D含量為30％～50％)的制備方法，95％的乙醇水溶液熱回流提取三次，回收乙醇水溶液，提取液濃縮后用5％的乙醇水溶液溶解，用大孔吸附樹脂作為層析材料，經(jīng)過不同濃度的乙醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，定量收集洗脫液，濃縮，薄層層析檢查，收集富含蘆薈色苷D的組分，回收溶劑即得。(其中所用醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、碳鏈小于32烷醇、碳鏈小于32烯醇及苯酚等；其中所用大孔樹脂包括各種非極性、弱極性、中極性、極性的國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口大孔吸附樹脂。)b.蘆薈有效組分中有效成份蘆薈色苷D的薄層檢查方法薄層板為GF254正相硅膠薄層板，展開劑為氯仿∶甲醇∶水(80∶20∶2)三相溶劑系統(tǒng)，觀察方法是在波長(zhǎng)為254nm的紫外燈下，蘆薈色苷D呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。c.蘆薈有效組分中有效成份蘆薈色苷D的HPLC含量測(cè)定方法分析柱為反相C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水(40∶60)系統(tǒng)，流速1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，用外標(biāo)法確定有效成分蘆薈色苷D的含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆薈中蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物，和權(quán)利要求2所述的蘆薈中主要包括蘆薈色苷D的有效組分，其特征在于a.上述蘆薈有效成份蘆薈色苷D的及其衍生物和有效組分，包括加入各種輔料的各種片劑、顆粒劑、膠囊劑、緩釋劑等口服制劑和注射水針劑、粉針劑、凍干劑等注射制劑。b.各種輔料包括葡萄糖、蔗糖、微晶纖維素、各種高分子輔料等。c.其緩釋制劑包括緩釋包衣微丸劑、緩釋骨架片劑、緩釋脈沖釋放片劑、緩釋滲碳透泵片劑、緩釋包衣片劑等口服緩釋、控釋劑型。其中應(yīng)用的緩釋包衣技術(shù)包括PH依賴型緩釋包衣技術(shù)、溶蝕延遲包衣技術(shù)、基于結(jié)腸酶降解緩釋包衣技術(shù)等。d.在制備工藝和制劑中加入抗氧化劑，防止蘆薈有效組分的分解和變化，抗氧化劑包括各種水溶性抗氧化劑和脂溶性抗氧化劑，及其混合使用。水溶性的抗氧化劑包括Vc、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鹽、硫代硫酸鈉、甲醛合亞硫酸氫鈉、硫脲、半胱氨酸、蛋氨酸、硫代乙酸、硫代甘油等；脂溶性抗氧化劑包括叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)、二丁甲苯酚(BHT)、培酸丙酯(PG)、生育酚(Ve)、卵磷脂等，抗氧化劑的加入量為制劑總量的0.01％-95％。
全文摘要
本發(fā)明是蘆薈中有效成份蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物和有效組分的制備方法、藥理活性和醫(yī)藥用途。蘆薈中的有效成份蘆薈色苷D及其色原酮苷類衍生物具有較好的β－分泌酶抑制活性和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性，作用機(jī)理明確，是前景很好的對(duì)抗老年癡呆癥的有效藥物。蘆薈中的有效組分AV(蘆薈色苷D的含量為30％～50％)，可通過95％的乙醇提取，提取物用大孔吸附樹脂經(jīng)不同濃度的乙醇水溶液梯度洗脫，回收溶劑制得，可期待用于治療老年癡呆癥。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1965852SQ20061009203
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月7日
發(fā)明者方唯碩, 杜冠華, 楊慶云, 王月華, 曹莉莉 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所