本發(fā)明涉及一種試劑盒及其制備方法，具體涉及一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

免疫比濁法(turbidimetricinhibitionimmunoassay)是抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定方法。其基本原理是：當(dāng)抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而且比例合適(一般規(guī)定抗體過量)時，形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體濃度固定時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。通過測定反應(yīng)液的濁度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。

膠乳增強免疫比濁法即是將待測物質(zhì)相對應(yīng)的抗體/抗原包被在直徑為納米膠乳顆粒上，使抗原抗體結(jié)合物形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，光通過之后，透射光和散射光的強度變化更為顯著，從而提高試驗的敏感性。

北京九強生物技術(shù)股份有限公司的專利公開了涉及膠乳致敏的方法及試劑(申請?zhí)?01010615283.2)，具體而言，所發(fā)明的膠乳致敏的方法為先通過化學(xué)鍵將膠乳與無關(guān)蛋白結(jié)合，再使用戊二醛將抗原或抗體交聯(lián)在無關(guān)蛋白上，從而使膠乳致敏。試劑二的制備過程需要兩次離心換液，不利于工業(yè)化制備。

寧波美康生物科技股份有限公司的專利公開了一種抗鏈球菌溶血素o抗體的檢測試劑盒(申請?zhí)?01410804871.9)。其所述蛋白膠乳顆粒復(fù)合物為組合蛋白標(biāo)記在聚苯乙烯膠乳顆粒上形成的復(fù)合物；所述組合蛋白由鏈球菌溶血素o和惰性蛋白通過化學(xué)交聯(lián)而成。試劑二的制備過程需要一次超濾，兩次離心換液，費時費力。

天津醫(yī)科大學(xué)發(fā)明涉及一種帶有間隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶聯(lián)蛋白質(zhì)的方法(申請?zhí)?01210005525.5)。其所述將偶聯(lián)了抗體的膠乳微球與殘余的抗體分離時采用了切向流過濾技術(shù)，克服了離心分離工藝中抗體易脫落和失活的缺點。

綜上，現(xiàn)有技術(shù)中的制備方法中為了達(dá)到去除過量組分、換緩沖液、改變ph值等目的均需要進(jìn)行離心或超濾步驟，導(dǎo)致現(xiàn)有制備方法費時費力，不利于工業(yè)化。而且，現(xiàn)有技術(shù)記載的文件中引入了惰性蛋白或無關(guān)蛋白，該引入惰性蛋白或無關(guān)蛋白的過程繁瑣，且成功率低、效率低且耗時。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：現(xiàn)有技術(shù)均需要用離心或超濾的步驟，費時費力，不利于工業(yè)化的問題，目的在于提供了一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒及其制備方法，其通過各個組分的投料范圍的優(yōu)化，能有效達(dá)到無需離心、超濾等去過量組分的步驟，使致敏后的膠乳直接作為試劑二參與反應(yīng)，大大提高了常規(guī)膠乳增強免疫比濁試劑的制備效率，避免了耗時耗力的離心、超濾等純化過程。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒，包括試劑二，該試劑二為采用膠乳、緩沖液、edc和hepes混合反應(yīng)后，再加入naoh調(diào)節(jié)ph至7.00～8.00，最后再加入slo、封閉劑i和封閉劑ii后制成的成品；成品中各物質(zhì)的濃度為：

本發(fā)明通過上述組分的優(yōu)化，能避免惰性蛋白或無關(guān)蛋白的引入，極大地簡化操作步驟。并且，本發(fā)明基于多個實驗，進(jìn)而確定試劑二中各個組分的投料范圍，按本發(fā)明所建立的投料范圍進(jìn)行投料則可以免去離心或超濾去除過量組分的目的，非常適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率，效果更加顯著。

進(jìn)一步，所述緩沖液為mes-naoh溶液，所述封閉劑i為tween-20溶液，所述封閉劑ii為bsa溶液。更進(jìn)一步，所述mes-naoh溶液的濃度為25～50mm，ph值為6.00；所述tween-20溶液的濃度為20％；所述bsa溶液的濃度為10％。

本發(fā)明通過本發(fā)明的范圍值的優(yōu)選設(shè)置，能在在簡化制備步驟的同時，有效提高檢測準(zhǔn)確度。

優(yōu)選地，所述bsa溶液中還包含有3％的nan3。nan3的作用是防腐，添加入試劑二后終濃度變?yōu)?.03％，仍有防腐作用。

進(jìn)一步，所述膠乳為帶間隔臂膠乳。鏈球菌溶血素o分子量約為69kd，分子量較小，經(jīng)致敏至膠乳后，形成空間位阻，遮蓋被待測樣本中的抗體識別位點，不利于抗原決定簇的暴露，不易被待測樣本中的抗體所識別，反應(yīng)效率低下。本發(fā)明同時可采用帶間隔臂的膠乳替換常規(guī)膠乳，該設(shè)置方式能夠有效降低抗原抗體結(jié)合的空間位阻問題，有利于抗原決定簇的暴露，從而被待測樣本中的抗體迅速識別，發(fā)生特異性凝集反應(yīng)，達(dá)到較好的膠乳增強免疫比濁測定的效果。

本發(fā)明所述的百分?jǐn)?shù)濃度均指w/v濃度，即質(zhì)量/體積濃度，單位為g/ml。上述組分中edc為碳二亞胺，hepes為4-羥乙基哌嗪乙磺酸，slo為鏈球菌溶血素o，mes為2-嗎啉乙磺酸，bsa為牛血清白蛋白。

為保證稱量的準(zhǔn)確性，edc添加的方式為：將edc配制成濃度為0.7～1.2％的edc溶液，edc溶液的用量為7.50ml/l～7.70ml/l。同時，本發(fā)明中所述naoh溶液的濃度優(yōu)選設(shè)置為20％。

一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒的制備方法，其中，試劑二的制備方法包括：

分別取膠乳、緩沖液、edc、hepes、slo、封閉劑i和封閉劑ii；配制edc溶液，配制naoh溶液；

將膠乳加入緩沖液中，再加入edc溶液進(jìn)行活化，再加入hepes，用naoh溶液調(diào)節(jié)ph，加入slo進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，然后加入封閉劑i和封閉劑ii進(jìn)行封閉，最后制成成品。

進(jìn)一步，所述edc溶液進(jìn)行活化的時間為15min。所述化學(xué)交聯(lián)的時間為2h。所述封閉的時間為0.5h。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：

1、本發(fā)明控制過程非常精準(zhǔn)嚴(yán)格，避免了常規(guī)膠乳致敏過程的離心、超濾等去雜過程，大大提高了常規(guī)膠乳增強免疫比濁試劑的制備效率，大大提高了生產(chǎn)效率；

2、本發(fā)明性能優(yōu)越，制備過程非常簡單、易行，大大節(jié)約了時間成本和人力成本，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1

一種抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒，包括試劑一和試劑二，本實施例中，該試劑二中各物質(zhì)的濃度為：

本實施例中該試劑二的膠乳優(yōu)選為帶間隔臂膠乳。

緩沖液優(yōu)選為濃度為25～50mm的mes-naoh溶液，其制備方法是：采用mes溶解后制成25～50mm濃度的溶液，然后采用naoh調(diào)節(jié)ph至6.0即制成mes-naoh溶液。封閉劑i優(yōu)選為濃度為20％的tween-20溶液。

封閉劑ii優(yōu)選為濃度為10％的bsa溶液，該bsa溶液中還含有3％的nan3；封閉劑ii的制備過程為：稱取10g的bsa和3g的nan3后，將兩者溶解到水中，并定容到100ml即制成bsa溶液。

以100ml為例，本實施例的試劑二的具體制備方法如下：

將naoh配制成濃度為20％的naoh溶液，將edc配制成濃度為0.9％的edc溶液；分別量取膠乳6ml、mes-naoh溶液14ml、edc溶液0.76ml、hepes0.5958g、slo7.6mg、tween-20溶液2ml和bsa溶液1ml；將hepes進(jìn)行溶解。

將膠乳加入到緩沖液中，再加入edc溶液進(jìn)行羧基的活化，活化時間為15min，再加入hepes，采用naoh溶液調(diào)節(jié)ph至7.60，加入slo進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，化學(xué)交聯(lián)時間為2h，然后加入封閉劑i和封閉劑ii進(jìn)行封閉，封閉時間為0.5h，最后定容到100ml即制成成品。

本實施例的試劑一為現(xiàn)有抗鏈球菌溶血素o檢測試劑盒中的試劑一，本實施例中提供了其中一種試劑一的組成，具體組成成份如下：

以1000ml為例，本實施例的試劑一的具體制備方法如下：

量取約800ml純化水，稱取并溶解hepes23.83g，用20％naoh調(diào)節(jié)ph值至7.00，稱取并溶解nacl9.00～15.00g，量取并溶解吐溫-2010.0ml，稱取并溶解peg600025.00～33.00g，量取并溶解防腐劑0.30ml，量取并溶解10％bsa10ml，最后定容到1000ml即制成成品。

實施例2

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二的制備的量不同，本實施例以500ml為例，本實施例的試劑二的具體制備方法如下：

分別量取膠乳30ml、緩沖液70ml、edc3.8ml、hepes2.9789g、slo38mg、封閉劑i10ml和封閉劑ii5ml；將edc配制成濃度為0.7～1.2％的edc溶液，將hepes進(jìn)行溶解，將naoh配制成濃度為20％的naoh溶液；

將膠乳加入到緩沖液中，再加入edc溶液進(jìn)行羧基的活化，活化時間為15min，再加入hepes，采用naoh溶液調(diào)節(jié)ph至7.40，加入slo進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，化學(xué)交聯(lián)時間為2h，然后加入封閉劑i和封閉劑ii進(jìn)行封閉，封閉時間為0.5h，最后定容到500ml即制成成品。

實施例3

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二制備方法不同，本實施例增加了離心的步驟，本實施例的具體設(shè)置如下：

分別量取膠乳6ml、緩沖液14ml、edc0.76ml、hepes0.5958g、slo7.6mg、封閉劑i2ml和封閉劑ii1ml；；將edc配制成濃度為0.7～1.2％的edc溶液；hepes溶解后采用naoh溶液調(diào)節(jié)ph值至7.50，獲得復(fù)溶液；

將膠乳加入到緩沖液中，再加入edc溶液進(jìn)行羧基的活化，活化時間為15min，18000r/min離心15min，再加入ph值為7.50的復(fù)溶液進(jìn)行復(fù)溶，加入slo進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，化學(xué)交聯(lián)時間為2h，18000r/min離心15min，再加入ph值為7.50的復(fù)溶液進(jìn)行復(fù)溶，再用然后加入封閉劑i和封閉劑ii進(jìn)行封閉，封閉時間為0.5h，最后定容到100ml即制成成品。

采用上述實施例1-實施例3制成的試劑盒進(jìn)行檢測，校準(zhǔn)數(shù)據(jù)如表1所示，第三方質(zhì)控測試結(jié)果如表2所示，采用40個樣本做臨床測試的檢測結(jié)果如表3所示。

表1

表2

表3

通過上述表1-表3的數(shù)據(jù)結(jié)果可以證明：本發(fā)明不經(jīng)過離心、超濾等去雜過程，依然能有效使檢測結(jié)果十分準(zhǔn)確。

實施例4

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二中各組分的添加量不同，本實施例中各組分的濃度低于本發(fā)明，本實施例的具體設(shè)置如下：

膠乳5.6ml、緩沖液14ml、edc溶液0.73ml、hepes0.5958g、slo7.2mg、封閉劑i2ml和封閉劑ii1ml；naoh調(diào)節(jié)溶液的ph值為6.90。

實施例5

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二中各組分的添加量不同，本實施例的具體設(shè)置如下：

膠乳5.9ml、緩沖液14ml、edc溶液0.755ml、hepes0.5958g、slo7.5mg、封閉劑i2ml和封閉劑ii1ml；naoh調(diào)節(jié)溶液的ph值為7.10。

實施例6

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二中各組分的添加量不同，本實施例的具體設(shè)置如下：

膠乳6.1ml、緩沖液14ml、edc溶液0.765ml、hepes0.5958g、slo7.7mg、封閉劑i2ml和封閉劑ii1ml；naoh調(diào)節(jié)溶液的ph值為7.90。

實施例7

本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中試劑二中各組分的添加量不同，本實施例中各組分的濃度高于本發(fā)明，本實施例的具體設(shè)置如下：

膠乳6.4ml、緩沖液14ml、edc溶液0.79ml、hepes0.5958g、slo8.0mg、封閉劑i2ml和封閉劑ii1ml；naoh調(diào)節(jié)溶液的ph值為8.10。

采用上述實施例2和實施例4-實施例7制成的試劑盒進(jìn)行檢測，第三方質(zhì)控測試結(jié)果如表4所示。

表4

通過上述實施例4-7的試驗數(shù)據(jù)可知，通過本發(fā)明的范圍值的優(yōu)選設(shè)置，能在在簡化制備步驟的同時，有效提高檢測準(zhǔn)確度，效果更加顯著。

以上所述的具體實施方式，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。