本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒。
背景技術(shù)：
：達(dá)比加群酯(dabigatranetexilate)是一種新型口服抗凝藥，通過(guò)直接抑制凝血酶(凝血因子fiia)發(fā)揮抗凝作用，可用于預(yù)防髓關(guān)節(jié)/膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后靜脈血栓栓塞形成，或預(yù)防心房顫動(dòng)導(dǎo)致腦卒中等。雖然抗凝作用的藥物有很多，例如華法林，但是達(dá)比加群酯具有明顯的優(yōu)勢(shì)：起效快、抗凝療效可預(yù)期等，但是如同所有抗凝劑，達(dá)比加群酯會(huì)導(dǎo)致出血事件。目前還未開發(fā)出針對(duì)達(dá)比加群酯的特異性拮抗劑。而臨床上服用達(dá)比加群酯的患者一旦出現(xiàn)大出血，或者需要手術(shù)后者侵入性處理，一般會(huì)采取緊急逆轉(zhuǎn)抗凝活性的措施來(lái)應(yīng)對(duì)。該方法不僅不利于提前預(yù)防出血癥狀，還會(huì)給患者帶來(lái)生理和心理的雙重傷害，因此，嚴(yán)重影響了患者的健康和恢復(fù)。雖然達(dá)比加群酯較華法林和依諾肝素相比具有較高的安全性，但是該藥在被醫(yī)院和患者使用時(shí)，隨著使用人數(shù)的增加，人們發(fā)現(xiàn)對(duì)達(dá)比加群血液濃度的監(jiān)測(cè)和調(diào)整劑量是必要的，對(duì)其密切監(jiān)測(cè)可使嚴(yán)重出血風(fēng)險(xiǎn)大幅度降低,從而提高用藥的安全性?；罨糠帜蠲笗r(shí)間(aptt)是測(cè)定內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的篩選試驗(yàn),也可以作為內(nèi)源性途徑凝血因子的定量試驗(yàn).此法可以用來(lái)檢測(cè)達(dá)比加群的血液含量；其原理為將待測(cè)血漿加入部分凝血活酶溶液，在鈣離子參與下纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，測(cè)定凝固所需的時(shí)間，即為待測(cè)血漿活化部分凝血活酶時(shí)間；使用了達(dá)比加群的血漿活化部分凝血活酶時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，此法可用來(lái)監(jiān)測(cè)達(dá)比加群的血液含量?；罨糠帜蠲笗r(shí)間(aptt)是測(cè)定內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的篩選試驗(yàn)，也可以作為內(nèi)源性途徑凝血因子的定量試驗(yàn)；凝血時(shí)間，即從加入部分凝血活酶溶液到血漿凝固的時(shí)間是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，因此凝血時(shí)間必須精確，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以準(zhǔn)確，在待測(cè)血漿加入部分凝血活酶溶液，激活了整條內(nèi)源性凝血途徑，導(dǎo)致血漿凝固。整條內(nèi)源性凝血途徑所牽涉的凝血因子眾多，所以此法受到的干擾因素較多，達(dá)比加群的血液濃度和活化部分凝血活酶時(shí)間的相關(guān)系數(shù)不強(qiáng)，難以進(jìn)行精確的量化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供迅速準(zhǔn)確，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化測(cè)量的達(dá)比加群含量的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒，包括蛇靜脈酶(ecarin)、發(fā)色底物、含有達(dá)比加群的人血漿標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋液；蛇靜脈酶的工作濃度為0.05～1u/ml；發(fā)色底物的工作濃度為0.05～3mmol/l。優(yōu)選的，所述蛇靜脈酶的工作濃度為0.1～0.5u/ml。優(yōu)選的，所述發(fā)色底物的工作濃度為0.5～2mmol/l。優(yōu)選的，所述發(fā)色底物為h-d-chg-ala-arg-pna·2acoh、tos-gly-pro-arg-pna·acoh、h-d-chg-but-arg-pna·2acoh、h-d-chg-pro-arg-pna·2acoh、h-d-cha-ala-arg-pna·2acoh、h-d-cha-gly-arg-pna·2acoh、ch3oco-gly-pro-arg-pna·acoh、h-β-ala-gly-arg-pna·2acoh、h-d-phe-pip-arg-pna·2hcl、pyroglu-pro-arg-pna·hcl或-d-ala-pro-arg-pna·2hcl。優(yōu)選的，所述稀釋液的組分包括緩沖液、無(wú)機(jī)鹽、穩(wěn)定劑、表面活性劑和防腐劑。優(yōu)選的，所述緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液或磷酸緩沖液；所述緩沖液的ph值為7.2～7.8。優(yōu)選的，所述無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉或氯化鉀；所述無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量濃度為0.15～0.25mol/l；所述表面活性劑為聚乙二醇-8000或吐溫-20；所述表面活性劑的質(zhì)量濃度為0.05％～0.15％。優(yōu)選的，所述穩(wěn)定劑為小牛血清或酪蛋白；所述穩(wěn)定劑的質(zhì)量濃度為0.08％～0.15％；所述防腐劑為proclin300或疊氮鈉；所述防腐劑的質(zhì)量濃度為0.1～1mg/ml。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括凝血酶原。優(yōu)選的，凝血酶原的質(zhì)量濃度為50～150μg/ml。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒，包括蛇靜脈酶、發(fā)色底物、含有達(dá)比加群的人血漿標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋液；蛇靜脈酶的工作濃度為0.05～1u/ml；發(fā)色底物的工作濃度為0.05～3mmol/l。所述試劑盒的檢測(cè)機(jī)理是蛇靜脈酶加入樣本血漿后會(huì)作用在凝血酶原上，產(chǎn)生一種具有裂解活性的酶，這種酶裂解其發(fā)色底物，得到吸光度信號(hào)。血漿中的達(dá)比加群抑制這種酶,而達(dá)比加群含量越高,對(duì)這種酶的抑制越強(qiáng)，得到的吸光度信號(hào)越弱。所以在一定的范圍之內(nèi),達(dá)比加群的含量和吸光度的信號(hào)是負(fù)相關(guān)關(guān)系,可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到定量檢測(cè)的目的。本發(fā)明所述試劑盒基于發(fā)色底物法實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)血漿中達(dá)比加群含量變化，由于所述試劑盒能夠特異性反映達(dá)比加群對(duì)酶的抑制情況，從而實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確檢測(cè)達(dá)比加群含量，研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)比加群濃度在0～500ng/ml時(shí)，r≥0.99，線性關(guān)系較好，同時(shí)所述試劑盒相對(duì)偏差小于1％，準(zhǔn)確性較好。同時(shí)，本發(fā)明提供的試劑盒經(jīng)過(guò)多次測(cè)量時(shí)，cv值小于2％，重復(fù)性較好。所述試劑盒可以檢測(cè)到低至15ng/ml的達(dá)比加群。進(jìn)一步的，本發(fā)明提供的試劑盒適合內(nèi)源性凝血酶原的表達(dá)量很低的重病患者，通過(guò)體外補(bǔ)充凝血酶原實(shí)現(xiàn)了達(dá)比加群含量快速準(zhǔn)確檢測(cè)。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例3中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒，包括蛇靜脈酶、發(fā)色底物、含有達(dá)比加群的人血漿標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋液；蛇靜脈酶的工作濃度為0.05～1u/ml；發(fā)色底物的工作濃度為0.05～3mmol/l。本發(fā)明提供了一種基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒，研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)比加群濃度在0～500ng/ml時(shí)，r≥0.99，線性關(guān)系較好，同時(shí)所述試劑盒相對(duì)偏差小于1％，準(zhǔn)確性較好。本發(fā)明提供的一種基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒包括蛇靜脈酶。所述蛇靜脈酶的工作濃度為0.05～1u/ml，優(yōu)選為0.1～0.5u/ml，更優(yōu)選為0.2u/ml。所述蛇靜脈酶的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的蛇靜脈酶即可。本發(fā)明中，所述蛇靜脈酶購(gòu)自西格馬(sigma)。本發(fā)明提供的一種基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒包括發(fā)色底物。所述發(fā)色底物的工作濃度為0.05～3mmol/l，優(yōu)選為0.5～2mmol/l，更優(yōu)選為1mmol/l。所述發(fā)色底物為h-d-chg-ala-arg-pna·2acoh、tos-gly-pro-arg-pna·acoh、h-d-chg-but-arg-pna·2acoh、h-d-chg-pro-arg-pna·2acoh、h-d-cha-ala-arg-pna·2acoh、h-d-cha-gly-arg-pna·2acoh、ch3oco-gly-pro-arg-pna·acoh、h-β-ala-gly-arg-pna·2acoh、h-d-phe-pip-arg-pna·2hcl、pyroglu-pro-arg-pna·hcl或d-ala-pro-arg-pna·2hcl。所述發(fā)色底物的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的凝血酶的發(fā)色底物即可。本發(fā)明提供的一種基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒包括稀釋液。所述稀釋液的作用是對(duì)蛇靜脈酶和發(fā)色底物進(jìn)行稀釋，得到蛇靜脈酶溶液和發(fā)色底物溶液。本發(fā)明中，所述稀釋液的組分包括緩沖液、無(wú)機(jī)鹽、穩(wěn)定劑、表面活性劑和防腐劑。所述緩沖液優(yōu)選為三羥甲基氨基甲烷緩沖液或磷酸緩沖液，更優(yōu)選為三羥甲基氨基甲烷緩沖液；所述緩沖液的ph值為7.2～7.8，更優(yōu)選為7.5。所述無(wú)機(jī)鹽優(yōu)選為氯化鈉或氯化鉀，更優(yōu)選為氯化鈉；所述無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.15～0.25mol/l，更優(yōu)選為0.2mol/l；所述表面活性劑優(yōu)選為聚乙二醇-8000或吐溫-20，更優(yōu)選為聚乙二醇-8000；所述表面活性劑的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.05％～0.15％，更優(yōu)選為0.1％。所述穩(wěn)定劑優(yōu)選為小牛血清或酪蛋白，更優(yōu)選為小牛血清；所述穩(wěn)定劑的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.08％～0.15％，更優(yōu)選為0.1％；所述防腐劑優(yōu)選為proclin300或疊氮鈉；所述防腐劑的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.1～1mg/ml，更優(yōu)選為0.5mg/ml。本發(fā)明中，所述試劑盒優(yōu)選還包括凝血酶原。凝血酶原的質(zhì)量濃度優(yōu)選為50～150μg/ml，更優(yōu)選為80μg/ml。所述凝血酶原的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知凝血酶原即可。本發(fā)明中，所述凝血酶原購(gòu)自西格馬(sigma)。本發(fā)明中，一種基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒在檢測(cè)達(dá)比加群含量中的應(yīng)用，包括以下步驟：1)用稀釋液將蛇靜脈酶和發(fā)色底物稀釋，得到蛇靜脈酶和發(fā)色底物溶液；2)將待測(cè)樣品與蛇靜脈酶溶液混合、孵育，得到孵育后的混合液；3)將孵育后的混合液與發(fā)色底物溶液混合、孵育后，讀取待測(cè)樣品中發(fā)色底物的信號(hào)強(qiáng)度；4)將得到的計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度與已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到血液中達(dá)比加群含量。本發(fā)明中，所述步驟2)中待測(cè)樣品與蛇靜脈酶溶液的體積比為1～2:1，更優(yōu)選為1:1。所述步驟2)中孵育的溫度優(yōu)選為37℃。所述孵育的時(shí)間優(yōu)選為2分鐘。本發(fā)明中，所述孵育后混合液與發(fā)色底物溶液的體積比為1～2:1，更優(yōu)選為1:1。本發(fā)明中，所述步驟3)中信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)波長(zhǎng)為405nm。達(dá)比加群濃度在0～500ng/ml范圍內(nèi)容，具有較好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)血漿中達(dá)比加群的含量。本發(fā)明提供的試劑盒經(jīng)過(guò)多次檢測(cè)時(shí)，cv值小于2％，重復(fù)性非常好。本發(fā)明提供的試劑盒可以檢測(cè)到低至15ng/ml的達(dá)比加群。本發(fā)明除了可以檢測(cè)達(dá)比加群含量，還可以檢測(cè)其他直接凝血酶抑制劑。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種基于發(fā)色底物法檢測(cè)達(dá)比加群含量的試劑盒進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例1濃度為20mmol/l的tris緩沖液，再加入鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.5；再加入氯化鈉，聚乙二醇-8000，小牛血清和疊氮鈉，攪拌后得到終濃度分別為氯化鈉0.2mol/l，聚乙二醇-80000.1％，小牛血清0.1％，疊氮鈉0.5mg/ml的稀釋液。取蛇靜脈酶溶于稀釋液中，形成工作濃度為0.05u/ml、0.1u/ml、0.2u/ml、0.5u/ml和1u/ml的蛇靜脈酶溶液。取發(fā)色底物h-d-phe-pip-arg-pna·2hcl溶于稀釋液中，形成工作濃度為0.05mmol/l、0.5mmol/l、1mmol/l、2mmol/l和3mmol/l的發(fā)色底物溶液。實(shí)施例2樣品檢測(cè)：取100μl樣本與100μl蛇靜脈酶溶液混合均勻，37℃孵育2分鐘，然后加入200μl發(fā)色底物溶液，37℃反應(yīng)在405nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度5分鐘。蛇靜脈酶溶液和發(fā)色底物溶液的工作濃度選擇如表1所示。記錄試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1檢測(cè)達(dá)比加群測(cè)定的結(jié)果由表2可以看出，上述方案均能準(zhǔn)確地測(cè)定達(dá)比加群的含量變化，其中蛇靜脈酶工作濃度為0.2u/ml與發(fā)色底物工作濃度為1mmol/l的方案檢測(cè)效果最佳。實(shí)施例3達(dá)比加群標(biāo)準(zhǔn)品的制備：配制多個(gè)不同濃度的已知達(dá)比加群濃度的人血漿標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度分別為0ng/ml，15ng/ml，30ng/ml，60ng/ml,120ng/ml，250ng/ml，500ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：(1)取100μl標(biāo)準(zhǔn)液與100μl蛇靜脈酶溶液混合均勻，并孵育2分鐘，孵育和反應(yīng)的溫度均為37℃。(2)然后加入200μl發(fā)色底物溶液，混合均勻(蛇靜脈酶工作濃度為0.2u/ml，發(fā)色底物工作濃度為1mmol/l)，在405nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度5分鐘。(3)根據(jù)達(dá)比加群標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度與所對(duì)應(yīng)吸光值，采用線性方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，請(qǐng)見圖1，其標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y＝-0.9318x+0.2524(r2＝0.9925)。表2檢測(cè)達(dá)比加群測(cè)定試劑盒線性范圍由表1可知，達(dá)比加群濃度在0～500ng/ml范圍內(nèi)容，具有較好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)血漿中達(dá)比加群的含量。實(shí)施例4按照實(shí)施例3中的檢測(cè)方法，蛇靜脈酶工作濃度為0.2u/ml與發(fā)色底物工作濃度為1mmol/l的方案對(duì)不同梯度達(dá)比加群濃度進(jìn)行檢測(cè)，得到不同梯度達(dá)比加群濃度下吸光度值，得到本試劑盒的檢測(cè)靈敏度。表3檢測(cè)達(dá)比加群測(cè)定試劑盒靈敏度達(dá)比加群濃度(ng/ml)0153060120250500405nm吸光度1.8731.7211.6191.5031.4181.0720.605由表3所示，本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)靈敏度的計(jì)算方法如下：根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即用已知濃度或活性的樣品測(cè)試試劑盒，記錄在試劑盒規(guī)定參數(shù)下產(chǎn)生的吸光度改變，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-0.9318log(吸光度)/(ng/l)。由表3所示，本發(fā)明提供的試劑盒可以檢測(cè)到低至15ng/ml的達(dá)比加群。實(shí)施例5按照實(shí)施例4的檢測(cè)方法將達(dá)比加群標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為30ng/ml和250ng/ml多次檢測(cè)吸光度值。表4檢測(cè)達(dá)比加群測(cè)定試劑盒重復(fù)性由表4可知，本發(fā)明提供的試劑盒經(jīng)過(guò)多次檢測(cè)時(shí)，cv值小于2％，重復(fù)性非常好。實(shí)施例6按照實(shí)施例3中的檢測(cè)方法，蛇靜脈酶工作濃度為0.2u/ml與凝血酶的工作濃度為發(fā)色底物1mmol/l的方案對(duì)不同稀釋液進(jìn)行檢測(cè)，得到利用不同稀釋液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表5檢測(cè)不同稀釋液對(duì)試劑盒的影響由表5可以看出，三羥甲基氨基甲烷緩沖液和磷酸鹽緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)曲線r2與碳酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液相比，均高于0.99，因此三羥甲基氨基甲烷緩沖液或磷酸緩沖液有利于提高所述檢測(cè)試劑盒的準(zhǔn)確性和精確度。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12