一種超高靈敏檢測凝血酶的比色法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于生化分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種超高靈敏檢測凝血酶的比色法。
【背景技術(shù)】
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[0002]凝血酶是一種蛋白水解酶，由兩條肽鏈組成，肽鏈之間以二硫鍵互相連接。凝血酶通過將血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，加速血小板的凝聚，達(dá)到迅速止血的目的。癌癥患者腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散，都會使患者的凝血機(jī)制發(fā)生變化，可以通過檢測凝血酶的濃度對癌癥等疾病進(jìn)行評估。目前檢測凝血酶的方法主要有熒光法、發(fā)色底物法及電化學(xué)法，但這三種方法的靈敏度均不佳，檢出限較高，無法達(dá)到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)要求的痕量檢測；拉曼散射檢測生物分子具有較高的靈敏度，但操作復(fù)雜，需要昂貴的儀器，成本較高。目前常用比色法進(jìn)行檢測。比色法是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。信號是溶液顏色的變化，可以肉眼檢測，簡便快捷。
[0003]專利200810036219.1提供了一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的靶分子檢測方法，有凝血酶存在時會與雙鏈探針中的核酸適體結(jié)合，釋放出的cDNA單鏈吸附到預(yù)先制備的納米金表面，從而提高納米金的耐鹽性，使溶液保持紅色，實(shí)現(xiàn)對凝血酶的檢測。但信號僅由加入的凝血酶產(chǎn)生，使體系檢出限較高。專利201210057638.X提供了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增比色法檢測靶核酸或蛋白的方法，利用抗原抗體結(jié)合將待測靶核酸或蛋白通過捕獲抗體間接固定于磁珠上，通過雜交上的滾環(huán)引物進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)生的大量重復(fù)序列的長鏈DNA團(tuán)聚，表面負(fù)離子高度堆積，對納米金顆粒表面的負(fù)電荷有屏蔽作用，使納米金顆粒間排斥減弱，易發(fā)生聚集，使納米金溶液由酒紅色變紫黑色。該發(fā)明滾環(huán)復(fù)制的發(fā)生需要捕獲抗體、凝血酶、檢測抗體、引物探針和環(huán)形模板逐一連接，較為繁瑣且浪費(fèi)資源，且需要預(yù)先制備粒徑均一的納米金溶液，較為繁瑣。
[0004]本發(fā)明無需預(yù)先制備納米金溶液，且只需要兩段核酸序列:環(huán)形模板circletemplate利用捕獲探針primer成環(huán)，捕獲探針primer同時作為引物，即可在成環(huán)的circletemplate上進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制。本發(fā)明將核酸適體特異性識別凝血酶及滾環(huán)復(fù)制相結(jié)合，只需兩段核酸序列互相連接，在進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制放大信號的基礎(chǔ)上，將核酸適體特異性結(jié)合凝血酶的原理與金-過氧化氫變色體系相結(jié)合。當(dāng)過氧化氫存在時，會將金離子還原成納米金，高濃度的過氧化氫有助于形成分散的、球形的納米金，使溶液顯紅色；當(dāng)滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)生成DNA酶后，DNA酶可催化過氧化氫分解，使過氧化氫濃度降低，則形成團(tuán)聚的納米金，使溶液顯藍(lán)色。該方法無需預(yù)先制備納米金溶液，省時省力，且極大地提高了檢測靈敏度，該發(fā)明的檢出限可達(dá)10_17M(約6個凝血酶分子)，實(shí)現(xiàn)了凝血酶的超高靈敏分析檢測。
[0005]DNA酶是一種具有催化活性的DNA分子，具有蛋白酶的催化性能。蛋白酶在高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下會因?yàn)榘l(fā)生不可逆變性而失活，因此使用條件較為苛刻；而DNA酶在具有蛋白酶的催化性能的同時，不會因?yàn)闇囟取H等條件的改變而發(fā)生不可逆變性，因此得到了越來越廣泛的關(guān)注。
[0006]滾環(huán)復(fù)制是噬菌體感染細(xì)菌后進(jìn)行自我復(fù)制所采取的一種形式，是以封閉的單鏈環(huán)狀DNA作為模板，當(dāng)有相應(yīng)的與之堿基互補(bǔ)雜交的引物存在時，在等溫的環(huán)境下進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。通過這種復(fù)制方式，環(huán)狀單鏈DNA能夠?qū)崿F(xiàn)相對無限的單鏈擴(kuò)增。該方法不需要對模板DNA樣品進(jìn)行特殊處理，實(shí)現(xiàn)信號的高效放大。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0007]為了解決上述問題，我們采用滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)，形成大量DNA酶，放大檢測信號，提高了凝血酶的檢測靈敏度。采用96孔板連接引物，可消除未反應(yīng)的氯化血紅素(hemin)對反應(yīng)的影響，提高信噪比，進(jìn)一步提高檢測的靈敏度。采用靈敏的比色體系，利用過氧化氫將金離子還原成分散或團(tuán)聚狀態(tài)產(chǎn)生的紅色或藍(lán)色，直接判斷有無靶分子的存在，無需預(yù)先制備納米金溶液，簡單易行，無需復(fù)雜儀器設(shè)備。通過本方法，可實(shí)現(xiàn)凝血酶的超高靈敏檢測，檢出限可達(dá)KT17M(約6個凝血酶分子)。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]一種超高靈敏檢測凝血酶的比色法，包括如下步驟:
[0010]I)在細(xì)胞培養(yǎng)板表面包被戊二醛，通過共價方法固定捕獲探針primer鏈；
[0011]2)設(shè)計環(huán)形模板circle template，其可與凝血酶特異性結(jié)合，結(jié)合后阻擋滾環(huán)復(fù)制的繼續(xù)；
[0012]3)加入DNA連接酶，使上述的環(huán)形模板circle template在細(xì)胞培養(yǎng)板表面的primer鏈上成環(huán)；
[0013]4)加入摩爾數(shù)為上述primer的0-1(Γη倍的待測液，通過DNA聚合酶作用進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增反應(yīng)；
[0014]5)加入摩爾數(shù)為上述primer的2-10倍的hemin，形成G-四鏈體DNA酶；
[0015]6)依次加入過氧化氫和氯金酸溶液，反應(yīng)后觀察溶液顏色變化并測吸光度。
[0016]優(yōu)選的是，步驟I)中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)板為96孔板。
[0017]優(yōu)選的是，步驟I)中，所述的捕獲探針primer鏈，其核苷酸序列為Y -GACGGCGAA GGA TTG ATA CT-3'，5'端氨基修飾。
[0018]優(yōu)選的是，步驟2)中，所述環(huán)形模板circle template，其核苷酸序列中包括GG TTGG TGT GG TT GG 段。
[0019]優(yōu)選的是，步驟2)中，所述環(huán)形模板circle template，其核苷酸序列為5' -CTTCGC CGT CCC CAA CCC GCC CTA CCC GGT TGG TGT GGT TGG CCC AAC CCG CCC TAC CCA GTATCA ATC-3'。
[0020]優(yōu)選的是，步驟3)中，所述DNA連接酶為T4連接酶。
[0021]優(yōu)選的是，步驟4)中，所述DNA聚合酶為phi29DNA聚合酶。
[0022]優(yōu)選的是，步驟5)中，形成G-四鏈體DNA酶的條件為25°C反應(yīng)1_1.5h。
[0023]優(yōu)選的是，步驟6)中，所述過氧化氫的摩爾數(shù)為上述primer的14倍。
[0024]優(yōu)選的是，步驟6)中，所述氯金酸的摩爾數(shù)為上述primer的100倍。
[0025]凝血酶的檢測原理:當(dāng)有凝血酶存在時，凝血酶會與circle template形成的DNA環(huán)特異性結(jié)合，阻止?jié)L環(huán)復(fù)制的發(fā)生，無法形成滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物與hemin結(jié)合生成DNA酶，進(jìn)而無法催化過氧化氫的分解。因此過氧化氫足量，能使金還原成分散良好的狀態(tài)，顯紅色；而當(dāng)沒有凝血酶存在時，無法阻止?jié)L環(huán)復(fù)制的發(fā)生，滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物與hemin結(jié)合后生成的大量DNA酶將過氧化氫分解，將金還原成團(tuán)聚的狀態(tài)，顯藍(lán)色。
[0026]本發(fā)明的有益技術(shù)效果:1.本發(fā)明提供了一種超高靈敏檢測凝血酶的比色法。采用滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)，形成大量DNA酶，放大檢測信號，提高了凝血酶的檢測靈敏度。采用96孔板連接引物，可消除未反應(yīng)的hemin對反應(yīng)的影響，提高信噪比，進(jìn)一步提高檢測的靈敏度。采用靈敏的比色體系，利用過氧化氫將金離子還原成分散或團(tuán)聚狀態(tài)產(chǎn)生的紅色或藍(lán)色，直接判斷有無靶分子的存在，無需預(yù)先制備納米金溶液，簡單易行，無需復(fù)雜儀器設(shè)備。通過本方法，可實(shí)現(xiàn)凝血酶的超高靈敏檢測，檢出限可達(dá)10_17M(約6個凝血酶分子)。2.其circle template鏈為富C堿基的序列，成環(huán)后，引物以環(huán)為模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)物為一條富G堿基的序列，該富G序列與hemin通過電子堆積作用結(jié)合，形成G-四鏈體DNA酶，可以催化過氧化氫的分解。滾環(huán)復(fù)制可使該富G序列無限延長，極大地增大DNA酶的量，進(jìn)而放大檢測信號。
【附圖說明】
[0027]圖1凝血酶與DNA環(huán)特異性結(jié)合電泳表征圖
[0028]圖2不同濃度凝血酶的檢測靈敏度
[0029]圖3不同濃度凝血酶反應(yīng)后，溶液在540nm處光吸收的變化規(guī)律
[0030]圖4凝血酶、牛血清白蛋白、牛血紅蛋白、溶菌酶、核仁素以及空白反應(yīng)后，溶液顏色的變化規(guī)律
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明。
[0032]實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)部分
[0033]—.96孔板的修飾:
[0034](I)在96孔板的6個微孔中加入200 μ L 5mM戊二醛，濕盒37°C水浴震蕩4h，在微孔底部包被戊二醛。
[0035](2)棄去反應(yīng)液，將6個微孔用pH 5的PBS和水各洗5次，加入200 μ L IX 10_6Μ的 primer (5' -GAC GGC GAA GGA TTG ATA CT-3' )，37°C水浴 4h，將 primer 修飾到微孔板上。
[0036](3)棄去反