一種酶菌協(xié)同制備菜籽肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種酶菌協(xié)同制備菜籽肽的方法,屬才菜籽肽制備技術領域。本發(fā)明首先對脫脂菜籽粕進行高溫加熱,除去抗營養(yǎng)因子硫代葡萄糖苷,得到脫脂菜籽粕混合液,再將其與利用混合菌種培養(yǎng)發(fā)酵得到混合酶液、明膠等物質混合過濾,得到菜籽粕提取液,最后將其與磁性水凝膠等物質混合,利用CO2超臨界進行萃取,即可得到菜籽肽。本發(fā)明制備的菜籽肽含鹽量低,且不會因為大量色素的存在,而影響產品色澤;且菜籽肽蛋白酶的活性得以提高,提高了20~25%,水解能力達到12%以上。
【專利說明】
一種酶菌協(xié)同制備菜籽肽的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種酶菌協(xié)同制備菜籽肽的方法,屬才菜籽肽制備技術領域。
【背景技術】
[0002]菜籽肽是以菜籽蛋白或菜籽柏作為原材料,通過物理方法、化學方法或酶法處理后所得到的一種小分子蛋白質,其結構較菜籽蛋白更為簡單且分子量更小,具有較好的蛋白質功能特性:溶解性、起泡性、乳化性,且與菜籽蛋白的氨基酸組成幾乎完全一致,從而更容易被動物體攝入和吸收。
[0003]現(xiàn)有菜籽生物活性肽的制備工藝主要有三種:(I)基因工程方法;(2)化學合成方法;(3)酶解法。其中,酶解法即是以菜籽分離蛋白為原料,利用商業(yè)蛋白酶制劑水解菜籽蛋白制備菜籽肽。該方法以菜籽分離蛋白為原料,具有操作簡單,產品含量高等優(yōu)點,但是生產所用酶制劑用量大且價格昂貴,導致生產成本較高,并且由于菜籽柏或菜籽分離蛋白中抗營養(yǎng)因子不能完全脫除,影響了蛋白酶的活性,水解程度不高,難以形成大規(guī)模工業(yè)化生產。且在酶解過程中均加入大量堿液或酸液來調節(jié)酶解反應時溶液的酸堿度,且工藝中沒有脫鹽處理,使成品鹽分含量過高;而且,酶解液中含有大量色素類成分,影響成品的色澤。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題:針對酶解法中菜籽柏或菜籽分離蛋白中抗營養(yǎng)因子不能完全脫除,影響了蛋白酶的活性,水解程度不高,難以形成大規(guī)模工業(yè)化生產,同時成品中鹽分含量過高的問題,本發(fā)明首先對脫脂菜籽柏進行高溫加熱,除去抗營養(yǎng)因子硫代葡萄糖苷,得到脫脂菜籽柏混合液,再將其與利用混合菌種培養(yǎng)發(fā)酵得到混合酶液、明膠等物質混合過濾,得到菜籽柏提取液,最后將其與磁性水凝膠等物質混合,利用CO2超臨界進行萃取,即可得到菜籽肽。本發(fā)明主要是利用混合酶液中的植酸酶降解抗營養(yǎng)因子中的植酸,漆酶降解抗營養(yǎng)因子中的芥子堿,而明膠則會與抗營養(yǎng)因子中的單寧形成絡合物沉淀,通過沉淀去除,最后通過磁性水凝膠進行脫鹽,本發(fā)明制備的菜籽肽中含鹽量低,且菜籽肽中的抗營養(yǎng)因子可以有效的脫除,水解程度高,未影響到蛋白酶的活性。
[0005 ]為解決上述技術問題,本發(fā)明采用的技術方案是:
(1)稱取200?300g脫脂菜籽柏加入到燒杯中,向燒杯中加入700?800mL去離子水,加熱至沸騰,保溫I?2h后停止加熱,使其自然冷卻至室溫,得到預處理后的脫脂菜籽柏混合液,備用;
(2)依次稱取10?15g蛋白胨、5?1g牛肉膏、10?15g氯化鈉、10?20g葡萄糖、3?5g硫酸鎂、3?5g硫酸鐵、3?5g磷酸氫二鉀加入到培養(yǎng)皿中,再加入1000?1200mL去離子水,攪拌10?20min,制成培養(yǎng)基;
(3)依次將2?4株芽孢桿菌、2?4株黑曲霉菌、2?4株雜色云芝菌接種到培養(yǎng)基中,在30?35°C下,用搖床振蕩培養(yǎng)72?96h后,將培養(yǎng)液在6000?8000r/min下離心20?30min,棄去上清液,得到混合菌種,備用; (4)向發(fā)酵罐中加入依次加入400?500mL質量濃度為12?14%葡萄糖溶液、5?1g馬鈴薯、5?1g酵母膏、5?1g玉米粉、2?4g氯化錢、2?4g硫酸錢、2?4g磷酸氫二鈉,攪拌制成發(fā)酵液;
(5)向上述發(fā)酵液中加入發(fā)酵液質量10?20%步驟(3)備用的混合菌種,攪拌均勻后,在45?55°C下,發(fā)酵24?26h,待發(fā)酵結束,將發(fā)酵產物在6000?8000r/min下離心30?40min,棄去下層雜質,得到混合酶液;
(6)將上述混合酶液加入到燒瓶中,將燒瓶置于水浴鍋中,控制溫度在40?50°C,再依次加入2?3g纖維素酶、2?3g果膠酶、I?3g半纖維素酶、3?4g明膠,攪拌5?1min后,加入上述步驟(I)備用的預處理后的脫脂菜籽柏混合液,攪拌反應3?4h,待反應結束,將溫度升至90?10tC,攪拌20?30min,過濾,得到濾液,即為菜籽柏提取液;
(7)向菜籽柏提取液中依次加入2?4g活性炭、3?5g磁性水凝膠,攪拌10?20min,過濾,得到濾液,再加入外加磁場,從濾液中將磁性水凝膠回收,得到菜籽肽混合液,將菜籽肽混合液加入到CO2超臨界萃取儀中,控制萃取壓力為25?35MPa,萃取溫度為40?50°C,C02的流量為25?35kg/h,萃取20?30min,得到菜籽肽溶液,將菜籽肽溶液進行減壓蒸餾至膏狀,再置于-20?-10°C真空冷凍干燥器內,干燥5?6h,得到固體粉末,即菜籽肽。
[0006]本發(fā)明制備的菜籽肽蛋白質含量達到97%以上,肽含量為82%以上,產品濃度為lmg/mL時,脂質氧化抑制率達到85%以上,A7QQnm為2.12%,金屬螯合力達到65%以上。
[0007]本發(fā)明與其他方法相比,有益技術效果是:
(1)本發(fā)明制備的菜籽肽含鹽量低,且不會因為大量色素的存在,而影響產品色澤;
(2)本發(fā)明制備的菜籽肽蛋白酶的活性得以提高,提高了20?25%,且水解能力達到12%以上;
(3)本發(fā)明制備步驟簡單,所需成本低。
【具體實施方式】
[0008]首先稱取200?300g脫脂菜籽柏加入到燒杯中,向燒杯中加入700?800mL去離子水,加熱至沸騰,保溫I?2h后停止加熱,使其自然冷卻至室溫,得到預處理后的脫脂菜籽柏混合液,備用;依次稱取10?15g蛋白胨、5?I Og牛肉膏、10?15g氯化鈉、10?20g葡萄糖、3?5g硫酸鎂、3?5g硫酸鐵、3?5g磷酸氫二鉀加入到培養(yǎng)皿中,再加入1000?1200mL去離子水,攪拌10?20min,制成培養(yǎng)基;依次將2?4株芽孢桿菌、2?4株黑曲霉菌、2?4株雜色云芝菌接種到培養(yǎng)基中,在30?35°C下,用搖床振蕩培養(yǎng)72?96h后,將培養(yǎng)液在6000?8000r/min下離心20?30min,棄去上清液,得到混合菌種,備用;再向發(fā)酵罐中加入依次加入400?500mL質量濃度為12?14%葡萄糖溶液、5?I Og馬鈴薯、5?1g酵母膏、5?I Og玉米粉、2?4g氯化銨、2?4g硫酸銨、2?4g磷酸氫二鈉,攪拌制成發(fā)酵液;接著向上述發(fā)酵液中加入發(fā)酵液質量10?20%備用的混合菌種,攪拌均勻后,在45?55°C下,發(fā)酵24?26h,待發(fā)酵結束,將發(fā)酵產物在6000?8000r/min下離心30?40min,棄去下層雜質,得到混合酶液;將上述混合酶液加入到燒瓶中,將燒瓶置于水浴鍋中,控制溫度在40?50°C,再依次加入2?3g纖維素酶、2?3g果膠酶、I?3g半纖維素酶、3?4g明膠,攪拌5?1min后,加入上述備用的預處理后的脫脂菜籽柏混合液,攪拌反應3?4h,待反應結束,將溫度升至90?100°C,攪拌20?30min,過濾,得到濾液,即為菜籽柏提取液;最后向菜籽柏提取液中依次加入2?4g活性炭、3?5g磁性水凝膠,攪拌10?20min,過濾,得到濾液,再加入外加磁場,從濾液中將磁性水凝膠回收,得到菜籽肽混合液,將菜籽肽混合液加入到CO2超臨界萃取儀中,控制萃取壓力為25?35MPa,萃取溫度為40?50°C,C02的流量為25?35kg/h,萃取20?30min,得到菜籽肽溶液,將菜籽肽溶液進行減壓蒸餾至膏狀,再置于-20?-10°C真空冷凍干燥器內,干燥5?6h,得到固體粉末,即菜籽肽。
[0009]實例I
首先稱取300g脫脂菜籽柏加入到燒杯中,向燒杯中加入800mL去離子水,加熱至沸騰,保溫2h后停止加熱,使其自然冷卻至室溫,得到預處理后的脫脂菜籽柏混合液,備用;依次稱取15g蛋白胨、1g牛肉膏、15g氯化鈉、20g葡萄糖、5g硫酸鎂、5g硫酸鐵、5g磷酸氫二鉀加入到培養(yǎng)皿中,再加入1200mL去離子水,攪拌20min,制成培養(yǎng)基;依次將4株芽孢桿菌、4株黑曲霉菌、4株雜色云芝菌接種到培養(yǎng)基中,在35 0C下,用搖床振蕩培養(yǎng)96h后,將培養(yǎng)液在8000r/min下離心30min,棄去上清液,得到混合菌種,備用;再向發(fā)酵罐中加入依次加入500mL質量濃度為14%葡萄糖溶液、1g馬鈴薯、1g酵母膏、1g玉米粉、4g氯化錢、4g硫酸錢、4g磷酸氫二鈉,攪拌制成發(fā)酵液;接著向上述發(fā)酵液中加入發(fā)酵液質量20%備用的混合菌種,攪拌均勻后,在550C下,發(fā)酵26h,待發(fā)酵結束,將發(fā)酵產物在8000r/min下離心40min,棄去下層雜質,得到混合酶液;將上述混合酶液加入到燒瓶中,將燒瓶置于水浴鍋中,控制溫度在50°C,再依次加入3g纖維素酶、3g果膠酶、3g半纖維素酶、4g明膠,攪拌1min后,加入上述備用的預處理后的脫脂菜籽柏混合液,攪拌反應4h,待反應結束,將溫度升至100°C,攪拌30min,過濾,得到濾液,即為菜籽柏提取液;最后向菜籽柏提取液中依次加入4g活性炭、5g磁性水凝膠,攪拌20min,過濾,得到濾液,再加入外加磁場,從濾液中將磁性水凝膠回收,得到菜籽肽混合液,將菜籽肽混合液加入到CO2超臨界萃取儀中,控制萃取壓力為35MPa,萃取溫度為50°C,CO2的流量為35kg/h,萃取30min,得到菜籽肽溶液,將菜籽肽溶液進行減壓蒸餾至膏狀,再置于-10°C真空冷凍干燥器內,干燥6h,得到固體粉末,即菜籽肽。經檢測,本發(fā)明制備的菜籽肽含鹽量低,且不會因為大量色素的存在,而影響產品色澤;且本發(fā)明制備的菜籽肽蛋白酶的活性得以提高,提高了 25%,且水解能力達到13%。
[0010]實例2
首先稱取200g脫脂菜籽柏加入到燒杯中,向燒杯中加入700mL去離子水,加熱至沸騰,保溫Ih后停止加熱,使其自然冷卻至室溫,得到預處理后的脫脂菜籽柏混合液,備用;依次稱取1g蛋白胨、5g牛肉膏、1g氯化鈉、1g葡萄糖、3g硫酸鎂、3g硫酸鐵、3g磷酸氫二鉀加入到培養(yǎng)皿中,再加入100mL去離子水,攪拌lOmin,制成培養(yǎng)基;依次將2株芽孢桿菌、2株黑曲霉菌、2株雜色云芝菌接種到培養(yǎng)基中,在30 °C下,用搖床振蕩培養(yǎng)72h后,將培養(yǎng)液在6000r/min下離心20min,棄去上清液,得到混合菌種,備用;再向發(fā)酵罐中加入依次加入400mL質量濃度為12%葡萄糖溶液、5g馬鈴薯、5g酵母膏、5g玉米粉、2g氯化錢、2g硫酸錢、2g磷酸氫二鈉,攪拌制成發(fā)酵液;接著向上述發(fā)酵液中加入發(fā)酵液質量10%備用的混合菌種,攪拌均勻后,在450C下,發(fā)酵24h,待發(fā)酵結束,將發(fā)酵產物在6000r/min下離心30min,棄去下層雜質,得到混合酶液;將上述混合酶液加入到燒瓶中,將燒瓶置于水浴鍋中,控制溫度在40?500C,再依次加入2g纖維素酶、2g果膠酶、Ig半纖維素酶、3g明膠,攪拌5min后,加入上述備用的預處理后的脫脂菜籽柏混合液,攪拌反應3h,待反應結束,將溫度升至90°C,攪拌20min,過濾,得到濾液,即為菜籽柏提取液;最后向菜籽柏提取液中依次加入2g活性炭、3g磁性水凝膠,攪拌lOmin,過濾,得到濾液,再加入外加磁場,從濾液中將磁性水凝膠回收,得到菜籽肽混合液,將菜籽肽混合液加入到CO2超臨界萃取儀中,控制萃取壓力為25MPa,萃取溫度為400C,CO2的流量為25kg/h,萃取20min,得到菜籽肽溶液,將菜籽肽溶液進行減壓蒸餾至膏狀,再置于-20°C真空冷凍干燥器內,干燥5h,得到固體粉末,即菜籽肽。
[0011]本發(fā)明制備的菜籽肽含鹽量低,且不會因為大量色素的存在,而影響產品色澤;且本發(fā)明制備的菜籽肽蛋白酶的活性得以提高,提高了 20%,且水解能力達到13.2%。
[0012]實例3
首先稱取250g脫脂菜籽柏加入到燒杯中,向燒杯中加入750mL去離子水,加熱至沸騰,保溫Ih后停止加熱,使其自然冷卻至室溫,得到預處理后的脫脂菜籽柏混合液,備用;依次稱取12g蛋白胨、7g牛肉膏、12g氯化鈉、15g葡萄糖、4g硫酸鎂、4g硫酸鐵、4g磷酸氫二鉀加入到培養(yǎng)皿中,再加入IlOOmL去離子水,攪拌15min,制成培養(yǎng)基;依次將3株芽孢桿菌、3株黑曲霉菌、3株雜色云芝菌接種到培養(yǎng)基中,在33 °C下,用搖床振蕩培養(yǎng)80h后,將培養(yǎng)液在7000r/min下離心25min,棄去上清液,得到混合菌種,備用;再向發(fā)酵罐中加入依次加入450mL質量濃度為13%葡萄糖溶液、7g馬鈴薯、8g酵母膏、8g玉米粉、3g氯化錢、3g硫酸錢、3g磷酸氫二鈉,攪拌制成發(fā)酵液;接著向上述發(fā)酵液中加入發(fā)酵液質量15%備用的混合菌種,攪拌均勻后,在500C下,發(fā)酵25h,待發(fā)酵結束,將發(fā)酵產物在7000r/min下離心35min,棄去下層雜質,得到混合酶液;將上述混合酶液加入到燒瓶中,將燒瓶置于水浴鍋中,控制溫度在45°C,再依次加入2g纖維素酶、2g果膠酶、2g半纖維素酶、3g明膠,攪拌7min后,加入上述備用的預處理后的脫脂菜籽柏混合液,攪拌反應3h,待反應結束,將溫度升至95°C,攪拌25min,過濾,得到濾液,即為菜籽柏提取液;最后向菜籽柏提取液中依次加入3g活性炭、4g磁性水凝膠,攪拌15min,過濾,得到濾液,再加入外加磁場,從濾液中將磁性水凝膠回收,得到菜籽肽混合液,將菜籽肽混合液加入到CO2超臨界萃取儀中,控制萃取壓力為30MPa,萃取溫度為45°C,CO2的流量為30kg/h,萃取25min,得到菜籽肽溶液,將菜籽肽溶液進行減壓蒸餾至膏狀,再置于_15°C真空冷凍干燥器內,干燥6h,得到固體粉末,即菜籽肽。
[0013]本發(fā)明制備的菜籽肽含鹽量低,且不會因為大量色素的存在,而影響產品色澤;且本發(fā)明制備的菜籽肽蛋白酶的活性得以提高,提高了 24%,且水解能力達到12.5%。
【主權項】
1.一種酶菌協(xié)同制備菜籽肽的方法,其特征在于具體制備步驟為: (1)稱取200?300g脫脂菜籽柏加入到燒杯中,向燒杯中加入700?800mL去離子水,加熱至沸騰,保溫I?2h后停止加熱,使其自然冷卻至室溫,得到預處理后的脫脂菜籽柏混合液,備用; (2)依次稱取10?15g蛋白胨、5?1g牛肉膏、10?15g氯化鈉、10?20g葡萄糖、3?5g硫酸鎂、3?5g硫酸鐵、3?5g磷酸氫二鉀加入到培養(yǎng)皿中,再加入1000?1200mL去離子水,攪拌10?20min,制成培養(yǎng)基; (3)依次將2?4株芽孢桿菌、2?4株黑曲霉菌、2?4株雜色云芝菌接種到培養(yǎng)基中,在30?35°C下,用搖床振蕩培養(yǎng)72?96h后,將培養(yǎng)液在6000?8000r/min下離心20?30min,棄去上清液,得到混合菌種,備用; (4)向發(fā)酵罐中加入依次加入400?500mL質量濃度為12?14%葡萄糖溶液、5?1g馬鈴薯、5?1g酵母膏、5?1g玉米粉、2?4g氯化錢、2?4g硫酸錢、2?4g磷酸氫二鈉,攪拌制成發(fā)酵液; (5)向上述發(fā)酵液中加入發(fā)酵液質量10?20%步驟(3)備用的混合菌種,攪拌均勻后,在45?55°C下,發(fā)酵24?26h,待發(fā)酵結束,將發(fā)酵產物在6000?8000r/min下離心30?40min,棄去下層雜質,得到混合酶液; (6)將上述混合酶液加入到燒瓶中,將燒瓶置于水浴鍋中,控制溫度在40?50°C,再依次加入2?3g纖維素酶、2?3g果膠酶、I?3g半纖維素酶、3?4g明膠,攪拌5?1min后,加入上述步驟(I)備用的預處理后的脫脂菜籽柏混合液,攪拌反應3?4h,待反應結束,將溫度升至90?10tC,攪拌20?30min,過濾,得到濾液,即為菜籽柏提取液; (7)向菜籽柏提取液中依次加入2?4g活性炭、3?5g磁性水凝膠,攪拌10?20min,過濾,得到濾液,再加入外加磁場,從濾液中將磁性水凝膠回收,得到菜籽肽混合液,將菜籽肽混合液加入到CO2超臨界萃取儀中,控制萃取壓力為25?35MPa,萃取溫度為40?50°C,C02的流量為25?35kg/h,萃取20?30min,得到菜籽肽溶液,將菜籽肽溶液進行減壓蒸餾至膏狀,再置于-20?-10°C真空冷凍干燥器內,干燥5?6h,得到固體粉末,即菜籽肽。
【文檔編號】C12R1/685GK105950696SQ201610484298
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】郭舒洋, 薛培龍, 孟浩影
【申請人】郭舒洋