本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測大米中乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
乙草胺是廣譜、保護性殺菌劑。作用機理是能與真菌細胞中的三磷酸甘油醛脫氫酶發(fā)生作用，與該酶中含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而破壞該酶活性，使真菌細胞的新陳代謝受破壞而失去生命力。乙草胺沒有內(nèi)吸傳導(dǎo)作用，但噴到植物體上之后，能在體表上有良好的黏著性，不易被雨水沖刷掉，因此藥效期較長。因此定期對乙草胺殘留進行檢測成為許多國家的監(jiān)控的必要手段。
酶聯(lián)免疫吸附法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測行業(yè)。本發(fā)明旨在建立一種檢測乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服色譜法的不足，本發(fā)明提供一種檢測乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。
本發(fā)明檢測乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標(biāo)板、乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品、乙草胺抗體工作液、乙草胺酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。
本發(fā)明檢測乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備，包括以下步驟：酶標(biāo)板的制備、乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品的制備、乙草胺抗體工作液的制備、乙草胺酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。
其進一步特征在于：所述的酶標(biāo)板經(jīng)由乙草胺抗原包被制備，具體步驟是將乙草胺半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將乙草胺包被抗原稀釋成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入經(jīng)稀釋的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4℃條件下保存。
乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
所述乙草胺抗體工作液是采用乙草胺人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。
所述乙草胺酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
檢測乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法包括以下步驟：
(1)預(yù)處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有乙草胺抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μL/孔到對應(yīng)的微孔中，加入乙草胺酶標(biāo)二抗工作液，50 μL/孔，然后加入乙草胺抗體工作液，50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；
(4)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260 μL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(5)加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15～20 min；
(6)加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測，測定每孔吸光度值（請在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）；
(7)以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中乙草胺的含量。
本發(fā)明檢測乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法的測定原理：樣品中的乙草胺與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中乙草胺的含量。如果樣品中的乙草胺含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的快速檢測。
具體實施方式
乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備：
采用琥珀酸酐法得到帶羧基的乙草胺半抗原衍生物，之后取0.05 mmol與載體蛋白BSA按10：1的結(jié)合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入0.15 mmol碳二亞胺，攪拌置室溫反應(yīng)24 h，最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS緩沖液中透析兩天，除去未反應(yīng)的半抗原，將得到的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
乙草胺抗體的制備：
選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備的免疫抗原50μg與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測定抗血清效價至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進行末次免疫，3天后取脾制備脾細胞懸浮液與骨髓瘤細胞進行細胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細胞系進行克隆化，選擇處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞進行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多時用注射器抽取腹水，反復(fù)收集數(shù)次，4000 rpm離心15 min，收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對單克隆抗體進行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
制備包被有乙草胺包被抗原的酶標(biāo)板：
包被抗原是將乙草胺半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到的，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將乙草胺抗原稀釋成1:40000比例，100 μL/孔，37℃放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4℃下保存。
乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
乙草胺抗體工作液的制備：采用乙草胺人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。
乙草胺酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，終止液為2 mol/L的硫酸，濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5% 吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測乙草胺的酶聯(lián)免疫試劑盒包括如下材料：
(1)96孔酶標(biāo)板×1塊；
(2)標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：(1mL/瓶) 0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg；
(3)抗體工作液 7 mL；
(4)酶標(biāo)二抗工作液 7 mL；
(5)底物液A 7 mL；
(6)底物液B 7 mL；
(7)終止液 7 mL；
(8)10×濃縮稀釋液 40 mL；
(9)10×濃縮洗滌液 40 mL；
本發(fā)明的試劑盒用于檢測農(nóng)作物樣本中乙草胺殘留量時，通過以下步驟實施：樣品預(yù)處理、用本發(fā)明試劑盒進行檢測、分析結(jié)果。
(1)用本發(fā)明試劑盒檢測待測樣品中乙草胺殘留量
取包被有乙草胺抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μL/孔到對應(yīng)的微孔中；加入酶標(biāo)二抗工作液，50 μL/孔，然后加入乙草胺抗體工作液，50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300 μL/孔，充分洗滌4次，浸泡15-30 s，用吸水紙拍干；加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min；加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測，測定每孔吸光度值（請在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）；對比待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值大小，定量分析待測樣品中乙草胺殘留量。
(2)分析結(jié)果
百分吸光度值的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值(%) ＝B/B0×100%
其中B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0—0 ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。
以乙草胺的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。將樣本的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中乙草胺的實際濃度。