本發(fā)明屬于獸藥殘留檢測領域，具體涉及一種檢測氟苯尼考胺殘留的方法及應用。
背景技術：
：目前，針對動物源食品檢測氟苯尼考胺大多采用的方法為：酶聯(lián)免疫法或者高效液相色譜法，這些方法檢出限為1mg/kg或者更高，有的采用液質法進行分析，前處理用C18柱或者液液分配凈化，雜質凈化不徹底且只針對單一基質：雞蛋，基體覆蓋不全面，不能適應實際應用需求。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術中的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種針對多種基質、操作簡便、靈敏度高、重復性好、檢測限低的檢測氟苯尼考胺殘留的方法。為達到以上目的，本發(fā)明采取的技術方案是：一種檢測氟苯尼考胺殘留的方法，利用乙腈乙酸乙酯提取樣品中氟苯尼考胺殘留物，之后使用高效液相色譜質譜聯(lián)用儀檢測氟苯尼考胺殘留；所述乙腈乙酸乙酯為乙腈和乙酸乙酯按1∶1的體積比混合而成。在上述方案的基礎上，所述檢測氟苯尼考胺殘留的方法步驟如下：1)提取純化稱量2.00g樣品，加入15mL乙腈乙酸乙酯，超聲20min，4000r/min離心5min，取上清液，重復操作兩次合并上清液于雞心瓶中，在合并后的上清液中加入3mL5％乙酸溶液，旋蒸至無回流；將剩余液體倒入離心管，再用4mL5％乙酸溶液清洗雞心瓶后倒入離心管中；加入10mL正己烷，渦旋振蕩1min，4000r/min離心5min，除去正己烷層，提取液備用；2)凈化柱凈化用2mL甲醇和2mL水平衡活化PCX凈化柱后，上樣，用3mL5％甲酸甲醇溶液淋洗2次，抽干；然后用6mL20％氨水甲醇溶液洗脫，接收洗脫液，旋蒸至干；加入2mL甲醇水溶液渦旋定容；過0.22μm濾膜，待測；3)利用高效液相色譜質譜聯(lián)用儀檢測氟苯尼考胺殘留色譜參數(shù)為：色譜柱：XDB-C181.8μm，4.6mm*50mm；柱溫：40度；流速：0.3mL/min；進樣量：2μL；流動相為：A：0.1％甲酸水，B：甲醇；質譜參數(shù)為：離子源：ESI源+；GasTemp：300℃；GasFlow：10L/min；Nebulizer：45psi；SheathGasTem：375℃：SheathGasflow：11L/min。在上述方案的基礎上，所述檢測氟苯尼考胺殘留方法的應用于檢測動物源性食品中氟苯尼考胺的殘留。在上述方案的基礎上，所述動物源性食品為肌肉、肝臟、牛奶和蛋類。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所要檢測的氟苯尼考胺屬于極性化合物，乙腈極性也很大，根據(jù)相似相溶的原理，用純乙腈提取的樣品極性雜質多，從而干擾氟苯尼考胺的凈化，而乙酸乙酯屬于偏弱極性的物質，利用兩者混合作為提取溶劑，既能提高目標化合物的提取效率，又能減少極性雜質的干擾；旋蒸時加入5％乙酸水溶液可使氟苯尼考胺成離子狀態(tài)，溶解在水溶液中，為下一步過PCX凈化柱做準備；正己烷為非極性溶劑，提取中加入正己烷可將基質中的非極性雜質進一步提取出來；PCX凈化柱具有苯磺酸型官能團，可吸附離子化的氟苯尼考胺，用5％甲酸甲醇溶液淋洗，可進一步除去基質中的極性雜質；氨水甲醇溶液具有較高的離子強度，洗脫時可將氟苯尼考胺從PCX凈化柱上替換下來。本方法采用UPLC-MSMS進行儀器分析，基體覆蓋肌肉、肝臟、牛奶、蛋類等動物源食品，檢出限低為1μg/kg；本發(fā)明中使用乙腈乙酸乙酯進行提取，正己烷除雜，相比于其他方法，操作簡便；使用PCX固相萃取柱，選擇性強，回收率高，有效去除雜質；使用高效液相色譜質譜聯(lián)用儀，并采用多反應監(jiān)測(MRM)采集方法，相比于單一的高效液相色譜，具有靈敏度高、重復性好、檢測限低的優(yōu)勢，并且大大減少雜質干擾，這對儀器及色譜柱保護性大，使儀器的維護及重現(xiàn)性得到很大的提高。附圖說明圖1氟苯尼考胺的高效液相質譜圖，其中縱坐標為響應，橫坐標為m/z；圖2氟苯尼考胺保留時間的測定，其中縱坐標為響應，橫坐標為保留時間；圖3氟苯尼考胺的定量限測定，其中縱坐標為響應，橫坐標為保留時間，3個圖上、中、下分別代表3個子離子的S/N。圖4氟苯尼考胺的標準曲線，其中縱坐標為峰面積響應，橫坐標為氟苯尼考胺濃度。具體實施方式在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細的描述本發(fā)明。以下實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1.標準溶液的配制1.1儲備液的配制準確稱量10.00mg氟苯尼考胺，溶解到甲醇中，定容到10mL，作為1000μg/mL的儲備液(實際濃度應乘以氟苯尼考胺的純度)，置于4℃冷藏保存；1.2標準中間液的配制準確量取1mL氟苯尼考胺，溶解到甲醇中，定容到10mL，作為100μg/mL的儲備液，置于4℃冷藏保存；1.3標準工作曲線的配制用標準中間液配制成1、2、5、10、20ng/mL的標液(用甲醇+水(v/v＝1:1)定容)，作為工作曲線用的標準溶液。2.樣品處理2.1提取純化精確稱量2.00g±0.01g樣品于50mL離心管，加入15mL乙腈乙酸乙酯(v/v＝1:1)，超聲20min，4000r/min離心5min，取上清液于100mL雞心瓶中，重復操作兩次合并上清液，加入3mL5％乙酸溶液，旋蒸至無回流。將剩余液體倒入新50mL離心管，再用4mL5％乙酸溶液清洗該雞心瓶，并倒入新50mL離心管中。加入10mL正己烷，渦旋振蕩1min，4000r/min離心5min，除去正己烷層，提取液備用。2.2凈化柱凈化用2mL甲醇和2mL水平衡活化PCX凈化柱后，將上述提取液加入PCX凈化柱中凈化，并用3mL5％甲酸甲醇溶液淋洗2次，抽干。然后用6mL20％氨水甲醇溶液洗脫，接收洗脫液，旋蒸至干。加入2mL甲醇水溶液(v/v＝1:1)渦旋定容。過0.22μm濾膜，待測。3.高效液相色譜質譜聯(lián)用儀檢測氟苯尼考胺殘留量使用的高效液相色譜質譜聯(lián)用儀為AgilentLC-MSMS1290/6460，色譜參數(shù)為：色譜柱：XDB-C181.8μm，4.6mm*50mm；柱溫：40度；流速：0.3mL/min；進樣量：2μL；流動相為：A：0.1％甲酸水，B：甲醇；流動相的梯度如表1所示：表1流動相梯度Time(min)B％0.00201.00203.00904.00904.01205.5020質譜參數(shù)為：離子源：ESI源+；GasTemp：300℃；GasFlow：10L/min；Nebulizer：45psi；SheathGasTem：375℃：SheathGasflow：11L/min。4.結果及分析4.1專屬性如圖1所示，1ppm氟苯尼考胺上機，通過質譜優(yōu)化各得到3個離子對，其中縱坐標為響應，橫坐標為m/z。質譜結果如表2所示：表2質譜結果50ppb氟苯尼考胺通過C18色譜柱分離，確定保留時間。如圖2所示，保留時間約為1.5min，且色譜的峰形較佳，無干擾峰出現(xiàn)。4.2定量限在基質中添加相當于樣品含有1.0μg/kg的標準品，經(jīng)前處理上機檢測，計算其信噪比(S/N)＞10，如圖3所示。測得該方法的定量限：1.0μg/kg。4.3標準曲線精密吸取氟苯尼考胺標準品，用50％甲醇水溶液稀釋成系列濃度為2，5，10，20，50ng/mL標準溶液，分別進樣測定，以峰面積響應為縱坐標，氟苯尼考胺濃度為橫坐標，繪制標準曲線如圖4所示：得到氟苯尼考胺的回歸方程為Y＝2970.653983*X-2691.191137，R2＝0.9996，由相關系數(shù)可見，在2ng/mL～50ng/mL標準曲線線性范圍內，UPLC-MSMS法測定線性關系良好，此標準曲線可以用于準確定量。4.4空白樣品添加回收空白樣品添加回收如表3所示：表3空白樣品添加回收添加回收選取市場上脂肪含量高的豬肉、低的牛肉、雞蛋、超市購買的鴨肝、牛奶做質控實驗，回收率均在70％-95％之間，說明本方法穩(wěn)定性良好。5.結論通過運用UPLC-LCMSMS法對動物源基體中的氟苯尼考胺進行測定，確定用乙腈：乙酸乙酯＝1:1的體積比進行提取，PCX小柱進行凈化，可使氟苯尼考胺色譜峰達到基線分離，峰形良好，檢測限低，靈敏度高，回收穩(wěn)定，本發(fā)明為動物源基質中的氟苯尼考胺殘留量的測定建立了一種可靠地分析方法。當前第1頁1 2 3