Psa的elisa試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及PSA的ELISA試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺特異抗原（prostatespecificantigen，PSA)是與前列腺癌相關(guān)的一種抗 原，屬糖蛋白類物質(zhì)，分子量約為34KD，pH為6. 8~7. 5,等電點為6. 9,半衰期為2. 2 士 0. 8 天。PSA存在于前列腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和前列腺上皮細胞及分泌物當(dāng)中，正常前列腺及病變前列腺組 織內(nèi)均含有PSA。它是公認(rèn)的診斷前列腺癌的較好的腫瘤標(biāo)志物，其診斷前列腺癌的特異性 為82%-97%。前列腺癌在男性所有類型癌中占10%~20%，是男性最常見的癌腫。該病 進展緩慢，是威脅50歲以上男性生命的主要癌癥，在西方國家占男性死亡率的第二位。流 行病學(xué)調(diào)查表明，隨著我國居民生活水平的改善，環(huán)境污染的加劇以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，前 列腺癌的發(fā)病率日趨上升，已引起臨床上的高度重視。美國FDA已批準(zhǔn)將PSA檢測作為50 歲以上男性的普查指標(biāo)。研宄顯示，PSA測定在早期診斷前列腺癌上要優(yōu)于直腸指檢。正 常男性的PSA值<4ug/L。
[0003] PSA在血液中以游離和結(jié)合兩種形式存在。其中游離PSA(freePSA，F(xiàn)-PSA)只 占小部分，結(jié)合型（comlexedPSA，C-PSA)占大部分，即與內(nèi)源性蛋白酶抑制物前列腺癌 a1-抗糜蛋白酶（al-antichymotrysin，ACT)結(jié)合成PSA-ACT復(fù)合物，以及與另一種蛋白 抑制物a2-巨球蛋白（a2-macroglobulin，a2M)結(jié)合成PSA-a2M。在精液中，PSA還與 C蛋白抑制物構(gòu)成復(fù)合物。由于PSA-a2M不具有免疫活性，不能被現(xiàn)有的PSA檢測法檢測 到。所以目前可定量檢測到的PSA有3種：T-PSA(總PSA)，F(xiàn)-PSA，PSA-ACT。
[0004] 測量血清中總PSA可以用于篩選和早期診斷前列腺癌，它是公認(rèn)的診斷前列腺癌 的較好的腫瘤標(biāo)志物。研宄顯示，總PSA測定在早期診斷前列腺癌上要優(yōu)于直腸指檢。美 國FDA已批準(zhǔn)將總PSA檢測作為50歲以上男性的普查指標(biāo)。使用總PSA作為診斷前列腺 癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)是：總PSA:0~4ng/ml正常；4~10ng/mL，21~25%的患癌幾率；>10ng/ml 癌癥。在4. 0~10ng/ml的灰色區(qū)域，單獨檢測總PSA無法區(qū)分癌癥和良性增生。游離PSA 可提供更好的生化指標(biāo)，用于區(qū)分總PSA4~10ng/ml的前列腺癌和良性增生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測游離PSA的酶聯(lián)免疫試劑盒，其由PSA標(biāo)準(zhǔn)品、 對照液、游離PSA單克隆抗體包被的酶標(biāo)板、辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的游離PSA單克隆 抗體溶液和輔助試劑組成。
[0006] 在本發(fā)明中，包被酶標(biāo)板的游離PSA單克隆抗體和HRP標(biāo)記的游離PSA單克隆抗 體為配對抗體，并且可通過商業(yè)渠道獲得。
[0007] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述包被酶標(biāo)板的制備過程為：將包被用游離PSA 單克隆抗體用〇. 05M碳酸鹽緩沖液（pH值為9. 5)稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100y1，吸 附過夜，用0. 05M磷酸鹽緩沖液（pH值為9. 5)洗板，再用封閉液封閉過夜，甩干后晾干，即 獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板。所述封閉液為含lg/L的BSA、0.lg/L的蔗糖和0. 5g/L的酪 蛋白（Casein)的 15mmol/LPBS緩沖液，pH值為 9. 5。
[0008] 所述HRP標(biāo)記的游離PSA單克隆抗體溶液為含0. 5mg/L的HRP標(biāo)記的游離PSA單 克隆抗體和〇. 2mg/L的PEG200的15mmol/LPBS緩沖液，pH值為8. 5。
[0009] 所述輔助試劑包括對照緩沖液、底物溶液、顯色液、反應(yīng)終止液和清洗緩沖液，各 試劑具體為：
[0010] 對照緩沖液為15mmol/L的PBS(pH7. 4)緩沖液；
[0011] 底物溶液為磷酸-檸檬酸緩沖液（PH7. 4)配制的3%過氧化氫溶液，并且溶液中 0.lmg/L的焦磷酸二氫鈉；
[0012] 顯色液為四甲基聯(lián)苯胺（TMB)的甲醇溶液，濃度為0.lmg/ml;
[0013] 反應(yīng)終止液為3mol/L硫酸；
[0014] 清洗緩沖液為15臟〇1/1的？85&117.4)配制的0.05%吐溫20溶液。
[0015] 本發(fā)明所述游離PSA的酶聯(lián)免疫試劑盒的最低檢測限可以達到0.Ing/mLPSA，并 且穩(wěn)定性極佳，在室溫條件下可保存1年，在4°C下可保存3年。
【具體實施方式】
[0016] 下面將結(jié)合舉例來說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保 護的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍以所附權(quán) 利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0017] 實施例1
[0018] 試劑盒組成：游離PSA單克隆抗體包被酶標(biāo)板（96孔）；辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo) 記的游離PSA單克隆抗體溶液1瓶，6ml/瓶；對照緩沖液1瓶；游離PSA標(biāo)準(zhǔn)品1瓶，底物 溶液、顯色液各1瓶，各5ml/瓶；反應(yīng)終止液1瓶，5ml/瓶；清洗緩沖液（20X濃縮）1瓶， 30ml/ 瓶。
[0019] 游離PSA單克隆抗體包被酶標(biāo)板的制備過程為：將包被用游離PSA單克隆抗體 用0. 05M碳酸鹽緩沖液（pH值為9. 5)稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100y1，吸附過夜，用 0.05M磷酸鹽緩沖液（pH值為9. 5)洗板，再用封閉液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆 抗體包被酶標(biāo)板。所述封閉液為含lg/L的BSA、0.lg/L的鹿糖和0. 5g/L的酪蛋白（Casein) 的15mmol/LPBS緩沖液，pH值為9. 5。
[0020] HRP標(biāo)記的游離PSA單克隆抗體溶液為含0. 5mg/L的HRP標(biāo)記的游離PSA單克隆 抗體和0. 2mg/L的PEG200的15mmol/LPBS緩沖液，pH值為8. 5。具體過程為：以NaI04-乙 二醇法進行HRP的氧化，達到終濃度15mg/ml。單克隆抗體和HRP在堿性碳酸鹽緩沖液中透 析9小時，實現(xiàn)HRP對單克隆抗體的標(biāo)記，反應(yīng)結(jié)束后用NaBH4溶液終止反應(yīng)，再對PBS透 析過夜。用飽和硫酸銨沉淀，獲得純化的HRP酶標(biāo)抗游離PSA單克隆抗體。再用含0. 2mg/ L的PEG200的15mmol/LPBS緩沖液溶解至抗體終濃度0. 5mg/L。
[0021] 對照緩沖液為15mmol/L的PBS(pH7. 4)緩沖液；
[0022] 底物溶液為磷酸-檸檬酸緩沖液（pH7. 4)配制的3%過氧化氫溶液，并且溶液中 0.lmg/L的焦磷酸二氫鈉；
[0023] 顯色液為四甲基聯(lián)苯胺（TMB)的甲醇溶液，濃度為0.lmg/ml;
[0024] 反應(yīng)終止液為3mol/L硫酸；
[0025] 清洗緩沖液（IX)組成為15mmol/L的PBS(pH7. 4)配制的0. 05%吐溫20溶液。
[0026] 實施例2試劑盒靈敏度考察
[0027] 分別配制PSA標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的PBS緩沖液，濃度分別為0.lng/ml，0. 5ng/ml， lng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，采用實施例1制備的試劑盒進行檢測，以對照緩沖液作 為空白對照，具體檢測方法如下：
[0028] a)抗原-抗體反應(yīng)：在包被酶標(biāo)板的微孔中分別加入50y1PSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液和對 照緩沖液，37°C水浴保溫50分鐘。清洗緩沖液洗板操作5次。
[0029] b)將HRP標(biāo)記的PSA單克隆抗體溶液加入各孔，每孔100y1，37°C水浴保溫50分 鐘。重復(fù)洗板操作5次。
[0030] C)顯色反應(yīng)：每孔依次加入底物溶液，顯色液各50y1，37°C水浴保溫20分鐘，每 孔再加入50y1反應(yīng)終止液結(jié)束反應(yīng)。
[0031] d)比色：用酶標(biāo)儀在450nm測定OD值并記錄。
[0032] e)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測定的OD值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo) 準(zhǔn)曲線；計算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2,當(dāng)R2> 0. 99時本次測定有效；
[0033] 計算PSA標(biāo)準(zhǔn)品與空白對照的比值，當(dāng)比值大于2時，說明試劑盒可以測定該濃度 的PSA標(biāo)準(zhǔn)品，最低濃度即為試劑盒的靈敏度，平行試驗五次取平均值，具體結(jié)果如下：
[0034] 0.lng/mlPSA標(biāo)準(zhǔn)品及對照緩沖液0045。吸光度值
【主權(quán)項】
1. 一種檢測游離PSA的酶聯(lián)免疫試劑盒，其由PSA標(biāo)準(zhǔn)品、對照液、游離PSA單克隆抗 體包被的酶標(biāo)板、辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的游離PSA單克隆抗體溶液和輔助試劑組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述包被酶標(biāo)板的制備過程 為：將包被用游離PSA單克隆抗體用0. 05M碳酸鹽緩沖液（pH值為9. 5)稀釋后加入酶標(biāo)板 各孔，每孔100 U 1，吸附過夜，用0. 05M磷酸鹽緩沖液（pH值為9. 5)洗板，再用封閉液封閉 過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述封閉液為含lg/L的BSA、 〇. lg/L的蔗糖和0. 5g/L的酪蛋白（Casein)的15mmol/L PBS緩沖液，pH值為9. 5。。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述HRP標(biāo)記的游離PSA單 克隆抗體溶液為含0. 5mg/L的HRP標(biāo)記的游離PSA單克隆抗體和0. 2mg/L的PEG200的 15mmol/L PBS 緩沖液，pH 值為 8. 5。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，對照緩沖液為15mmol/L的 PBS(pH7.4)緩沖液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，底物溶液為磷酸-檸檬酸緩沖 液（pH7. 4)配制的3 %過氧化氫溶液，并且溶液中0. lmg/L的焦磷酸二氫鈉。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，顯色液為四甲基聯(lián)苯胺（TMB) 的甲醇溶液，濃度為〇. lmg/ml ;
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，反應(yīng)終止液為3mol/L硫酸； 清洗緩沖液為15臟〇1/1的？83(?117.4)配制的0.05%吐溫20溶液。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種檢測游離PSA的酶聯(lián)免疫試劑盒，其由PSA標(biāo)準(zhǔn)品、對照液、游離PSA單克隆抗體包被的酶標(biāo)板、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的游離PSA單克隆抗體溶液和輔助試劑組成。
【IPC分類】G01N33-574
【公開號】CN104849459
【申請?zhí)枴緾N201510318891
【發(fā)明人】陳立國, 胡申剛
【申請人】廣州華弘生物科技有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年6月11日