試劑盒及確定待測(cè)dna樣本預(yù)定snp位點(diǎn)的基因型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及試劑盒及確定待測(cè)DNA樣本預(yù)定SNP位點(diǎn)的基因型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 華發(fā)林(Warfarin，也稱(chēng)為"華法林")是臨床上最常用的香豆素類(lèi)口服型強(qiáng)抗凝藥 物，廣泛用于心臟瓣膜置換、房顫、肺栓塞、再次腦卒中（中風(fēng)）等深度動(dòng)靜脈血栓性疾病的 預(yù)防和治療。該藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-(a-苯基丙酮）-4-羥基香豆素，為兩種光學(xué)同分異構(gòu) 體R型和S型的消旋體（racemic)混合物，其中S異構(gòu)體的抗凝作用比R異構(gòu)體更強(qiáng)3~5 倍。華法林使用劑量在不同種族間及個(gè)體間存在較大差異，甚至可相差10到20倍。影響 華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等。華 法林國(guó)際藥理學(xué)聯(lián)盟在新英格蘭發(fā)表的研究顯示，加入藥物基因組學(xué)的預(yù)測(cè)模型(包括基 因型）比臨床預(yù)測(cè)模型(不包括基因型）準(zhǔn)確性提高了 80%。所以個(gè)體的遺傳特征對(duì)于華法 林的劑量影響很大。
[0003] 目前研究發(fā)現(xiàn)與華法林藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)相關(guān)的基因達(dá)30多種，起主要作用的有2 種，VKORCl為其中之一。美國(guó)FDA在華法林用藥說(shuō)明書(shū)里介紹了 VKORCl基因?qū)┝康挠?響并建議在用藥之前做基因檢測(cè)。VKORCl基因編碼的蛋白質(zhì)為組成維生素 K環(huán)氧化物還原 酶復(fù)合體亞單位之一，主導(dǎo)維生素 K依賴(lài)性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點(diǎn)。VKORCl 基因啟動(dòng)子區(qū)-1639G > A多態(tài)性位點(diǎn)（rs9923231)與華法林臨床用藥劑量相關(guān)。與AA基 因型啟動(dòng)子相比，GG和AG基因型啟動(dòng)子活性高，凝血因子生成較多，患者臨床表現(xiàn)出華法 林抵抗。在亞洲人群中研究結(jié)果顯示，VKORCl的基因多態(tài)對(duì)華法林劑量差異的影響達(dá)到了 16-30%。因而，華法林用藥之前，需藥個(gè)體的VKORCl基因的rs9923231位點(diǎn)的基因型檢測(cè) 和分型，意義重大。
[0004] 然而，現(xiàn)階段VKORCl基因的rs9923231位點(diǎn)的檢測(cè)和基因型分型的方法仍有待改 進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0006] 目前檢測(cè)SNP位點(diǎn)的最簡(jiǎn)單的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通過(guò)應(yīng)用特異性限 制性?xún)?nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并根據(jù)消化位點(diǎn)是否消失來(lái)判斷其變異存在與否。但該方 法操作復(fù)雜，樣本量多時(shí)易造成PCR產(chǎn)物的交叉污染且容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過(guò)度而 出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，可靠性低。多重PCR方法盡管特異性有所提高，但是仍然是基于 普通PCR的原理，引物特異性以及低保真Taq酶等這些因素均可造成對(duì)結(jié)果的影響。DNA測(cè) 序法雖然是目前進(jìn)行基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但步驟繁瑣，過(guò)程復(fù)雜，試劑價(jià)格昂貴，容易出現(xiàn) 樣本間的交叉污染而導(dǎo)致測(cè)序失??；另外測(cè)序儀的裝備也超出了一般臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的承 受范圍。高分辨率熔解曲線法是一種快速，簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)，實(shí)用的分型方法，但基因分型依賴(lài)于 儀器溫度控制的精密性，假陽(yáng)性高。Taqman探針雜交法采用特異性的熒光標(biāo)記的探針，特 異性強(qiáng)，靈敏度高且操作方便，快速。該方法同樣被認(rèn)為是SNP分型的金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床應(yīng)用 的前景值得期待。Taqman探針雜交法的原理為：在TaqMan探針?lè)ǖ腜CR反應(yīng)體系中，包括 一對(duì)PCR引物和一條探針，探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間，探針 的5'端標(biāo)記有報(bào)告基因，如FAM、VIC，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，如MGB TAMRA ;當(dāng)探針完 整的時(shí)候，報(bào)告基因所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)；隨著PCR的進(jìn) 行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3' -5'外切核酸酶活性就會(huì)將探針切 斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。由此，應(yīng)用一對(duì)雙熒光標(biāo) 記的Taqman探針，分別針對(duì)雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針才能夠擴(kuò)增出 各自的基因型；用兩種熒光信號(hào)能夠被顯著區(qū)分的熒光染料分別標(biāo)記這兩種探針，就可以 在一次PCR反應(yīng)中完成對(duì)單個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型判定。因而，利用該方法進(jìn)行SNP基因型 分型時(shí)，引物和探針的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，引物長(zhǎng)度、探針長(zhǎng)度、引物特異性和探針特異性均會(huì) 顯著影響檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感性。
[0007] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于提出一種能夠有效用于VKORCl基因的rs9923231位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，以及確定待測(cè) DNA樣本的VKORCl基因的rs9923231位點(diǎn)的基因型的方法。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑 盒包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；第二核酸 分子，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；第一探針，所述第一探針具 有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列；以及第二探針，所述第二探針具有SEQ ID NO :4所示的 核苷酸序列，其中，所述探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，所述 第一探針與所述第二探針的熒光報(bào)告基團(tuán)不同。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的試劑盒能夠用于VKORCl基因的rs9923231位點(diǎn)的 檢測(cè)。具體地，根據(jù)Taqman探針雜交法，利用該試劑盒中的試劑，將待測(cè)DNA樣本進(jìn)行熒光 定量PCR后，基于熒光定量PCR結(jié)果即可容易地確定VKORCl基因的rs9923231位點(diǎn)的基因 型。進(jìn)而，可以將VKORCl基因的rs9923231位點(diǎn)的基因型信息，與其他臨床信息結(jié)合分析， 用于指導(dǎo)待測(cè)DNA樣本來(lái)源的個(gè)體的華法林用藥。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM或VIC，所述淬滅基團(tuán)為MGB。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種確定待測(cè)DNA樣本預(yù)定SNP位點(diǎn) 的基因型的方法，所述預(yù)定SNP位點(diǎn)為VKORCl基因的rs9923231位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施 例，該方法包括：根據(jù)Taqman探針雜交法，利用前面所述的試劑盒，將所述待測(cè)DNA樣本進(jìn) 行熒光定量PCR ;以及對(duì)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析，以便確定待測(cè)樣本預(yù)定SNP位點(diǎn)的基 因型。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用本發(fā)明的方法能夠有效地確定待測(cè)DNA樣本VKORCl基 因的rs9923231位點(diǎn)的基因型。此外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該方法成本低、特異性強(qiáng)、靈敏度 高、準(zhǔn)確度高、可重復(fù)性好，且在一次PCR反應(yīng)中即可完成對(duì)單個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型判定，操 作方便、快速。
[0013] 另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的確定待測(cè)DNA樣本預(yù)定SNP位點(diǎn)的基因型的方法 還可以具有如下附加的技術(shù)特征：
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用ABI Stepone熒光定量PCR儀進(jìn)行所述熒光定量PCR。 由此，熒光定量PCR結(jié)果準(zhǔn)確，有利于后續(xù)的分析，進(jìn)而有利于預(yù)定SNP位點(diǎn)基因型的確定。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述突光定量PCR的反應(yīng)體系為：5重量份的Taqman Genotyping Master Mix ;3. 5重量份的超純水；0. 5重量份的組合物；以及1重量份的待測(cè) DNA樣本，其中，所述組合物由所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探針和第二探針組 成。由此，熒光定量PCR效果好，結(jié)果準(zhǔn)確，有利于后續(xù)的分析，進(jìn)而有利于預(yù)定SNP位點(diǎn)基 因型的確定。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述待測(cè)DNA樣本的濃度為20ng/μ 1。由此，熒光定量PCR 效果好，結(jié)果準(zhǔn)確，有利于后續(xù)預(yù)定SNP位點(diǎn)基因型的確定。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述待測(cè)DNA樣本來(lái)源于人唾液或外周血。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述組合物中每種核酸分子的濃度均為18 μ mol/L，每種探 針的濃度均為5 μ mol/L。由此，熒光定量PCR效果好，結(jié)果準(zhǔn)確，有利于預(yù)定SNP位點(diǎn)基因 型的確定。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊剑?0°C下保持30 秒；第二步：95°C下保持1