用于腫瘤診斷和治療的分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤診斷、研究以及治療領(lǐng)域，特別涉及腫瘤特異性的融合基因作為 腫瘤診斷分子標(biāo)志及臨床治療的分子靶標(biāo)。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活環(huán)境及飲食習(xí)慣等的變遷，惡性腫瘤已經(jīng)成為人類健 康的頭號(hào)殺手之一，近年來(lái)在全球范圍內(nèi)患病人數(shù)不斷增加，為全球經(jīng)濟(jì)和人類社會(huì)的發(fā) 展帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。
[0003] 惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多步驟并伴隨多基因遺傳或表觀遺傳發(fā)生變化的過(guò)程。鑒 定致瘤性的遺傳異常是腫瘤研究的一個(gè)重要目標(biāo)，能夠?yàn)槟[瘤治療提供潛在的靶點(diǎn)。其中 值得注意的是，染色體重排導(dǎo)致兩基因的融合，作為一種新的突變形式在腫瘤發(fā)病過(guò)程中 起著關(guān)鍵作用，它的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了腫瘤基因的范疇。
[0004] 融合基因作為腫瘤基因新類型，其促進(jìn)腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化主要通過(guò)兩種方式：第一，一個(gè)基因的啟動(dòng)子或/和增強(qiáng)子元件等由于染色體重排異常地跟一個(gè)原癌基因緊靠 在一起，驅(qū)使癌基因的異常表達(dá)，例如B細(xì)胞腫瘤IG-MYC、T細(xì)胞腫瘤TCR-MYC導(dǎo)致癌基因 MYC活化；第二，兩基因融合產(chǎn)生有新功能的融合蛋白，例如BCR-ABLl。然而，超過(guò)80%的已 知融合基因存在于僅占人類腫瘤的10%的白血病、淋巴瘤、骨及軟組織肉瘤中，而在較為常 見上皮性實(shí)體瘤卻只發(fā)現(xiàn)10%融合基因。
[0005] 近年來(lái)隨著分析及檢測(cè)方法的進(jìn)步，腫瘤學(xué)家分別在50%前列腺癌和1-5%肺癌 (5-10%非小細(xì)胞肺癌)發(fā)現(xiàn)新的融合基因 TMPRSS2-ERG，EML4-ALK，并進(jìn)一步闡明它們的致 癌機(jī)制，為前列腺癌和肺癌的分型診斷和靶向治療奠定基礎(chǔ)?？梢娙旧w重排導(dǎo)致兩基因 融合同樣可以是上皮性實(shí)體瘤的癌變機(jī)制之一。融合基因因其在腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)，可 作為理想的治療靶點(diǎn)，例如針對(duì)CML的融合基因 BCR-ABL設(shè)計(jì)的分子靶向藥物imatinib/ Gleevec已經(jīng)在臨床得到應(yīng)用，同樣地臨床前及臨床1期，2期數(shù)據(jù)表明ALK激酶抑制劑對(duì) 治療EML4-ALK陽(yáng)性病人有效。
[0006] 用于癌癥的融合基因的研究已經(jīng)日益成為熱點(diǎn)。
[0007] PLEKHA1基因位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂第二區(qū)第6帶的第13個(gè)亞帶（10q26. 13)，存 在3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，以轉(zhuǎn)錄本1為例（NM_021622. 4)其轉(zhuǎn)錄的mRNA包含12個(gè)外顯子，編碼404 個(gè)氨基酸，分子量約45. 5 kDa。該基因編碼包含pleckstrin同源性結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白， 能通過(guò)特異性結(jié)合3,4-二磷酸磷脂酰肌醇而定位在細(xì)胞膜，因此其可能參與到細(xì)胞膜信 號(hào)通路傳導(dǎo)的過(guò)程中。另外，PLEKHA1基因的多態(tài)性與一些疾病相關(guān)，包括kuhnt-junius degeneration以及macular degeneration,至今其與腫瘤的關(guān)系并沒有研究。
[0008] TACC2基因位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂第二區(qū)第6帶（10q26)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生4個(gè)轉(zhuǎn)錄本， 以轉(zhuǎn)錄本1為例（NM_206862. 2)其轉(zhuǎn)錄mRNA包含23個(gè)外顯子，編碼2948個(gè)氨基酸，分子 量約309.4 kDa。該基因編碼的蛋白包含SPAZ結(jié)構(gòu)域以及C端transforming, acidic coiled-coi 1結(jié)構(gòu)域，主要表達(dá)在胞楽以及在細(xì)胞周期進(jìn)展過(guò)程中在中心體附近富集。 TACC2蛋白通過(guò)C端的TACC結(jié)構(gòu)域與多種分子相互作用，包括與微管相互作用參與細(xì)胞的 分裂，與YEATS4、GCN5L2、PCAF等相互作用參與基因的表達(dá)調(diào)控。之前的研究發(fā)現(xiàn)TACC2 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，最初TACC2在乳腺癌中被首次發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)其對(duì)乳腺癌的進(jìn) 展起著抑制的作用。最近在前列腺癌的報(bào)道中，TACC2起著促癌作用。TACC2與腫瘤關(guān)系仍 有待進(jìn)一步闡明。
[0009] 上述兩個(gè)基因位于的染色體區(qū)域在腫瘤中經(jīng)常發(fā)生異常，揭示該區(qū)域與腫瘤的發(fā) 生發(fā)展密切相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于腫瘤的分子標(biāo)志及其應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 用于腫瘤的分子標(biāo)志，所述分子標(biāo)志為融合基因 PLEKHA1-TACC2,融合基因同時(shí)包含基 因 PLEKHA1和基因 TACC2的部分序列。
[0012] 優(yōu)選的，上述融合基因 PLEKHA1-TACC2的融合形式選自：PLEKHA1 exon 2 :TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 6 ：TACC2 exon 13, PLEKHA1 exon 10 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 2 ：TACC2 exon 20, PLEKHA1 exon 8 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 10 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 4 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 3 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 9 ： TACC2 exon 23〇
[0013] 特別的，融合基因 PLEKHA1-TACC2至少包含如下序列： PLEKHA1 部分： TGTAATGTTCAAGCTCAGAAATGCCTTATGTGGATCGTCAGAATCGCATTTGTGGTTTTCTAGACATTGAAG AAAATGAAAACAGTGGGAAATTTCTTCGAAGGTACTTCATACTGGATACCAGAGAAGATAGTTTCGTGTGGTACATG GATAATCCACAG (SEQ ID NO ：1)； TACC2部分： AATAAAGAAATAGAAGAACTCACCAAGATTTGTGACGAACTGATTGCCAAAATGGGGAAAAGCTAACTCTGA ACCGAATGTTTTGGACTTAACTGTTGCGTGCAATATGACCGTCGGCACACTGCTGTTCCTCCAGTTCCATGGACAGG TTCTGTTTTCACTTTTTCGTATGCACTACTGTATTTCCTTTCTAAATAAAATTGATTTGATTGTATGCAGTACTAAG GAGACTATCAGAATTTCTTGCTATTGGTTTGCATTTTCCTAGTATAATTCATAGCAAGTTGACCTCAGAGTTCCTGT ATCAGGGAGATTGTCTGATTCTCTAATAAAAGACACATTGCTGACCTTGGCCTTGCCCTTTGTACACAAGTTCCCAG GGTGAGCAGCTTTTGGATTTAATATGAACATGTACAGCGTGCATAGGGACTCTTGCCTTAAGGAGTGTAAACTTGAT CTGCATTTGCTGATTTGTTTTTAAAAAAACAAGAAATGCATGTTTCAAATAAAATTCTCTATTGTAAATAAAATTTT TTCTTTGGATCTTGGCAA (SEQ ID NO ：2)〇
[0014] 一種用于腫瘤臨床病理特征和/或預(yù)后判斷的診斷制劑，制劑中含有可檢測(cè)上述 任意一項(xiàng)的分子標(biāo)志或其表達(dá)產(chǎn)物的試劑。
[0015] 腫瘤選自頭頸部腫瘤，特別是食管鱗癌、鼻咽癌、喉癌或口腔部鱗癌。
[0016] 一種治療腫瘤的生物制劑，該生物制劑可以使融合基因 PLEKHA1-TACC2在腫瘤細(xì) 胞中的表達(dá)量下降或者使其表達(dá)融合蛋白喪失功能。
[0017] 特別的，上述治療腫瘤的生物制劑含有siRNA、融合基因 PLEKHA1-TACC2啟動(dòng)子抑 制劑、融合基因 PLEKHA1-TACC2增強(qiáng)子抑制劑、融合基因 PLEKHA1-TACC2表達(dá)蛋白抗體中的 至少一種。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的分子標(biāo)志，有助于腫瘤的早期診斷以及治療，提高篩查效率，降低篩查成本， 為個(gè)體化治療提供方向，改善病人的存活率和生存質(zhì)量。
[0019] 本發(fā)明的診斷制劑，通過(guò)檢測(cè)融合基因的表達(dá)情況，可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期篩查，有 助于腫瘤的早期介入和預(yù)防。
[0020] 本發(fā)明的治療腫瘤的生物制劑，通過(guò)使融合基因 PLEKHA1-TACC2的表達(dá)量下降， 對(duì)腫瘤的進(jìn)展有一定的治療作用，具有廣闊的開發(fā)前景。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1 :利用RNA-seq發(fā)現(xiàn)食管鱗癌存在新的recurrent gene fusion ; 圖2 :野生型PLEKHA1和TACC2在不同標(biāo)本中的表達(dá)量； 圖3 :過(guò)表達(dá)融合蛋白對(duì)食管癌腫瘤細(xì)胞增殖的影響； 圖4 :敲降PLEKHA1、TACC2對(duì)食管癌腫瘤細(xì)胞增殖的影響 圖5 :敲降TACC2對(duì)細(xì)胞周期分布的影響； 圖6 :敲降TACC2對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響； 圖7 :融合基因的分析檢測(cè)流程； 圖8 :融合基因 PLEKHA1-TACC2在不同頭頸部腫瘤中的測(cè)序情況。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 用于腫瘤的分子標(biāo)志，所述分子標(biāo)志為融合基因 PLEKHA1-TACC2,融合基因同時(shí)包 含基因 PLEKHA1和基因 TACC2的部分序列。
[0023] 優(yōu)選的，上述融合基因 PLEKHA1-TACC2的融合形式選自：PLEKHA1 exon 2 :TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 6 ：TACC2 exon 13, PLEKHA1 exon 10 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 2 ：TACC2 exon 20, PLEKHA1 exon 8 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 10 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 4 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 3 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 9 ： TACC2 exon 23〇
[0024] 特別的，融合基因 PLEKHA1-TACC2至少包含如下序列： PLEKHA1 部分： TGTAATGTTCAAGCTCAGAAATGCCTTATGTGGATCGTCAGAATCGCATTTGTGGTTTTCTAGACATTGAAG AAAATGAAAACAGTGGGAAATTTCTTCGAAGGTACTTCATACTGGATACCAGAGAAGATAGTTTCGTGTGGTACATG GATAATCCACAG (SEQ ID NO ：1)； TACC2部分： AATAAAGAAATAGAAGAACTCACCAAGATTTGTGACGAACTGATTGCCAAAATGGGGAAAAGCTAACTCTGA ACCGAATGTTTTGGACTTAACTGTTGCGTGCAATATGACCGTCGGCACACTGCTGTTCCTCCAGTTCCATGGACAGG TTCTGTTTTCACTTTTTCGTATGCACTACTGTATTTCCTTTCTAAATAAAATTGATTTGATTGTATGCAGTACTAAG GAGACTATCAGAATTTCTTGCTATTGGTTTGCATTTTCCTAGTATAATTCATAGCAAGTTGACCTCAGAGTTCCTGT ATCAGGGAGATTGTCTGATTCTCTAATAAAAGACACATTGCTGACCTTGGCCTTGCCCTTTGTACACAAGTTCCCAG GGTGAGCAGCTTTTGGATTTAATATGAACATGTACAGCGTGCATAGGGACTCTTGCCTTAAGGAGTGTAAACTTGAT CTGCATTTGCTGATTTGTTTTTAAAAAAACAAGAAATGCATGTTTCAAATAAAATTCTCTATTGTAAATAAAATTTT TTCTTTGGATCTTGGCAA (SEQ ID NO ：2)〇
[0025] -種