用于腫瘤臨床病理特征和/或預(yù)后判斷的診斷制劑，制劑中含有可檢測上述 任意一項的分子標志或其表達產(chǎn)物的試劑。所述的試劑可以融合蛋白的抗體、針對融合基 因的特異性探針或特異性PCR引物。其實現(xiàn)方法可以采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)。
[0026] 腫瘤選自頭頸部腫瘤，特別是食管鱗癌、鼻咽癌、喉癌或口腔部鱗癌。
[0027] -種治療腫瘤的生物制劑，該生物制劑可以使融合基因 PLEKHA1-TACC2在腫瘤細 胞中的表達量下降或者使其表達融合蛋白喪失功能。
[0028] 特別的，上述治療腫瘤的生物制劑含有SiRNA、融合基因 PLEKHA1-TACC2啟動子抑 制劑、融合基因 PLEKHA1-TACC2增強子抑制劑、融合基因 PLEKHA1-TACC2表達蛋白抗體中的 至少一種。
[0029] 融合基因 PLEKHA1-TACC2的發(fā)現(xiàn) 本發(fā)明的發(fā)明者采用paired-end RNA-seq方法對6對食管鱗癌組織RNA進行全轉(zhuǎn)錄 組分析。經(jīng)過強大計算機集群對測序的海量數(shù)據(jù)進行預(yù)處理后，利用融合基因檢測流程，在 測序樣品4T中發(fā)現(xiàn)新融合基因 PLEKHA1-TACC2,而在與其配對的癌旁組織中沒有檢測到， 證實此新發(fā)現(xiàn)的融合基因是腫瘤特異性的。具體實驗步驟如下： 1) 收集新鮮6例食管鱗癌及與其配對癌旁組織，置于RNA later溶液中，4°C浸泡過夜 后，在-80°C長期儲存； 2) 利用OMEGA生物制劑公司的E. Z. N. A. total DNA/RNA分離試劑盒（R6731-02, 200 次）提取及純化組織的總RNA和DNA，具體步驟如下： (1)研磨組織： a) 洗凈所用的研缽和研杵，然后浸泡在醫(yī)用消毒液中過夜(約12個小時左右)，次日用 清水沖洗干凈后擦干，用錫箔紙包裹好研缽和研杵，放入烤箱中用180°C烘烤3個小時備 用。（用錫箔紙包裹是防止研缽和研杵在烘烤過后使用前，有異物或RNA酶污染。）從-80°C 冰箱取出所需的組織，放入研缽中，加入液氮冷凍組織后將組織研磨成粉末，標記好組織編 號。此步驟需注意：先研磨非癌組織，再研磨腫瘤組織，盡量避免交叉污染； b) 每20-30mg的組織加入700μ1的GTC Lysis Buffer，收集入1.5ml EP管中，用 IOml的一次性注射器反復(fù)抽打，使組織更好的裂解； c) 13000 Xg室溫離心5min，將上清移至已經(jīng)插入2ml收集管的HiBind? DNA Column 中，離心一分鐘，13000Xg/min ; d) 將收集管里的液體分別移到I. 5ml的EP管中，此步驟之后DNA和RNA就分開提取。
[0030] (2) RNA 提?。?a) 加入與1.5ml EP管中等體積的70%的乙醇(約350 μ 1 )，此時可看到白色沉淀，上 下顛倒幾次后用震蕩器劇烈震蕩15sec以上； b) 將液體轉(zhuǎn)移至HiBind? RNA分離柱中，> 10000 Xg離心lmin，棄掉收集管中離心出 來的液體； c) 向 HiBind? RNA 分離柱中加入 500 μ I RNA Wash Buffer I ,3 10000 Xg 離心 lmin， 棄掉收集管中離心出來的液體； d) 向 HiBind? RNA 分離柱中加入 500 μ I RNA Wash Buffer II, > 10000 Xg 離心 lmin， 棄掉收集管中離心出來的液體； e) 重復(fù)第d)的步驟； f) 將空的HiBincT RNA分離柱，離心，彡10000 X g，2min ; g) 丟掉上一步所用的收集管，將HiBind? RNA分離柱放入新的1.5ml EP管中，向 HiBindTMRNA分離柱中心滴加40μl的DEPC水，室溫孵育3min后離心，彡 10000Xg，2min。 離心下來的為RNA，分裝后放入-80°C中保存。
[0031] (3) DNA 提?。?a) 將HiBindTM DNA分離柱插入新的2ml的收集管中； b) 向 HiBindTM DNA 分離柱中加入 500μ1 的 HB Buffer，離心，彡 10000 X g，Imin;棄 去收集管里的液體； c) 向 HiBindTM DNA 分離柱中加入 700μ1 DNA Wash Buffer，離心，彡 lOOOOXg，Imin; 棄去收集管里的液體； d) 將空的HiBindTM DNA分離柱中離心，彡10000X g，2min ; e) 將HiBindTM DNA分離柱放入新的I. 5ml EP管中，向每個HiBindTM DNA分離柱中心 滴加60 μ I Elution Buffer。室溫孵育3min后離心，彡10000 Xg，2min。提取的DNA分裝 后放在_80°C保存。
[0032] 3)將純化好的總RNA干冰運送到深圳華大基因公司，利用agilent 2100檢測，質(zhì) 檢合格后進行測序文庫的構(gòu)建與測序： (1) 總RNA用帶有Oligo (dT)的磁珠富集真核生物mRNA ; (2) 加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段； (3) 以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后 加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈； (4) 經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加 EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加 polyA并連 接測序接頭； (5) 瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，約200bp，進行PCR擴增； (6) 在 Illumina HiSeq ? 2000 平臺進行 paird-end 測序； 4)利用生物信息分析方法，對測序數(shù)據(jù)進行處理，利用一套成熟的流程檢測樣品中的 融合基因，分析流程如圖7所示。
[0033] 在樣品4T檢測到新融合基因 PLEKHA1-TACC2,通過基因定位分析顯示這兩個基因 都位于10號染色體，相隔137. 3 kb,支持該融合基因的paire-end reads比對結(jié)果，見圖1 A0
[0034] 食管鱗癌新融合基因 PLEKHA1-TACC2的鑒定 根據(jù)RNA-seq reads比對結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人在RNA融合位點兩端設(shè)計引物，聯(lián)用 PCR擴增以及sanger測序在測序樣品4T中驗證PLEKHA1-TACC2的存在，引物序列： PLEKHAl-TACC2-RT-sense:5'- TCGTCAGAATCGCATTTGTGG-3'（SEQ ID N0:3) PLEKHAl-TACC2-RT-antisense :5' - GCTGCTCACCCTGGGAACTT-3'（SEQ ID NO :4) 實驗步驟如下： I) RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA 使用 Invitrigen 公司的 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen, Carlsbad, CA. C28025-032)，按說明書用Oligo (dT)為逆轉(zhuǎn)錄引物，取1 μ g總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄 體系共20 μ 1冰上操作,配置體系如下：
共10μ1體系，在PCR儀中完成變性過程，65°C 5min，4°C至少I min;取出反應(yīng)體系 立即置于冰上，立即配置如下反應(yīng)體系：
加入標記好的EP管中各10 μ 1，在PCR儀中完成如下步驟: 37 °C 50min ;70 °C終止反應(yīng)15min ;4 °C forever將上述逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA分裝保 存-20°C備用。
[0035] 2) PCR 擴增 使用TaKaRa公司Taq? Hot Start Version，按說明書使用PLEKHA1-TACC2檢測引物， 配置50 μ I PCR體系如下：
在PCR熱循環(huán)儀上完成PCR過程：預(yù)變性95°C 5min變性95°C 30sec退火60°C 30sec 延伸 72°C Imin 72°C IOmin 4°C forever 循環(huán)數(shù)：45cycles ; 3) 取5 μ I PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖電泳鑒定特異性擴增； 4) 剩下PCR產(chǎn)物送去Invitrogen公司，在3500遺傳分析儀平臺進行sanger測序； 5) 對測序結(jié)果進行比對分析，證實新融合基因 PLEKHA1-TACC2存在。
[0036] 從圖I B中的上圖可知，瓊脂糖電泳結(jié)果表明在測序樣品4T能特異地擴增出跟預(yù) 測大小相符的條帶，后續(xù)的sanger測序結(jié)果證實在RNA水平PLEKHA1 (NM_021622)exon 2 與 TACC2 (NM_206862)exon 23 發(fā)生融合。
[0037] 基因組融合位點的鑒定 為了進一步證明PLEKHA1與TACC2間的融合是由于染色體重排產(chǎn)生的，利用TaKaRa 公司的TaKaRa LA Taq? Hot Start Version ,以基因組DNA為模板，使用同一對引物進 行l(wèi)ong Range PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行sanger測序，鑒定基因組融合位點，實驗步驟如 下： 1)配置50 μ I PCR反應(yīng)體系：
2) PCR擴增：
95°C 5min 95°C 30sec 58°C 30sec 72°C 5min 10 cycles 5min + lOsec/cycle 35 cycles 72°C IOmin 4°C forever ； 3) 取5 μ I PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖電泳，明確擴增出特異條帶； 4) 剩下PCR產(chǎn)物送到Invitrogen公司，在3500遺傳分析儀平臺進行sanger測序分 析； 5) 測序結(jié)果進行比對分析，明確基因組融合位點。
[0038] 從圖IB的下圖可知，瓊脂糖電泳結(jié)果顯不以測序樣品4T的DNA為I旲板，利用long range PCR特異地擴增出約8kb的片段，測序結(jié)果證實PLEKHA1與TACC2間的融合發(fā)生在 DNA 水平，融合位點為 ChrlO: 124011190-124155852 (hgl9)。
[0039] PLEKHA1-TACC2在食管鱗癌臨床標本上表達 為進一步驗證新融合基因是食管鱗癌高頻事件，而不是只在某個樣品發(fā)生的個體獨特 事件，并且檢測兩個基因是否存在不同的融合方式，本發(fā)明發(fā)明人聯(lián)用PCR擴增和sanger 測序在另外160例食管鱗癌臨床標本中驗證，實驗步驟如下： 1) 收集160例食管鱗癌組織標本； 2) 組織總RNA和DNA的提取純化； 使用OMEGA生物制劑公司的E. Z. N.A. total DNA/RNA分離試劑盒（R6731-02,200 次)，具體實驗步驟同上； 3) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)； 4) PCR擴增： 為了檢測不同融合位點的嵌合轉(zhuǎn)錄本，PCR熱循環(huán)過程中的延伸時間改為4min ; 5) 取5 μ 1跑瓊脂糖電泳，鑒定有特異性擴增； 6) 將特異性擴增的PCR產(chǎn)物送測序； 7) 測序結(jié)果比對分析，明確存在融合基因的臨床標本以及其融合位點。
[0040] 從圖I C和D可知，新融合基因 PLEKHA1-TACC2在食管鱗癌中是recurrent的， 在6. 6% (11/166)食管鱗癌中有表達，并且存在9種RNA融合方式，分別為：PLEKHA1 exon 2 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 6 ：TACC2 exon 13, PLEKHA1 exon 10 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 2 ：TACC2 exon 20, PLEKHA1 exon 8 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 10 ： TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 4 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 3 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 9 ：TACC2 exon 23〇
[0041] 野生型PLEKHA1和TACC2在食管癌組織標本的