專利名稱：神經(jīng)外胚層腫瘤的診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及細胞生理學、神經(jīng)學、發(fā)育生物學、及癌癥學領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及利用chlorotoxin敏感性胞質(zhì)蛋白診斷和治療原發(fā)性(primitive)神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET)的新方法。
相關(guān)領(lǐng)域描述在胚胎發(fā)育階段，將來的神經(jīng)系統(tǒng)由被稱為神經(jīng)外胚層的外胚層細胞特化層形成。該層沿著與將來的脊柱一致的體軸縱向延伸。神經(jīng)外胚層的內(nèi)陷產(chǎn)生神經(jīng)管，基本上中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的所有成分包括脊柱均由神經(jīng)管發(fā)育。特化細胞沿內(nèi)陷神經(jīng)管的邊緣聚集，隔離著神經(jīng)管和神經(jīng)嵴而停留。這些高度移動性的神經(jīng)外胚層細胞在全身產(chǎn)生特化細胞，包括神經(jīng)鞘細胞(Schwann cell)、外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的神經(jīng)元細胞(腸神經(jīng)元、副交感神經(jīng)元、腎上腺交感神經(jīng)元、和感覺神經(jīng)元)、色素細胞(黑素細胞)、內(nèi)分泌細胞以及形成臉部和頸部的結(jié)締組織的細胞。由于這些細胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞具有共同的胚胎來源，因此，這些細胞，或從這些細胞衍生的腫瘤與中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞具有某些共同的遺傳表型和抗原表型并不令人意外。
例如，黑素瘤與成膠質(zhì)細胞瘤在編碼表皮生長因子受體(EGFR)的基因中有一個共同的突變(1)。惡性星形細胞瘤和神經(jīng)纖維瘤不僅高水平表達表皮生長因子受體，而且高水平表達血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF-R)和血小板衍生的生長因子受體(PDGF-R)(2)。已證實神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤中存在突變體EGFRvIII，以及細胞外基質(zhì)蛋白GP240和結(jié)合腕蛋白(3)的高表達。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了結(jié)合腕蛋白和神經(jīng)節(jié)苷脂-3’，6’-異LD1(3)。在另一項研究中，針對結(jié)合腕蛋白的抗體可強有力結(jié)合CNS神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及黑素瘤，乳腺、肺、及鱗狀細胞癌(4)。另一種神經(jīng)節(jié)苷脂，GD2，已顯示是神經(jīng)膠質(zhì)瘤和原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤組織的共同抗原標志(5)。黑素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤之間的其它共同抗原已通過顯示Tyr，TRP-1，TRP-2和gp100的基因產(chǎn)物可見于黑素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中而得到證實(6)。已鑒定出與星形細胞瘤、室管膜瘤和原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤相關(guān)的共同細胞因子或它們的受體白細胞介素(IL)IL-1α，IL-1，IL-1R1，IL-1R拮抗劑和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)TGF-β1(11)。
另一類用作神經(jīng)膠質(zhì)瘤和原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤之標記的蛋白為細胞骨架蛋白，神經(jīng)細絲(NE)，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)，中間絲(IF)，中間體相關(guān)蛋白絲(IFAP)，中間絲波形蛋白，nestin和角蛋白。這些標記已用于測定多種細胞譜系的分化階段(12)。將星形細胞瘤與特定原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤相關(guān)聯(lián)的新證據(jù)是細胞骨架標記IFAP-300kDa，一種不成熟的神經(jīng)膠質(zhì)的標記(13)。
可根據(jù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周中神經(jīng)外胚層衍生細胞對后天影響的相似依賴性，而找出它們之間緊密聯(lián)系的進一步證據(jù)。例如，交感腎上腺前體神經(jīng)元需要基本的成纖維細胞生長因子(bFGF)來增殖和分化，但這些細胞的存活取決于神經(jīng)生長因子(NGF)應(yīng)答能力和神經(jīng)生長因子的有效性(availability)(14)。其它每一細胞類型的需求也與此類似。原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤之間仍未解釋清楚的關(guān)聯(lián)，不僅必需生長因子和營養(yǎng)因子，還需要細胞因子和激素。
然而，神經(jīng)外胚層衍生的細胞之間除了這里所列的相似性以外，它們各有獨特的細胞學、生物化學和功能上的特征，是明顯相互區(qū)別的實體。事實上，所列的迄今未與其它神經(jīng)外胚層衍生細胞共享的獨特特征超出了上述共同表型的范圍。因此，無法根據(jù)神經(jīng)外胚層衍生細胞類型的任何其它成員的表達來推測給定細胞類型中特定抗原或表型的表達，即priori。
成神經(jīng)細胞瘤通常有出現(xiàn)于腦部發(fā)育之胚胎期的MYCN基因拷貝數(shù)的選擇性增加，表明細胞起源與腫瘤細胞去分化能力之間的聯(lián)系(7)。但現(xiàn)已證實該基因也出現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤中并不共有的其它蛋白質(zhì)已得到證實。CD99免疫反應(yīng)性被用作鑒定神經(jīng)外胚層腫瘤的工具(8)并已顯示出現(xiàn)在尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)中，但不出現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中(9)。另一種因子，干細胞因子及其受體，c-kit，也在原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤和尤因肉瘤中表達(10)。
共同的起源以及在正常發(fā)育過程中應(yīng)答內(nèi)部及外部信號的能力提示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞和外周神經(jīng)外胚層衍生細胞可能在病理性進展，如瘤形成期間具有共同的機制。這類腫瘤組織包括CNS神經(jīng)膠質(zhì)瘤，它們是神經(jīng)膠質(zhì)衍生的特異于CNS的腫瘤細胞。它們僅在CNS包括脊柱內(nèi)轉(zhuǎn)移。據(jù)認為它們源于至少三種不同譜系，可以來自未分化的前體細胞或通過星形膠質(zhì)細胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞或室管膜細胞的去分化產(chǎn)生。
原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET)可見于CNS和PNS。僅見于PNS的原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤稱為外周原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤(PPNET)。原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤好發(fā)于兒童，能發(fā)展成神經(jīng)元性、星形膠質(zhì)細胞性、室管膜性、肌肉性、和黑素性腫瘤。將這些腫瘤歸為一組的基礎(chǔ)是它們有共同的始祖細胞并具有相似的腫瘤轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)化導致具有相似形態(tài)學特征和生物學行為的腫瘤。然而，對于將所有原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤歸為一類仍有爭議。以下幾段證實各類CNS和PNS腫瘤之間共同抗原的重疊的例子。
腦幕上的原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤包括大腦成神經(jīng)管瘤、大腦成神經(jīng)細胞瘤、‘蘭色’腫瘤、成室管膜細胞瘤及其它原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤，如成松果體細胞瘤(WHOIV級)。針對這些腫瘤的最有效標記包括GFAP、NFP、結(jié)蛋白和黑素。這些腫瘤中發(fā)現(xiàn)的其它抗原有中間絲波形蛋白、nestin、角蛋白，但它們均不能有效用于診斷。
腎上腺(髓質(zhì))和交感神經(jīng)系統(tǒng)的外周成神經(jīng)細胞瘤是兒童期CNS外腫瘤的最常見類型。這些原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤的原發(fā)位點位于腎上腺、腹部、胸部、子宮頸及骨盆交感神經(jīng)節(jié)中，但還包括其它原發(fā)位點如眼眶、腎臟、肺、皮膚、卵巢、精索、和膀胱。這些相關(guān)腫瘤的具體名稱是嗜鉻細胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、成神經(jīng)節(jié)細胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)鞘瘤、和惡性外周神經(jīng)鞘腫瘤。這些均在神經(jīng)嵴中具有共同起源。所有成神經(jīng)細胞瘤均有TRK-A(NGFR)和CD44的高表達。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，突觸素，神經(jīng)細絲(NF)蛋白，GD2，酪氨酸羥化酶(TH)及嗜鉻粒蛋白均被用作也在成神經(jīng)管瘤中發(fā)現(xiàn)的診斷標記。成神經(jīng)細胞瘤通常表達腦部發(fā)育胚胎期出現(xiàn)的MYCN基因拷貝數(shù)的選擇性增加(7)。
成神經(jīng)管瘤是原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤中的成員，其被描述為小腦中發(fā)現(xiàn)的CNS極惡性幼稚化腫瘤(WHO IV級)。這些成神經(jīng)管瘤與其它神經(jīng)元譜系的腫瘤的共同抗原是突觸素(其未見于神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤或腦間質(zhì)腫瘤)。Nestin(IF蛋白)可見于發(fā)育中的CNS前體細胞、成神經(jīng)管瘤、以及某些外周神經(jīng)外胚層來源的細胞。Nestin(以及中間絲波形蛋白)可見于成神經(jīng)管瘤、星形細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、室管膜瘤、神經(jīng)節(jié)瘤和腦脊膜瘤(僅GFAP可見于星形細胞衍生的細胞，其偶爾‘被陷于’成神經(jīng)管瘤中)。在這些腫瘤中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞粘附分子(N-CAM)的水平增加，可反映腫瘤發(fā)育中的分化水平(15)。幾乎所有腫瘤中可發(fā)現(xiàn)不同水平的神經(jīng)生長因子(NGF)，成神經(jīng)管瘤卻顯示出對NGF受體及相關(guān)蛋白，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(NT)NT-3，TRK-C和腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的較強反應(yīng)性(16)。
由黑素細胞經(jīng)擴散性黑素細胞增多癥的逐級發(fā)展導致黑素細胞瘤這種惡性黑素瘤。S100蛋白是這些腫瘤的標記，因為中間絲波形蛋白和NSE的反應(yīng)性均可變。
肺的小細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌具有高侵襲性，通常見于成年吸煙者。它們對外周原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、及室管膜瘤等腫瘤分化的多種神經(jīng)標記和神經(jīng)內(nèi)分泌標記(其中部分與N-CAM類似)顯示反應(yīng)性。這些標記包括神經(jīng)特異性烯醇化酶和極高水平的c-src表達(17)。
發(fā)育中的CNS細胞和神經(jīng)嵴衍生細胞明顯共同的特征是它們易于轉(zhuǎn)移至靶或靶區(qū)。據(jù)信當細胞分化和成熟后這種能力消失。但CNS腫瘤顯示向健康腦部的顯著細胞轉(zhuǎn)移和侵入，這提示細胞已維持或重新獲得這種增強的轉(zhuǎn)移能力。因此，CNS外之神經(jīng)外胚層衍生細胞的腫瘤性轉(zhuǎn)化具有類似轉(zhuǎn)移能力也不奇怪。在預定的目的地，這些細胞分化成它們的終末表型，其類似于正常發(fā)育，受各種類型細胞增殖和分化的數(shù)種關(guān)鍵性神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響。
現(xiàn)有技術(shù)缺乏特異性針對原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤的診斷和治療試劑。本發(fā)明將滿足本領(lǐng)域的這一長期需要。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個實施方案中，描述了通過給予與一種細胞毒組分融合的特異性針對神經(jīng)外胚層起源之腫瘤的配體而治療這類腫瘤的方法。可用這種方式治療的具體神經(jīng)外胚層腫瘤有神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦脊膜瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細胞瘤、黑素瘤、外周原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤、肺小細胞癌、尤因肉瘤、以及位于腦內(nèi)的神經(jīng)外胚層來源的轉(zhuǎn)移瘤。
在優(yōu)選實施方案中，所述神經(jīng)外胚層腫瘤特異性配體是chlorotoxin，其為與細胞毒組分的融合蛋白形式。Chlorotoxin可以是天然的、合成的或重組的chlorotoxin?？赡艿募毎窘M分包括白樹毒素、蓖麻蛋白、皂角苷、假單胞菌外毒素、美洲商陸抗病毒蛋白、白喉毒素、及補體蛋白。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述神經(jīng)外胚層腫瘤特異性配體是抗chlorotoxin受體的抗體，可能是一種72kDa的氯離子通道。所述抗體可與白樹毒素、蓖麻蛋白、皂角苷、假單胞菌外毒素、美洲商陸抗病毒蛋白、白喉毒素、和補體蛋白融合。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提出了一種從非腫瘤組織中區(qū)分神經(jīng)外胚層腫瘤衍生的惡性腫瘤組織的方法。這通過使組織暴露于標記的chlorotoxin并測定標記chlorotoxin的結(jié)合而實現(xiàn)。相對于正常組織升高了的結(jié)合水平表明該組織為腫瘤組織。在一個實施方案中，所述標記是可直接由熒光顯微鏡、熒光活化細胞分揀術(shù)、或熒光平板讀取儀檢測的熒光組分?；蛘?，可對chlorotoxin進行放射性標記(如131I-chlorotoxin或125I-chlorotoxin；本領(lǐng)域技術(shù)人員可識別其它有效放射性標記)并通過正電子發(fā)射X線斷層攝影掃描(positron emission tomography scaning)進行檢測?；蛘?，可將chlorotoxin偶聯(lián)至非熒光性檢測組分如生物素，通過免疫組化或利用比色分析進行檢測。
附圖簡述鑒于已獲得本發(fā)明的上述特征、優(yōu)點和目的，以及其它顯而易見的方面，并能詳細理解，可參照附圖中舉例的特定實施方案更具體地描述本發(fā)明的以上簡要內(nèi)容。這些附圖是說明書的一部分。但應(yīng)注意，附圖舉例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并因此不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。


圖1顯示多形性成膠質(zhì)細胞瘤(GBM)的chlorotoxin陽性免疫組化染色。DAB 3｀3｀-二氨基聯(lián)苯胺與生物素化chlorotoxin的褐色反應(yīng)產(chǎn)物在TM-601染色切片上清晰可見。TM-601生物素化chlorotoxin染色，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖2證實正常腦組織不能被生物素化的chlorotoxin免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。正常腦也可用生物素化的抗GFAP(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白)抗體染色，該抗體可陽性染色正常腦組織中的星形膠質(zhì)細胞。
圖3顯示對腎上腺實質(zhì)(mass)成神經(jīng)細胞瘤的chlorotoxin染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖4例示了生物素化chlorotoxin對嗜鉻細胞瘤的免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖5例示了生物素化chlorotoxin不能對正常腎上腺組織進行免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖6顯示生物素化chlorotoxin對轉(zhuǎn)移至腦部的黑素瘤細胞的免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖7例示生物素化chlorotoxin對轉(zhuǎn)移至肺部的黑素瘤細胞的免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖8顯示生物素化chlorotoxin對正常皮膚的免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖9顯示生物素化chlorotoxin對肺小細胞癌的免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖10顯示生物素化chlorotoxin不能對正常肺組織進行免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖11顯示生物素化chlorotoxin對成神經(jīng)管瘤的免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖12顯示，尤因肉瘤這種少見的神經(jīng)外胚層衍生性骨癌也顯示生物素化chlorotoxin的陽性免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖13顯示生物素化chlorotoxin對正常胃組織免疫組化染色的陰性結(jié)果。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖14顯示生物素化chlorotoxin不能對正常肝組織進行免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
圖15證實生物素化chlorotoxin不能對正常脾組織進行免疫組化染色。TM-601生物素化chlorotoxin，用甲基綠復染；對照僅有甲基綠；H&E染色蘇木精和伊紅。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，可在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)利用常規(guī)分子生物學、微生物學、和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)均可完整參見文獻。如Maniatis，F(xiàn)ritsch&Sambrook，“分子克隆實驗室手冊(1982)；“DNA克隆實踐方法”卷I和II(D.N.Glover編，1985)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait編，1984)；“核酸雜交”[B.D.Hames & S.J.Higgins編，(1985)]；“轉(zhuǎn)錄和翻譯”[B.D.Hames &S.J.Higgins編，(1984)]；“動物細胞培養(yǎng)”[R.I.Freshney，編(1986)]；“固相化細胞和酶”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“分子克隆實踐指導”(1984)。
因此，如果在本文中出現(xiàn)，以下術(shù)語具有所示含義。
本文中“cDNA”指基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的DNA拷貝。
本文中“衍生的氨基酸序列”指通過閱讀cDNA中核苷酸堿基的三聯(lián)序列而確定的氨基酸序列。
本文中“篩選文庫”指用標記的探針在適當條件下檢查在特定DNA文庫中是否存在與所述探針互補的序列。此外，“篩選文庫”可通過PCR實施。
本文中“PCR”指作為Mullis的美國專利4683195和4683202的主題的聚合酶鏈式反應(yīng)，以及領(lǐng)域內(nèi)已知的其它改進。
本文所述氨基酸均指“L”異構(gòu)型。但“D”異構(gòu)型殘基可被取代成任何L-氨基酸殘基，只要這種多肽保留了免疫球蛋白結(jié)合活性。NH2指出現(xiàn)在多肽氨基端的游離氨基。COOH指出現(xiàn)在多肽羧基端的游離羧基。為保持標準多肽命名法一致，生物化學雜志，2433552-59(1969)，氨基酸殘基的縮寫為領(lǐng)域內(nèi)已知。
應(yīng)注意，本文中所有的氨基酸殘基序列均用通式表示，該通式的左和右取向為氨基端至羧基端的常規(guī)取向。此外，應(yīng)注意，氨基酸殘基序列的開始和結(jié)尾處的破折號指與具有一或多個氨基酸殘基的另一序列的肽鍵連接。
“復制子”是作為體內(nèi)DNA自我復制單元發(fā)揮功能；即能在其自身控制下復制的遺傳元件(如質(zhì)粒、染色體、病毒)。
“載體”是復制子，如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，其可攜帶另外的DNA片段以便使所攜帶的片段復制。
“DNA分子”指脫氧核糖核苷酸(腺苷酸、鳥苷酸、胸腺嘧啶、或胞嘧啶)的單鏈或雙鏈超螺旋形式的聚合物。該術(shù)語僅指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，不將其限定為任何特定的三級形式。因此，該術(shù)語包括雙鏈DNA，尤其在線性DNA分子(如限制性片段)、病毒、質(zhì)粒、和染色體中的雙鏈DNA。本文按傳統(tǒng)討論結(jié)構(gòu)，僅給出了沿DNA非翻譯鏈的5′至3′方向的序列(即具有同源于mRNA的序列的鏈)。
“復制起點”指參與DNA合成的那些DNA序列。
DNA“編碼序列”是，當被置于適當調(diào)控序列之下時可體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯為多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由5｀(氨基)端的起始密碼子和3｀(羧基)端的翻譯終止密碼子來確定。編碼序列可包括，但不限于，原核生物的序列、真核mRNA的cDNA、真核生物(如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列、以及甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸化信號及轉(zhuǎn)錄終止序列常常位于編碼序列的3｀側(cè)。
轉(zhuǎn)錄控制序列和翻譯控制序列均為DNA調(diào)控序列，如啟動子、增強子、聚腺苷酸化信號、終止子等，它們用于使編碼序列在宿主細胞中表達。
“啟動子序列”是能在細胞中結(jié)合RNA聚合酶并起始下游(3｀方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。為了限定本發(fā)明，啟動子序列在其3｀末端結(jié)合了轉(zhuǎn)錄起始位點并向上游(5｀方向)延伸以包括起始高于本底的可檢測水平的轉(zhuǎn)錄所必需的最少數(shù)量的堿基或元件。在啟動子序列中將可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點，以及負責結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。真核啟動子通常，但不總是，包含“TATA”盒及“CAT”盒。原核啟動子除含有-10和-35共有序列外還包含Shine-Dalgamo序列。
“表達控制序列”是控制和調(diào)節(jié)另一DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。當RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA時，該編碼序列“受控于”細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，轉(zhuǎn)錄出的mRNA隨后被翻譯為該編碼序列所編碼的蛋白。
“信號序列”可以位于編碼序列附近。該序列編碼信號肽，其位于所述多肽的N末端，通過與宿主細胞聯(lián)絡(luò)而將所述多肽引到細胞表面或?qū)⑺龆嚯姆置谥僚囵B(yǎng)基中，該信號肽在蛋白質(zhì)脫離宿主細胞之前被細胞剪切下來。原核及真核生物的多種天然蛋白均可找到其相關(guān)信號肽。
在本文中用于指本發(fā)明探針的術(shù)語“寡核苷酸”，被定義為含有兩個或多個，優(yōu)選三個以上核糖核苷酸的分子。其實際大小取決于多種因素，這些因素又取決于最終的功能和寡核苷酸的用途。
本文中術(shù)語“引物”指天然產(chǎn)生為純化型限制性消化產(chǎn)物的或合成的寡核苷酸，當處于誘導與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下(即在有核苷酸、誘導劑如DNA聚合酶存在時，在適當溫度和pH下)，所述寡核苷酸能作為合成的起始點。引物可以是單鏈或雙鏈，其長度應(yīng)足以在有誘導劑存在的條件下引發(fā)所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的真實長度取決于很多因素，包括溫度、引物來源以及所用方法。例如，在診斷性應(yīng)用中，取決于靶序列的復雜性，寡核苷酸引物通常含有15-25個或更多核苷酸，但也可以含有更少的核苷酸。
本文中引物均選擇與特定靶DNA序列的不同鏈“基本”互補。這意味著所述引物與它們的對應(yīng)鏈的互補性應(yīng)足以使它們雜交。因此，引物序列不必反映模板的真實序列。例如，非互補性核苷酸片段可結(jié)合于引物的5’端，引物序列的剩余部分可與所述鏈互補?；蛘?，非互補性堿基或更長的序列可分散插入該引物中，只要該引物序列具有與所述序列足夠的互補性或足以與所述序列雜交，從而形成合成延伸產(chǎn)物的模板。
本文中術(shù)語“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性酶”指酶類，它們分別在特定核苷酸序列處或其附近切割雙鏈DNA。
當將外源或異源DNA導入一種細胞后該細胞被所述DNA“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化DNA可整合(共價連接)至該細胞的基因組或不整合。如在原核生物、酵母、及哺乳動物細胞中，轉(zhuǎn)化DNA可以作為附加元件如質(zhì)粒來維持。對真核細胞而言，被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞是下述細胞，其中轉(zhuǎn)化DNA已整合至染色體，從而其可通過染色體復制而遺傳給子代細胞。這種能力可通過真核細胞建立由含有轉(zhuǎn)化DNA的子代細胞群組成之細胞系或克隆的能力來證實。“克隆”是由單個細胞或祖先經(jīng)有絲分裂衍生而來的細胞群?！凹毎怠笔悄茉隗w外穩(wěn)定生長數(shù)代的原代細胞的克隆。
DNA構(gòu)建體的“異源”區(qū)是較大DNA分子內(nèi)部可識別的DNA片段，且該片段在自然狀態(tài)下與該較大分子無關(guān)。因此，當該異源區(qū)編碼一種哺乳動物基因時，該基因的側(cè)翼通常有在來源生物基因組中并非側(cè)翼于哺乳動物基因組DNA的DNA。在另一實施例中，編碼序列是一種構(gòu)建體，其中該編碼序列本身是未見于自然界的(如cDNA，其中基因組編碼序列含有內(nèi)含子；或具有不同于天然基因的密碼子的合成序列)。等位基因變異或自然發(fā)生的突變事件不產(chǎn)生本文所限定的DNA異源區(qū)。
最常用于這些研究的標記是放射性元素、酶、暴露于紫外線可發(fā)熒光的化學物質(zhì)，等。多種熒光物質(zhì)已為人所知，并可用于作標記。這些包括，例如，熒光素、羅丹明、金胺、德克薩斯紅、AMCA蘭、和螢光黃。特定檢測物質(zhì)是在山羊中制備并通過異硫氰酸酯偶聯(lián)了熒光素的抗兔抗體。
蛋白質(zhì)也可用放射性元素或酶標記。放射性標記可通過現(xiàn)有的任何計數(shù)方法檢測。優(yōu)選的同位素可選自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、和186Re。
酶標記也同樣有效，并可通過目前使用的任何比色技術(shù)、分光光度技術(shù)、熒光分光光度技術(shù)、電流測量技術(shù)、或氣體測量技術(shù)來檢測。使酶通過與橋聯(lián)分子如碳二亞胺、二異硫氰酸酯、戊二醛等反應(yīng)而偶聯(lián)至選定的顆粒上?？捎糜谶@些方法的多種酶已為人所知，并可加以利用。優(yōu)選的有過氧化物酶、β-萄糖醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶，尿素酶、葡萄糖氧化酶加過氧化物酶和堿性磷酸酶。美國專利3,654,090、3,850,752、和4,016,043均通過舉例提到其它可利用的標記物質(zhì)和方法。
本領(lǐng)域已開發(fā)并已利用的一種特定分析系統(tǒng)是受體試驗。在受體試驗中，對待分析的物質(zhì)進行適當標記，用一定量的兩種標記接種特定的細胞測試菌落，然后進行結(jié)合研究以確定標記物質(zhì)結(jié)合細胞受體的程度。通過這種方式可確定不同物質(zhì)之間的親和力差異。
本領(lǐng)域有效的一種試驗是“順式/反式”試驗。簡短說，該試驗利用兩種遺傳構(gòu)建體，其中一種通常為轉(zhuǎn)染至適當細胞系后可連續(xù)表達特定目標受體的質(zhì)粒，第二種構(gòu)建體為在受體/配體復合物控制下表達受體如螢光素酶的質(zhì)粒。因此，例如，當希望評價一種化合物作為特定受體的配體時，質(zhì)粒之一可以是導致該受體在所選細胞系中表達的構(gòu)建體，而第二種質(zhì)粒具有與螢光素酶基因連接的啟動子，其中插入了該特定受體的應(yīng)答元件。如果待檢化合物是所述受體的激動劑，該配體將與受體形成復合物，該復合物將與應(yīng)答元件結(jié)合并啟動螢光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。然后通過分光光度法測量所產(chǎn)生的化學發(fā)光，獲得劑量應(yīng)答曲線，并與已知配體的曲線進行比較。上述方案詳見于美國專利4,981,784。
本發(fā)明涉及用融合了細胞毒組分的神經(jīng)外胚層腫瘤特異性配體治療神經(jīng)外胚層腫瘤的方法?？赡艿纳窠?jīng)外胚層腫瘤標靶包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦脊膜瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細胞瘤、黑素瘤、PPNET’s、肺小細胞癌、尤因肉瘤、和腦內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤。優(yōu)選地，神經(jīng)外胚層腫瘤特異性配體是與細胞毒組分融合的chlorotoxin。可能的細胞毒組分有白樹毒素、蓖麻蛋白、皂角苷、假單胞菌外毒素、美洲商陸抗病毒蛋白、白喉毒素、和補體蛋白。
本發(fā)明還涉及神經(jīng)外胚層腫瘤特異性治療劑，其中神經(jīng)外胚層腫瘤特異性配體是抗chlorotoxin受體(據(jù)信其為72kDa的氯離子通道)的抗體。該抗體可與白樹毒素、蓖麻蛋白、皂角苷、假單胞菌外毒素、美洲商陸抗病毒蛋白、白喉毒素、或補體蛋白融合。
本發(fā)明還涉及區(qū)分神經(jīng)外胚層腫瘤衍生的腫瘤組織與非腫瘤組織的方法，其將目標組織與標記的chlorotoxin一起保溫，并測定相對于所提供的正常組織，標記的chlorotoxin的結(jié)合。Chlorotoxin可用熒光組分標記，也可用放射性同位素如131I或125I標記。熒光組分可用于通過熒光顯微鏡檢或熒光活化細胞分揀術(shù)進行檢測。放射性標記的chlorotoxin可通過正電子發(fā)射X線斷層攝影掃描術(shù)檢測。
以下實施例旨在舉例說明本發(fā)明的各種實施方案，并非對本發(fā)明的任何形式的限定。
實施例1神經(jīng)膠質(zhì)瘤實驗的chlorotoxin結(jié)果概述近期研究證實，絕大多數(shù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞表達一種共同抗原。該抗原可被chlorotoxin鎖定。chlorotoxin(Ctx或TM-601)是分離自Leiurusquinquestriatus蝎子毒液的一種36個氨基酸的肽，它選擇性結(jié)合神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞膜，使得能選擇性耙向CNS中的這些細胞(18)。該肽所靶定的抗原似乎是一種氯離子通道，但尚未在分子水平上對該抗原進行明確鑒定。迄今的信息表明，chlorotoxin可結(jié)合分子量72kDa的優(yōu)選表達在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞胞質(zhì)膜中的膜蛋白。該肽的結(jié)合可促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增生(19)和抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞在Transwell試驗(一種體外評估腫瘤擴散性的試驗)中移動的能力(20)。Chlorotoxin似乎通過減少膜對Cl-離子的通透性并因此阻止細胞體積變化，使細胞因不能改變體積而不能侵入健康組織來提供這些效應(yīng)(20)。因此，chlorotoxin最可能的作用是針對已得到深入研究的神經(jīng)膠質(zhì)瘤氯離子通道(19)。
實施例2用chlorotoxin對神經(jīng)膠質(zhì)瘤進行免疫組化染色超過250份人體活檢組織的冰凍切片或石蠟切片用化學合成形式的chlorotoxin進行組織化學染色，所述化學合成形式的chlorotoxin在N末端化學附著了可檢測的生物素基團(TM-601)。TM-601分子的結(jié)合可見于與幾乎所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的選擇性細胞，其中每一腫瘤有多達95％的陽性細胞。根據(jù)這些研究，有人提出，利用chlorotoxin作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性標記和作為靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在治療手段。為了這類目的，可利用chlorotoxin與放射性分子或細胞毒組分如皂角苷的連接。
實施例3對chlorotoxin的重組DNA操作可用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備重組蛋白，它們經(jīng)特別改造可以模擬天然毒素的結(jié)合和作用。合成的chlorotoxin的生物學活性是可如天然毒液毒素一樣有效阻斷氯離子通道?？墒褂弥亟M技術(shù)，利用修飾型PGEX載體系統(tǒng)，在大腸桿菌中合成chlorotoxin，可利用常見的限制性位點將該毒素連接成各種融合蛋白。合成重組chlorotoxin后，可使之與各種細胞毒融合蛋白包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、白樹毒素、蓖麻蛋白、白喉毒素、補體蛋白和放射性配體以及免疫毒素領(lǐng)域已知的其它這類蛋白連接。
實施例4針對chlorotoxin結(jié)合型氯離子通道的抗體針對神經(jīng)膠質(zhì)衍生性腫瘤中氯離子通道的抗體可如下制備。將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與chlorotoxin的融合蛋白注射至小鼠或兔，產(chǎn)生多克隆抗血清。小鼠用1mg/ml純化型融合蛋白與完全弗氏佐劑的1∶1乳液0.5ml免疫，14和28天后用不完全弗氏佐劑中的乳液再注射兩次。小鼠和兔的抗體均用GST融合蛋白固相化的硝酸纖維素濾膜從抗血清中純化。然后檢查這些抗體對各種組織的結(jié)合特異性。
實施例5檢查神經(jīng)外胚層衍生性腫瘤的chlorotoxin結(jié)合的基本原理由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤與其它神經(jīng)外胚層衍生細胞之間存在相似性，以及對有人提出神經(jīng)外胚層細胞遷移的相似傾向性引起爭論，因此徹底檢查神經(jīng)外胚層衍生性腫瘤中chlorotoxin結(jié)合位點的表達。
實施例6制備人類活檢標本的冰凍切片或石蠟包埋切片來自兩種性別、所有年齡和人種的人類組織的標本中大多數(shù)通過位于UAB的Cooperative Human Tissue Network，Tissue Procurement，UAB醫(yī)院以及人類腦組織銀行(Human Brain Tissue Bank)，London，Canada獲得。快速冷凍組織和包埋于冰凍膠中的新鮮組織切成8μm，置于帶正電荷的玻璃載玻片上。然后根據(jù)不同染色方案，將這些切片于4％低聚甲醛或milloniqs中固定。根據(jù)標準方法對石蠟塊進行切片和制備。
實施例7檢查活檢標本的chlorotoxin結(jié)合將活檢切片在10％正常山羊血清的PBS溶液中封閉1小時，用生物素化chlorotoxin的稀釋液4℃處理過夜。充分沖洗后，染色通過抗生物素蛋白-生物素復合物(ABC)技術(shù)(來自Vector Laboratories，Burlington，CA的Vectastain Elite ABC試劑盒)顯色，并通過DAB(3’3’-二氨基聯(lián)苯胺；VectorLaboratories)與ABC復合物的比色反應(yīng)來觀察。
活檢切片用甲基綠(一種核染料)復染，以便更容易地觀察未染色的細胞。不同實驗中的非特異性背景標記因標記的有效濃度、組織的狀態(tài)或反應(yīng)的時間長短改變而各不相同。因此，一張對照切片用甲基綠但不用生物素化chlorotoxin來進行同樣的染色。陽性細胞染色鑒定為，與其連續(xù)切片的對照相比，chlorotoxin標記信號高于背景。在對照中，含有大量內(nèi)源性過氧化物酶的細胞因為DAB與所述過氧化物酶的反應(yīng)而顯出黑背景。
最后，第三張相鄰切片用蘇木精(細胞核特異性染色)和伊紅(細胞質(zhì)染色)染色。因此，對于所分析的每種組織，共有三張相鄰切片被染色。這些均示于顯微照片中，它們提供了TM-601 chlorotoxin對神經(jīng)外胚層衍生腫瘤的結(jié)合相對于對照的特異性證據(jù)。在這些顯微照片中，相鄰切片如下鑒定TM-601生物素化chlorotoxin通過DAB與生物素的棕色反應(yīng)產(chǎn)物和進一步的甲基綠復染檢測；對照對照切片僅用甲基綠染色；H&E用蘇木精和伊紅染色的切片。
實施例8多形性成膠質(zhì)細胞瘤(GBM)多形性成膠質(zhì)細胞瘤(GBM)用生物素化chlorotoxin(TM-601)染色。這些腫瘤與生物素化chlorotoxin發(fā)生強反應(yīng)，圖1中所檢測的25例病人的25份標本均為陽性。這種多形性成膠質(zhì)細胞瘤可與用生物素化chlorotoxin染色的正常人腦組織(18/23陰性)相比較。圖2顯示一次代表性的染色。經(jīng)證實，正常腦組織不能用TM-601染色。這與此前關(guān)于chlorotoxin對神經(jīng)膠質(zhì)瘤之結(jié)合特異性的證據(jù)一致。
實施例9正常腦組織中的GFAP染色活檢切片在10％正常山羊血清的PBS溶液中封閉1小時，然后用針對膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP；DAKO公司，Carpinteria CA)的抗體染色過夜。洗滌組織后，加偶聯(lián)了過氧化物酶的第二抗體作用2小時，再次洗滌，然后加DAB顯色。對正常腦的典型的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白染色示于圖2。正常腦為膠質(zhì)原纖維酸性蛋白染色陽性，但該蛋白也可染色常見于正常組織中的星形膠質(zhì)細胞。
實施例10成神經(jīng)細胞瘤成神經(jīng)細胞瘤是主要見于兒童，高發(fā)于腎上腺中的一種腫瘤。成神經(jīng)細胞瘤顯示TM-601反應(yīng)性高于對照染色，如圖3所示。7份成神經(jīng)細胞瘤中的6份為chlorotoxin結(jié)合陽性。
實施例11嗜鉻細胞瘤嗜鉻細胞瘤是腎上腺的嗜鉻性腫瘤細胞。該腫瘤也顯示高強度的染色，如圖4所示。6份嗜鉻細胞瘤中的5份為生物素化chlorotoxin染色陽性，尤其與圖5所示正常腎上腺的TM-601染色(3/3陰性)相比。
實施例12黑素瘤圖6顯示對轉(zhuǎn)移至腦的黑素瘤的生物素化chlorotoxin染色。7份黑素瘤腦轉(zhuǎn)移全部為TM-601陽性。此外，轉(zhuǎn)移至肺部的黑素瘤也進行了分析，如圖7所示。但正常皮膚不與TM-601反應(yīng)(6/6陰性)(圖8)，而即使在對照中，黑素細胞中也有一些背景染色。
實施例13肺小細胞癌肺小細胞癌可與TM-601反應(yīng)。染色與未染色細胞的對比很清楚(圖9)。對照(中圖)中TM-601陽性細胞為血液紅細胞，其表現(xiàn)高水平的背景過氧化物酶染色。這種TM-601特異性可進一步通過比較小細胞癌(2/3陽性)和正常肺(3/3陰性)的TM-601染色來證實(圖10)。
實施例14成神經(jīng)管瘤另一類神經(jīng)外胚層衍生腫瘤為成神經(jīng)管瘤。它們顯示對TM-601的特異性反應(yīng)性，如圖11所示(4/4陽性)。
實施例15尤因肉瘤尤因肉瘤，一種罕見的骨癌，有時見于軟組織，其為TM-601陽性(2/2)(圖12)。
實施例16檢測用于chlorotoxin給藥的潛在位點的副作用為了設(shè)計使用這種產(chǎn)物的藥物治療，用TM-601染色各種正常組織以確定可能發(fā)生副作用的位點。初步證據(jù)表明，最常見的副作用靶中一部分(如胃和肝臟)為TM-601陰性(迄今，兩種組織中均2/2陰性)(分別見于圖13和14)。脾組織染色示于圖15(3/3陰性)。其它正常人類組織的TM-601染色見表1。
表1
實施例17對所檢測的腫瘤和組織的概述如表1所概述，絕大多數(shù)神經(jīng)外胚層衍生腫瘤可結(jié)合chlorotoxin，這表明chlorotoxin在靶向神經(jīng)外胚層來源的腫瘤方面具有更廣泛的應(yīng)用。具體地，檢測了34例原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤患者，其中31例在腫瘤物質(zhì)中顯示chlorotoxin特異性，如表1所示。將該染色與其它類型CNS和PNS腫瘤的chlorotoxin染色進行比較，并與各種正常人類組織比較。
TM-601特異性相關(guān)于神經(jīng)外胚層衍生的腫瘤，包括成神經(jīng)管瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、黑素瘤、嗜鉻細胞瘤、肺小細胞癌以及尤因肉瘤。因此，chlorotoxin衍生的分子可用于特異性靶向從而治療或診斷上述神經(jīng)外胚層衍生腫瘤。類似地，這些腫瘤也可通過其它分子，如與chlorotoxin受體(假定為72kD的氯離子通道)結(jié)合的抗體來靶向。
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權(quán)利要求
1.一種治療神經(jīng)外胚層腫瘤患者的方法，其包括以下步驟給予一種藥物組合物，其包含藥學有效量的、與細胞毒組分融合的神經(jīng)外胚層腫瘤特異性配體以及一種可藥用載體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)外胚層腫瘤選自室管膜瘤、成神經(jīng)管瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細胞瘤、黑素瘤、外周原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤、肺小細胞癌、尤因肉瘤、以及腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)外胚層腫瘤特異性配體是chlorotoxin。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述chlorotoxin選自天然chlorotoxin，合成的chlorotoxin以及重組chlorotoxin。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞毒組分選自白樹毒素，蓖麻蛋白，皂角苷，假單胞菌外毒素，美洲商陸抗病毒蛋白，白喉毒素，和補體蛋白。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)外胚層腫瘤特異性配體是針對chlorotoxin受體的抗體。
7.一種區(qū)分神經(jīng)外胚層腫瘤衍生的腫瘤組織與非腫瘤組織的方法，其包括以下步驟使目標組織與標記的chlorotoxin接觸，該chlorotoxin可特異性結(jié)合神經(jīng)外胚層腫瘤組織；測定標記的chlorotoxin的結(jié)合，其中相對于正常組織升高的結(jié)合水平指示該組織是腫瘤組織。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述chlorotoxin用一種檢測組分標記。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述檢測組分選自熒光染料，生物素，與酶底物連接的比色試劑。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述標記chlorotoxin的結(jié)合通過選自下組的方法測定熒光顯微鏡檢查、ELISA和熒光活化細胞分揀術(shù)。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述標記的chlorotoxin是被放射性標記。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述放射性標記的chlorotoxin選自131I-chlorotoxin和125I-chlorotoxin。
13.權(quán)利要求7的方法，其中放射性標記之chlorotoxin的可指示腫瘤組織的結(jié)合親和力水平是約5納摩爾至約5微摩爾。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述標記chlorotoxin的結(jié)合利用正電子發(fā)射X線斷層攝影掃描術(shù)測定。
全文摘要
本發(fā)明提供用于檢測和治療神經(jīng)外胚層腫瘤的融合蛋白。此前的工作已證實chlorotoxin能特異性針對神經(jīng)膠質(zhì)衍生的或腦脊膜瘤衍生的腫瘤細胞。本發(fā)明將chlorotoxin－細胞毒素融合蛋白延伸應(yīng)用于治療所有神經(jīng)外胚層腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦脊膜瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細胞瘤、黑素瘤、PPNET’s、肺小細胞癌、尤因肉瘤、以及腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤。此外,本發(fā)明還提供了篩選惡性神經(jīng)外胚層腫瘤的診斷方法。
文檔編號G01N33/574GK1377280SQ00806560
公開日2002年10月30日 申請日期2000年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月21日
發(fā)明者哈拉爾德·J·桑泰默, 蘇珊·A·萊昂斯 申請人:Uab研究基金會