一種基于生化初篩及熒光納米生物探針檢測沙門菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病原菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到一種基于生化初篩及熒光納米生物探針檢測沙門菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食源性致病菌一直是一個(gè)嚴(yán)重的全球健康威脅。在過去十年的中國，微生物導(dǎo)致食物中毒爆發(fā)的比例最大(60.4%)。在美國，每年發(fā)生約42000宗嚴(yán)重的沙門菌病。由于很多致病菌的感染劑量非常低，所以簡單、快速、靈敏、可靠的檢測技術(shù)對人類生命健康至關(guān)重要。然而，基于傳統(tǒng)培養(yǎng)的檢測方法的靈敏度和分離技術(shù)的不足，輕微感染沙門菌的情況下，通常沒有被診斷出來，因此實(shí)際感染數(shù)目是非常大的。開發(fā)能大幅提高檢測和分離率的新技術(shù)成為迫切需求。沙門菌的傳統(tǒng)基于培養(yǎng)的檢測方法及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)靈敏度低，程序復(fù)雜并且工作量大，需要專業(yè)人員進(jìn)行儀器操作，檢測所需的人力、物力多?，F(xiàn)有技術(shù)不能滿足日常檢測需要，也給實(shí)驗(yàn)人員帶來了極大的檢測困難。
[0003]很多由半導(dǎo)體量子結(jié)構(gòu)所構(gòu)成現(xiàn)代發(fā)光材料和器件不斷出現(xiàn)，制造形成的量子點(diǎn)尺寸都與過去常用的染料分子的尺寸接近，其和傳統(tǒng)熒光染料一樣對生物醫(yī)學(xué)的研宄有很大用途。從生物體系的發(fā)光標(biāo)記物的差異上分析，量子點(diǎn)由于量子力學(xué)的奇妙規(guī)則而具有顯著的尺寸效應(yīng)，基本上高于特定域值的光都可吸收，而一個(gè)有機(jī)染料分子只有在吸收合適能量的光子后才能從基態(tài)升到較高的激發(fā)態(tài)，所用的激發(fā)光必須是精確的波長。量子點(diǎn)材料要吸收所有高于其帶隙能量的光子，但所發(fā)射光的波長(具有相應(yīng)的顏色)又非常具有尺寸依賴性，故單一種類的納米半導(dǎo)體材料就能夠按尺寸變化產(chǎn)生一個(gè)發(fā)光波長不同的、顏色分明的標(biāo)記物家族，這是染料分子根本無法實(shí)現(xiàn)的。
[0004]熒光分析法由于靈敏度高、選擇性好、儀器結(jié)構(gòu)相對簡單、價(jià)格便宜等特點(diǎn)，已成為化學(xué)分析中的常用方法之一。由于能發(fā)射出熒光的物質(zhì)數(shù)量不多，那些不能發(fā)射熒光的物質(zhì)常需要與一些熒光配合物或熒光探針等結(jié)合才能進(jìn)行分析測定，從而限制了熒光分析法的直接應(yīng)用。量子點(diǎn)由于其具有的獨(dú)特?zé)晒庑再|(zhì)，成為科研工作者采用熒光標(biāo)記法進(jìn)行生物測定的新型探針材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種快速、靈敏、簡便的檢測沙門菌的方法。
[0006]本發(fā)明用含有培養(yǎng)基的拭子直接采樣并培養(yǎng)，通過觀測是否產(chǎn)生硫化亞鐵形成的黑斑而判斷硫化氫反應(yīng)是否陽性，作出陽性初篩，然后將特異性靶向抗體偶聯(lián)的量子點(diǎn)納米顆粒溶液與初篩陽性的拭子孵育，從而實(shí)現(xiàn)對靶向菌的特異性結(jié)合及熒光觀測，通過觀測拭子上的量子點(diǎn)偶合物的熒光信號檢測靶向菌。
[0007]具體的技術(shù)方案是:一種基于生化初篩及熒光納米生物探針檢測沙門菌的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0008]A)含培養(yǎng)基拭子的制作:將適于沙門菌生長的培養(yǎng)基加入用吸水材料所制作的拭子中，晾干備用，其拭子分為棉簽狀、紙片狀兩種；
[0009]B)取樣培養(yǎng):使用步驟A處理后的拭子加入定量樣本，37°C培養(yǎng)18?48小時(shí)；
[0010]C)可疑樣品的篩選:肉眼觀察拭子生長情況，篩選產(chǎn)生黑色斑點(diǎn)的拭子；然后其放入含沙門菌特異性抗體偶聯(lián)的水溶性量子點(diǎn)生物探針溶液中，37°C孵育15分鐘或者4?8°C低溫冷孵育過夜，然后將拭子放于設(shè)計(jì)的人工熒光觀測儀(帶特制截止濾光片及熒光激發(fā)光源的體視鏡)或者激光共聚焦顯微鏡下觀察，或者激光共聚焦顯微鏡下觀察，并提供與量子點(diǎn)相應(yīng)波長的激發(fā)光源，有熒光斑或絲出現(xiàn)者為陽性，且可以判定為標(biāo)本攜帶沙門菌；
[0011]D)可直接挑取黑斑、熒光斑的部分培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)至鑒別平板培養(yǎng)基上劃線分離，獲取沙門菌的純分離株，以供作其它試驗(yàn)用。
[0012]所述拭子為棉簽狀拭子或者紙片狀拭子，所述棉簽狀拭子，由長25?30mm，寬9?10mm，重0.1?0.2g的100%醫(yī)療級脫脂棉纖維和一個(gè)14.5cm長的柄構(gòu)成，將棉簽狀拭子置于和棉簽狀拭子相適應(yīng)的長筒狀容器內(nèi)，添加1.0?2.0ml培養(yǎng)基后于35°C?45°C無菌環(huán)境干燥48小時(shí)，置于4°C備用；所述紙片狀拭子，由長10?15cm，寬2.2?2.8cm的3號層析濾紙片構(gòu)成，將紙片狀拭子折疊后放于密封袋內(nèi)，添加1.0?2.0ml培養(yǎng)基后于35°C?45°C無菌環(huán)境干燥48小時(shí)，置于4°C備用。
[0013]所述培養(yǎng)基含有40毫克的多價(jià)蛋白胨，5毫克氯化鈉，10毫克普通蛋白胨，0.6毫克檸檬酸鐵胺，12毫克硫代硫酸鈉，0.6毫克亮氨酸，8微克膽鹽，補(bǔ)加蒸餾水至I毫升。PH值調(diào)至7.4。
[0014]所述方法中步驟C)可以采用人工熒光觀測儀進(jìn)行觀測，所述帶人工熒光觀測儀是在普通體視鏡的物鏡外層安裝一個(gè)環(huán)形藍(lán)色發(fā)光二極管，在二極管外層蓋裝一個(gè)環(huán)形光學(xué)截止濾光片；光學(xué)截止濾光片能夠完全遮蓋住藍(lán)色發(fā)光二極管。
[0015]所述環(huán)形藍(lán)色發(fā)光二極管的激發(fā)光波長為365?405nm ;所述光學(xué)截止濾光器截止的發(fā)射光波長為400?680nm。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明將生化反應(yīng)的初篩作用與熒光納米生物探針結(jié)合起來檢測沙門菌，建立了快速檢測的方法，配合設(shè)計(jì)的帶截止濾光片及熒光激發(fā)光源的體視鏡制成的人工熒光觀測儀或激光共聚焦顯微鏡，實(shí)現(xiàn)可視化判斷結(jié)果，可操作性強(qiáng)，適合大批量樣品的檢測，操作簡單、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、效率高，可以在一天內(nèi)完成初篩，兩天完成靶向菌的分離。本發(fā)明大大減少了人力、物力的消耗，檢測效率大大提高，可廣泛應(yīng)用于實(shí)際檢測工作；所需的拭子、培養(yǎng)基、生物探針均易于制備，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0017]圖1為單克隆抗體共軛的量子點(diǎn)探針的表征:量子點(diǎn)偶合抗體后(Α-a)及偶合前(A-b)凝膠電泳圖、水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)抗體前后的熒光吸收及發(fā)射光譜圖(B)、單克隆抗體標(biāo)記的CdSe/ZnS量子點(diǎn)與沙門菌特異性孵育結(jié)合的透射電子顯微鏡觀測圖(C)；
[0018]圖2為人工熒光觀測儀的設(shè)計(jì)圖；
[0019]圖3為檢測沙門菌的方法流程圖；
[0020]圖4為拭子的生化反應(yīng)初篩效果圖(A)、特制的分離可疑菌株用的彎鉤(B)、初篩陽性拭子孵育量子點(diǎn)探針溶液后的肉眼熒光效果圖(C-G);
[0021]圖5為拭子孵育量子點(diǎn)探針溶液后的激光共聚焦顯微鏡觀測圖；
[0022]圖6為拭子孵育量子點(diǎn)探針后的掃描電子顯微鏡檢測圖:
[0023]圖7為模擬樣本檢測的特異性、靈敏性和檢出率(A)、肛拭樣本加標(biāo)檢測應(yīng)用(B-C)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為了更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明提供的技術(shù)方案。以下實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
[0025]實(shí)施例1應(yīng)用水溶性氨基化CdSe/ZnS量子點(diǎn)及含培養(yǎng)基的棉簽狀拭子對曼哈頓沙門菌 Salmonella manhattan 的檢測。
[0026]下面以水溶性氨基化CdSe/ZnS量子點(diǎn)及含培養(yǎng)基的棉簽狀拭子對曼哈頓沙門菌Salmonella manhattan檢測為例，對本發(fā)明方法進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0027]1、拭子的制備方法
[0028]棉簽狀拭子:長25?30mm，寬9?10mm，重0.1lg的100%醫(yī)療級脫脂棉纖維和一個(gè)14.5cm長的竹柄的棉簽狀拭子，能夠吸收1000微升培養(yǎng)基或樣品溶液。所有定制拭子不含有任何添加劑(如甲醛，消色劑或熒光劑等)。將1000微升配置好的培養(yǎng)基加入到一個(gè)和棉簽狀拭子相適應(yīng)的長筒狀容器內(nèi)，將所述拭子插入到該容器內(nèi)，在室溫下吸收30分鐘，然后將充分吸收了培養(yǎng)基的拭子置于35°C?45°C無菌環(huán)境干燥48小時(shí)，再置于4°C備用。
[0029]2、培養(yǎng)基的制備
[0030]每毫升培養(yǎng)基中含有40毫克的多價(jià)蛋白胨