專利名稱：趨化因子表達(dá)的依賴egfr的調(diào)控和對腫瘤的診斷和治療的影響及其副作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過化學(xué)抑制劑或者單克隆抗體，利用表皮生長因子 (EGFR)腫瘤的診斷和治療。本發(fā)明還涉及與用抗癌物質(zhì)治療利用EGF受 體的腫瘤有關(guān)的皮膚刺激，尤其是皮滲。本發(fā)明還涉及基于用EGFR抑制 劑尤其是抗EGFR的抗體來治療腫瘤時對在患者中腫瘤治療/腫瘤應(yīng)答的 效力的預(yù)測方法。本發(fā)明另外還涉及在EGFR相關(guān)腫瘤的治療中確定抗癌 物質(zhì)的最適劑量的方法。本發(fā)明還涉及監(jiān)測在早期階段通過EGFR抑制劑 對EGFR相關(guān)癌癥的治療效果的方法，以及監(jiān)測與所述治療有關(guān)的作為副 作用的皮滲發(fā)生的可能性的方法。最后，本發(fā)明還涉及趨化因子作為診斷 標(biāo)記或者作為指導(dǎo)鑒定腫瘤治療中的新靶標(biāo)的用途，所述趨化因子在癌癥 治療過程中通過抗癌物質(zhì)而被上調(diào)或者下調(diào)。
背景技術(shù)：
有理由認(rèn)為，由erbBl基因編碼的EGFR在人類惡性疾病中起作用。 特別是，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭(head)癌、頸癌、胃癌以及膠質(zhì)母 細(xì)胞癌中都發(fā)現(xiàn)EGFR表達(dá)增強(qiáng)。EGFR的增強(qiáng)表達(dá)通常都會和EGFR 配體，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-oc)的產(chǎn)生增強(qiáng)相關(guān)聯(lián)，同一種腫瘤細(xì)胞作為受 體激活的結(jié)果通過自分泌激活通路完成。(Basdga和Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64:127 (1994))。 EGF受體是一類分子量為170000的橫跨膜糖蛋白質(zhì)， 已在多種上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)七種EGFR配體，他們 通過和受體結(jié)合保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避凋亡、刺激細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞入侵。 這些生長因子不和EGFR家族的三個其他成員HER2、 HER3以及HER4 結(jié)合，這三者能夠和EGFR作用形成異源二聚體。(Riese和Stern， Bioassays20: 41-48 (1998); Kochupurakkal J Biol. Chem. 280:8503- 8512 (2005))。HER受體網(wǎng)絡(luò)不僅能夠整合它本身的信號輸入而且可以整合異源信 號，包括激素、淋巴因子、神經(jīng)遞質(zhì)以及脅迫誘導(dǎo)物。許多鼠科(murine)和大鼠的抗EGF受體的單克隆抗體已凈皮研發(fā)出來， 還在體內(nèi)和體外測試了它們抑制腫瘤細(xì)胞生長的能力(Modjtahedi和Dean， 1994， J. Oncology 4， 277)。針對EGF受體的人源化單克隆抗體425 (hMAb 425， US 5,558,864; EP 0531 472)和嵌合單克隆抗體225 (cMAb 225)在臨床 試驗中都顯示出了效果。C225抗體(西妥昔單抗(cetuximab))已被證明能夠 在體外抑制EGF介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長和在棵鼠體內(nèi)抑制人腫瘤的形成。 在異種移植的小鼠模型中，該抗體以及基本上所有的抗EGFR的抗體主要 通過和某些化學(xué)治療物質(zhì)(例如多柔比星、阿霉素、紫杉醇和順鉑)在體內(nèi) 協(xié)同根除人腫瘤(例如EP 0667165)。 Ye等人(1999， Oncogene 18， 731)報道 針對HER2受體的嵌合MAb 225和人源化MAb 4D5的組合能夠成功地治 療人卵巢癌細(xì)胞。除了抗ErbB的抗體外，有許多化學(xué)小分子已知是ErbB受體分子的 有效抑制因子，其主要阻礙受體的ATP結(jié)合位點。術(shù)語"酪氨酸激酶拮抗 劑/抑制劑"是指才艮據(jù)本發(fā)明的天然或者合成的物質(zhì)，其能夠抑制或者阻礙 酪氨酸激酶包括酪氨酸激酶受體。因此，該術(shù)語包括以上定義的ErbB受 體拮抗劑/抑制劑本身。除了前文和下文提到的抗ErbB受體抗體以外，該 定義下的更加優(yōu)選的酪氨酸激酶拮抗劑主要是那些在單一 藥物治療如乳腺 癌和前列腺癌治療中顯示出功效的化合物。合適的吲哚并呼唑類酪氨酸激 酶抑制劑可以利用在如5,516,771 ; 5,654,427; 5，461 ，146; 5,650,407的美國 專利文件中存在的信息來獲得。美國專利5，475，110; 5,591 ，855; 5,594,009 和WO 96/11933揭示了吡咯并啼唑類酪氨酸激酶抑制劑和前列腺癌。吉非 替尼(易瑞沙(IRESSAf，阿斯利康(Astra Zeneca))是這方面最早的抗癌物 質(zhì)之一 ，被報道在非d、細(xì)胞肺癌(NSCLC)以及晚期頭癌和頸癌的患者中有 治療功效。在EGF受體的上下文中，術(shù)語"利用"有兩層含義(i) 其反映受體參與信號的事實。EGFR的表達(dá)是信號發(fā)生的必要但是 非充分前提?？捎门潴w的可獲得性和質(zhì)量同樣重要。因此，受體表達(dá)的程 度通常并不直接和受體的使用相關(guān)。(ii) 反映肺瘤精確依賴于使用EGFR的事實。許多靶向該受體的物質(zhì)，包括單克隆抗體(如西妥昔單抗(cetuximab))正在開發(fā)。最常見的針對EGFR抑制劑的不良作用是粉刺狀的皮滲，通 常出現(xiàn)在臉和上部軀干。皮膚過敏在45-100%的患者中都有發(fā)生，在大多 數(shù)患者都會迅速發(fā)病，在治療后大約7-10天可以看到并且在2-3周之后達(dá) 到頂峰(Robert等人，Lancet Oncol. 491， 2005)。有些物質(zhì)(包括西妥昔單抗 和埃羅替尼)表現(xiàn)出皮滲的強(qiáng)度與治療應(yīng)答和/或生存的正關(guān)聯(lián)，這使得皮 瘆成為抗腫瘤活性的潛在代替標(biāo)記物(P erez-Soler和Saltz, J. Clin. Oncol" 23:5235， 2005)。皮疹的機(jī)制尚不明了。成體中，EGFR主要在表皮基底層的增殖、未 分化的角質(zhì)細(xì)胞和毛嚢根部的外層中表達(dá)(Nanney等人，J. Invest. Dermatol. 83:385， 1984)。 EGFR表達(dá)和活性的改變與異常的表皮生長和分 化有關(guān)(Murillas R等人.，EMBO J 1995; Sibilia M等人.，Cell 2000; King LE等人，J Invest Dermatol. 19卯)。角質(zhì)細(xì)胞是分層的鱗片狀上皮細(xì)胞，其包括皮膚和粘膜(包括口腔、食 道、角膜、結(jié)膜和生殖上皮細(xì)胞)。角質(zhì)細(xì)胞在宿主和環(huán)境間提供了一道屏 障。它們阻礙來自環(huán)境中的有毒物質(zhì)的進(jìn)入同時防止宿主中重要組成的流 失。角質(zhì)細(xì)胞當(dāng)從基底層到皮膚表面發(fā)展時分化。角質(zhì)細(xì)胞的正常更新時 間是30天左右，但是在某些皮膚疾病如牛皮癬中表皮的更新時間會加速?；颊叩钠つw活組織檢查的病理分析顯示EGFR阻塞導(dǎo)致基底角質(zhì)層 變薄，促進(jìn)炎癥細(xì)胞(包括嗜中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)侵入真皮組織，尤 其是毛嚢(Robert等人，Lancet Oncol. 6:491， 2005; Van Doom等人，Br. J. Dermatol. 147:598， 2002)。此外，與EGFR相關(guān)聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在皮膚 中被抑制提示抗EGFR的治療對表皮生理學(xué)有直接作用。例如，小化合物吉非替尼(易瑞沙⑧)能引起表皮基底層生長停止和成熟的標(biāo)記物的上調(diào)。因 此，角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期停止和成熟可能引起皮滲，因為角質(zhì)細(xì)胞分化改變可以引起如在患者中觀察到的嚢泡閉塞(Albanell等人，J. Clin. Oncol. 20:110， 2002)?；蛘?，其提示皮瘆的發(fā)展是皮膚中改變的趨化因子表達(dá)方 式的直接結(jié)果，類似于EGFR可以作為負(fù)反饋調(diào)控因子起抑制體內(nèi)慢性發(fā) 炎皮膚中的過度炎癥作用的結(jié)論(Mascia F等人，Am J Pathol. 2003)。趨化因子是具有有效的白細(xì)胞活化作用和/或趨化活性的結(jié)構(gòu)相關(guān)的 糖蛋白家族。它們在長度上為70到90個氨基酸，并且分子量為約8到10 千道爾頓。它們中大部分有四個半胱氨酸亞基屬于兩個亞家族。這些亞家 族是基于兩個氨基末端半胱氨酸殘基是直接相鄰還是被一個氨基酸隔開的 基礎(chǔ)上。又稱為CXC的趨化因子在第一個和第二個半胱氨酸殘基之間含 有單獨的一個氨基酸；p或CC趨化因子則有緊密相鄰的半胱氨酸殘基。 大多數(shù)CXC趨化因子是嗜中性粒細(xì)胞的趨化物而CC趨化因子通常誘導(dǎo) 單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。還有兩個其他的小 的亞類。C類有一個成員(淋巴細(xì)胞趨化蛋白)。它在四個半胱氨酸基序中 缺少一個半胱氨酸殘基，但是它的羧基末端卻和C-C趨化因子同源。C型趨化因子似乎是淋巴細(xì)胞特異性的。第四類亞類是c-x3-c亞類。c-x3-c類趨化因子(cxxxc趨化因子/神經(jīng)趨化因子)在前兩個半胱氨酸殘基間有三個氨基酸殘基。它通過長的黏蛋白莖直接系于細(xì)胞膜并能引起淋巴細(xì)胞 的黏著和遷移。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是基于在通過抗癌物質(zhì)，尤其是EGFR抑制劑，來治療EGFR 相關(guān)腫瘤時引起在皮膚組織以及在患者各自的腫瘤組織或血清中趨化因子 模式的特異調(diào)節(jié)這一原理的發(fā)現(xiàn)之上。在所述組織或者血清中的趨化因子 可能會根據(jù)治療中所用的抗癌物質(zhì)的性質(zhì)和數(shù)量而被下調(diào)或者上調(diào)。盡管尤其當(dāng)在疾病早期、以高劑量，和/或長時間使用EGFR抑制劑 時，最佳的控制很重要，到目前為止在EGFR相關(guān)腫瘤的治療中還沒有明9確的有效處理皮滲的建議?；谀壳暗慕Y(jié)果，其首次提示，皮膚中受受調(diào) 的趨化因子表達(dá)方式代表在患者抗癌治療早期時間點預(yù)測皮滲的有用的標(biāo) 記物，使得臨床醫(yī)生可以在看到皮滲之前消除皮滲。其次，皮膚中受受調(diào)的趨化因子表達(dá)方式被認(rèn)為是比皮滲更可靠的有 效抑制標(biāo)記物(并且從而也可能是臨床成果)，因為除趨化因子調(diào)控以外， 皮滲還依賴于患者個體的免疫系統(tǒng)。因此可以在治療的第 一周內(nèi)分析患者以準(zhǔn)確找到不可能從抗EGFR的治療中受益的患者，從而使醫(yī)生能夠改變 到備選的治療。此外，其表明，特異性的物質(zhì)，如趨化因子受體阻斷劑，其干擾由EGFR 阻礙引起的趨化因子介導(dǎo)的化學(xué)誘導(dǎo)，可能代表控制EGFR相關(guān)的腫瘤治 療中的皮膚病副作用的新的治療方法。應(yīng)該優(yōu)先局部使用這些物質(zhì)，因為 它們在皮膚上的效果可以在腫瘤中反映出來。綜上所述本發(fā)明涉及下列問題*預(yù)測患者中與癌癥治療相關(guān)聯(lián)或者有關(guān)的皮膚刺激，尤其是皮滲， 發(fā)作和強(qiáng)度的方法，該方法包括(i) 用標(biāo)準(zhǔn)方法確定第一皮膚組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該探 針采集自使用抗癌物質(zhì)開始治療之前的患者，所述抗癌物質(zhì)直接針對利用 表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細(xì)胞，(ii) 確定源于所述患者(優(yōu)選來自相同的皮膚區(qū)域)的第二皮膚探針的 趨化因子表達(dá)模式，其中該探針從使用所述抗癌物質(zhì)開始治療之后的某一 時間(優(yōu)選1-10天，更優(yōu)選l-7天，最優(yōu)選5-7天)獲取，(iii) 任選的確定第三和更多的皮膚探針的趨化因子的表達(dá)模式，其中 該揮:針在比步驟(ii)中各個前驅(qū)探針更晚的時間從患者獲取，(iv) 分別將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的皮膚探針的各個趨化因子表達(dá) 模式與步驟(i)中的皮膚探針表達(dá)模式做比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中 哪些趨化因子在性質(zhì)和/或數(shù)量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅(qū)探針 中的趨化因子才莫式已經(jīng)發(fā)生了變化；(v) 從趨化因子模式的變化預(yù)測后期用所述抗癌物質(zhì)治療引發(fā)的皮膚疾病發(fā)作和強(qiáng)度。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，如果在5-10天，優(yōu)選7天內(nèi)趨化因子模式?jīng)]有發(fā) 生變化或者變化不顯著，由抗癌物質(zhì)治療引發(fā)皮膚疾病，尤其是皮滲發(fā)生 的可能性將不會很高。*預(yù)測癌癥患者對用抗癌物質(zhì)治療的腫瘤應(yīng)答的相應(yīng)方法，該方法包 括(i) 用標(biāo)準(zhǔn)方法確定第一組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該探針采 集自使用抗癌物質(zhì)開始治療之前的患者，所述抗癌物質(zhì)直接針對利用/過表 達(dá)表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細(xì)胞，(ii) 確定源于所述患者的第二組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該 探針在開始使用所述抗癌物質(zhì)治療后的時間獲取，(iii) 任選的確定第三和更多的組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該 探針在比步驟(ii)中各個前驅(qū)探針更晚的時間從患者獲取，(iv) 分別將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的組織探針的各個趨化因子表達(dá) 模式與步驟(i)中的組織探針表達(dá)模式做比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中 哪些趨化因子在性質(zhì)和/或數(shù)量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅(qū)探針 中的趨化因子模式已經(jīng)發(fā)生了變化；(v) 從所述組織探針中趨化因子模式的變化預(yù)測對使用所述抗癌物質(zhì) 治療患者的腫瘤應(yīng)答的可能性和強(qiáng)度。根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，不僅在患者腫瘤組織而且在皮膚組織 中趨化因子模式和它的相關(guān)變化分別與腫瘤應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。*確定患者癌癥治療中抗癌物質(zhì)的最適劑量的方法，該方法包括(i) 用標(biāo)準(zhǔn)方法確定第一皮膚或肺瘤組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其 中該探針采集自使用抗癌物質(zhì)開始治療之前的患者，所述抗癌物質(zhì)直接針 對利用/過表達(dá)表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細(xì)胞，(ii) 確定源于所述患者的第二組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該 探針在開始使用所述抗癌物質(zhì)治療后的時間獲取，(iii) 任選的確定第三和更多的組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該探針在比步驟(ii)中各個前驅(qū)探針更晚的時間從患者獲取，(iv) 分別將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的組織探針中各個趨化因子表達(dá)模式與步驟(i)中的組織探針表達(dá)模式做比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中 哪些趨化因子在性質(zhì)和/或數(shù)量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅(qū)探針 中的趨化因子模式已經(jīng)發(fā)生了變化；(v) 根據(jù)所述組織探針的趨化因子模式的變化確定向患者施用的抗癌 物質(zhì)的劑量，和任選的(vi) 重復(fù)步驟(i)-(v)來優(yōu)化向患者施用的抗癌物質(zhì)的劑量。 如果治療開始前和治療后1到10天，優(yōu)選7天的探針的趨化因子模式?jīng)]有或者沒有顯著的調(diào)節(jié)/或變化，要么放棄使用此抗癌物質(zhì)的進(jìn)一步治療 或者，應(yīng)該提高劑量直到能夠觀察到對趨化因子模式的影響。* 一種相應(yīng)的方法，其中步驟(ii)的探針在使用所述抗癌物質(zhì)開始治 療后的l-10天內(nèi)獲取。* 一種相應(yīng)的方法，其中步驟(ii)的探針在使用所述抗癌物質(zhì)開始治 療后的2-7天內(nèi)獲取。* 一種相應(yīng)的方法，其中該抗癌物質(zhì)是EGFR抑制劑。* 一種相應(yīng)的方法，其中該EGFR抑制劑是抗EGFR抗體。* 一種相應(yīng)的方法，其中抗EGFR抗體是Mabc225 (西妥昔單抗)或 Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗(matuzumab))。* 一種相應(yīng)的方法，其中相對于沒有治療的患者而言，用抗癌物質(zhì)治 療引起趨化因子如RANTES的表達(dá)增強(qiáng)。* 一種相應(yīng)的方法，其中相對于沒有治療的患者而言，用抗癌物質(zhì)治 療會引起趨化因子如IL-8表達(dá)下降。* 一種相應(yīng)的方法，其中涉及下列趨化因子的至少一個IL-8、 MCP-1、 RNATES和IP-IO。*早期監(jiān)測癌癥治療效果的體外方法，其在患者中利用/過表達(dá) EGFR，通過確定用抗癌物質(zhì)開始治療之前和治療的最初1-10天中 腫瘤患者的皮膚組織和/或腫瘤組織和/或血清的探針的趨化因子模式進(jìn)行。*早期監(jiān)測皮膚刺激優(yōu)選皮瘆發(fā)生的體外方法，其結(jié)合在患者中利用/過表達(dá)EGFR的癌癥治療，通過用抗癌物質(zhì)，優(yōu)選EGFR抑制劑， 更優(yōu)選抗EGFR抗體，如Mab c225 (西妥昔單抗)或Mab h425 (EMD72000，馬妥珠單抗)在開始治療之前和治療的最初1-7天中 確定肺瘤患者中皮膚組織探針的趨化因子模式，其中優(yōu)選涉及下列 趨化因子的至少一種IL-8、 MCP-1、 RANTES和IP-IO。 *趨化因子作為確定所述治療效果和/或皮膚刺激優(yōu)選皮瘆發(fā)生的可 能性的診斷標(biāo)記的用途，所述趨化因子是在使用抗癌物質(zhì)治療癌癥 過程中體內(nèi)上調(diào)或者下調(diào)的，其中所述癌癥利用/過表達(dá)EGFR， 并且所述抗癌物質(zhì)是EGFR抑制劑，優(yōu)選抗EGFR抗體，如Mab c225 (西妥昔單抗)或Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗)。 *趨化因子用于鑒定所述趨化因子表達(dá)的上游耙標(biāo)的用途，所述趨化 因子是在使用抗癌物質(zhì)治療癌癥過程中體內(nèi)上調(diào)或者下調(diào)的，其適 于開發(fā)和生產(chǎn)靶向所述靶標(biāo)的藥物，通過在患者中單獨的利用/過 表達(dá)EGFR或與所述抗癌物質(zhì)組合來治療癌癥，其中所述抗癌物 質(zhì)是EGFR抑制劑，優(yōu)選抗EGFR抗體，如Mab c225 (西妥昔單 抗)或Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗)。 本發(fā)明表明，例如使用西妥昔單抗(mAb c225)或mAb h425 (馬妥珠單 抗)的單克隆抗體或者酪氨酸激酶抑制劑(吉非替尼，易瑞沙⑧)通過阻礙 EGF受體的實驗工作在初級角質(zhì)細(xì)胞中干擾依賴EGFR的信號級聯(lián)。在 這些實驗中先用不同濃度的抗EGFR物質(zhì)處理角質(zhì)細(xì)胞，接下來用或者不 用TGFa或TNFa處理大約24小時。抗EGFR抑制劑的效果用蛋白質(zhì)印 跡來評估。如

圖1所示，通過蛋白質(zhì)印跡分析處理過的角質(zhì)細(xì)胞來測量用抗 EGFR物質(zhì)處理干擾EGFR和ERK1/2的磷酸化。如圖2所示，用抗EGFR 物質(zhì)處理干擾COX-2蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)。此夕卜，STAT3的磷酸化隨著抗EGFR 物質(zhì)的處理而被誘導(dǎo)。試驗結(jié)果表明初級角質(zhì)細(xì)胞的處理調(diào)控體外趨化因子的表達(dá)。在用抗EGFR物質(zhì)處理24小時的角質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中評估分泌的趨化因子。 評估用Luminex珠技術(shù)來進(jìn)行。在這些實驗中先用抗EGFR物質(zhì)處理角 質(zhì)細(xì)胞，接下來用或者不用TGFa或者TNFa處理。在幾個趨化因子中， IL-8應(yīng)答EGFR阻斷始終下調(diào)(圖3)，而RNATES和IP-10則上調(diào)(圖4-5)。 IL-8是促血管發(fā)生因子，提示它的下調(diào)會影響皮膚中血管的形成。相 反，RNATES和IP-10則被認(rèn)為是白細(xì)胞的化學(xué)趨化因子，提示該增加的 表達(dá)(可能也有其他趨化因子)誘導(dǎo)白細(xì)胞向皮膚滲透，進(jìn)而引起炎癥并最 終導(dǎo)致皮滲。根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)答在角質(zhì)細(xì)胞和腫瘤組織(具有活躍的EGFR信號)中 的EGFR阻斷而調(diào)節(jié)的趨化因子表達(dá)模式導(dǎo)致白細(xì)胞的遷移/化學(xué)誘導(dǎo)， 這種現(xiàn)象能夠被干擾這些趨化因子的物質(zhì)/藥物抑制。實驗包括趨化性測 定，其中角質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在用EGFR抑制劑處理和用或者不用 TGFa或者TNFa刺激24小時后收集。這些條件培養(yǎng)基被放在Boyden室 的下層室而新分離的PBMC或者粒細(xì)胞鋪于上層室。然后通過測量特定時 間(speficic times)后在下層室中PBMC或粒細(xì)胞的量來監(jiān)測血細(xì)胞的趨化 現(xiàn)象。在一些實驗中，PBMC或者粒細(xì)胞預(yù)先被體外活化，以增強(qiáng)其遷移 活性。根據(jù)本發(fā)明，其表明，條件培養(yǎng)基中的趨化因子引起PBMC或者粒細(xì) 胞的趨化現(xiàn)象并且這代表在皮滲中可見的部分生物反應(yīng)。為顯示特異的趨化因子對趨化事件的應(yīng)答，向Boyden室下層室的條件培養(yǎng)基中加入針對趨化因子受體的特異抑制劑，并且通過與僅有條件培 養(yǎng)基對比來評估趨化性。此外，已經(jīng)證明趨化性是由趨化因子/趨化因子受體相互作用誘導(dǎo)的， 并且用趨化因子受體拮抗劑阻礙它們的相互作用能夠干擾血細(xì)胞的趨化 性。應(yīng)答EGFR阻礙的受調(diào)的趨化因子表達(dá)引起白細(xì)胞向小鼠皮膚的遷 移/化學(xué)誘導(dǎo)。此外，分析白細(xì)胞浸潤并且與趨化因子表達(dá)有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步證明小鼠皮膚中趨化因子水平隨著抗EGFR抑制劑處理而,皮調(diào) 控，這種調(diào)控伴隨著白細(xì)胞滲透。全身施用趨化因子受體拮抗劑已表明在 用抗EGFR治療的動物中干擾白細(xì)胞浸潤進(jìn)入動物皮膚，從而減少/阻止 皮疹的發(fā)展。根據(jù)本發(fā)明可以用抗EGFR物質(zhì)治療個體直到最初的皮膚毒性表征 出現(xiàn)，然后可以用抗趨化因子受體物質(zhì)局部處理受侵襲的病變皮膚來干擾 白細(xì)胞浸潤和減少皮膚毒性。在皮膚中局部施用趨化因子受體拮抗劑減少白細(xì)胞浸潤和皮膚毒性。 建議在臨床實踐中使用這些物質(zhì)治療經(jīng)受抗EGFR治療的患者的皮滲。已表明皮滲與患者對抗EGFR治療的應(yīng)答有關(guān)，因此趨化因子表ii^莫 式是比皮膚毒性本身更適合的應(yīng)答指示并且可以用作評估患者對抗EGFR 治療的應(yīng)答的診斷方法。這可以幫助在第一個治療周內(nèi)準(zhǔn)確找到可能從抗 EGFR治療獲益的患者。可以在用抗EGFR拮抗劑治療后第一周或者最初十天內(nèi)分析患者皮 膚中趨化因子水平的分子變化從而找出趨化因子表達(dá)是否會應(yīng)答EGFR 阻礙而被調(diào)控。這可以通過分析治療前和治療中的皮膚活組織切片來完成。 趨化因子水平應(yīng)答抗EGFR治療而被調(diào)控，那么調(diào)控的程度可以用來作為 預(yù)測患者是否會響應(yīng)這種治療的診斷方法。其表明，沒有或者極少的趨化 因子調(diào)控發(fā)生的患者是在以非最佳劑量的抗EGFR抑制劑治療，并被建議 應(yīng)該提高劑量直到調(diào)控出現(xiàn)。或者，如果不這樣選擇，可以將沒有趨化因子調(diào)控發(fā)生的患者轉(zhuǎn)移到 不同的治療。由發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的該調(diào)控在本文的皮滲發(fā)展過程中起著重要作用，因而 可以,皮用作*在早期時間點預(yù)測腫瘤患者中的皮疹的診斷標(biāo)記物*腫瘤中有效靶標(biāo)抑制的替代標(biāo)記物(因而也可能是臨床成果)，尤其用于在治療開始后不久準(zhǔn)確找到那些不大能從抗EGFR治療中受益的患者。*使用局部物質(zhì)來控制皮療的新療法的開發(fā)，所述局部物質(zhì)干擾由EGFR阻礙引起的趨化因子的化學(xué)誘導(dǎo)。由EGFR抑制劑(西妥昔單抗-c225，馬妥珠單抗=EMD72000-h425) 和其他調(diào)控腫瘤環(huán)境趨化因子、腫瘤炎癥和腫瘤生長抑制。沒有預(yù)測腫瘤患者對西妥昔單抗治療的響應(yīng)的生物標(biāo)記物。然而，在 由西妥昔單抗治療引起的痤瘡狀皮滲的程度和腫瘤應(yīng)答之間能觀察到三個 指征，即結(jié)腸的、胰腺的和頭的鱗狀細(xì)胞癌的明顯的關(guān)系。在標(biāo)準(zhǔn)的治療 劑量下，患者表現(xiàn)出沒有皮滲和不同嚴(yán)重程度(I-III級)的皮滲，提示由西 妥昔單抗引起的皮膚炎癥過程的程度歸結(jié)于個體患者的免疫處置，因而也 表明西妥昔單抗的免疫調(diào)控活性是對已觀察到的腫瘤應(yīng)答起作用的根本因 素。免疫細(xì)胞的傳輸和細(xì)胞表型是由趨化因子控制的，某些趨化因子表現(xiàn) 出細(xì)胞類型特異性的活性。本發(fā)明表明，抑制癌癥中的EGFR信號引起在這些癌癥中趨化因子環(huán) 境的改變和影響腫瘤炎癥狀況從而導(dǎo)致腫瘤生長抑制。根據(jù)本發(fā)明，趨化 因子在體外腫瘤細(xì)胞和初級角質(zhì)細(xì)胞中以相似的方式凈皮調(diào)控。對角質(zhì)細(xì)胞而言，進(jìn)行的實驗表明用單克隆抗體如西妥昔單抗或EMD72000或酪氨酸 激酶受體抑制劑(吉非替尼，易瑞沙@)封閉EGF受體會在不同的腫瘤細(xì)胞 系如A431中干擾EGFR依賴的信號級聯(lián)，代表不同的腫瘤指征。實驗工作表明處理腫瘤細(xì)胞系(如A431)調(diào)控趨化因子的體外表達(dá)。用 抗EGFR物質(zhì)處理肺瘤細(xì)胞受體，接下來用TGFa或TNFcx處理。在24 小時后在獲得的腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中評估分泌的趨化因子。用 L體inex珠技術(shù)來進(jìn)行評估。與在初級角質(zhì)細(xì)胞中得到的數(shù)據(jù)相似，在腫瘤細(xì)胞中應(yīng)答EGFR阻斷 幾個趨化因子被調(diào)控。IL-8 (白介素8)被持續(xù)下調(diào)(圖6)，而RNATES和 IP-10在用EGFR抑制劑處理的腫瘤細(xì)胞中被上調(diào)(圖7-8)。這些數(shù)據(jù)一起表明EGFR抑制劑在肺瘤細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞中引起相似 的信號通路調(diào)控。這確證了皮膚、角質(zhì)細(xì)胞和更精確的趨化因子水平可以 -波用作預(yù)測在癌癥患者中有效的抗EGFR治療的替代品的想法。IL-8在不同肺瘤細(xì)胞系的欄目中被評估并且發(fā)現(xiàn)其應(yīng)答EGFR阻斷 而持續(xù)下調(diào)(圖9)。這表明IL-8的水平是有效的抗EGFR治療的生物標(biāo)記。 期望評估正在進(jìn)行抗EGFR治療的患者血液中的IL-8水平，并且使用減 少的水平作為監(jiān)控抗EGFR物質(zhì)的藥效的診斷方法。如前面提到的，腫瘤組織中(有活躍的EGFR信號)應(yīng)答EGFR阻斷引 起的受調(diào)的趨化因子表達(dá)模式導(dǎo)致白細(xì)胞遷移/化學(xué)誘導(dǎo)。實驗包括趨化性測定，其中在經(jīng)過EGFR抑制劑處理后再用TGFoc 或TNFot刺激24小時后收集腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。該條件培養(yǎng)基被放 于下層室而新分離的PBMC或粒細(xì)胞被置于Boyden上層室。然后通過測 量特定時間后在下層室中PBMC或粒細(xì)胞的量來監(jiān)測血細(xì)胞的趨化現(xiàn)象。 在一些實驗中，PBMC或者粒細(xì)胞預(yù)先被體外活化，以增強(qiáng)其遷移活性。 這些實驗表明在條件培養(yǎng)基中的趨化因子引起PBMC和粒細(xì)胞的趨化性。作為本發(fā)明的一個結(jié)果，將特異的趨化因子(其負(fù)責(zé)趨化事件)、對趨 化因子受體的特異性抑制劑加入到條件培養(yǎng)基中置于Boyden室的下層室， 并且與僅條件培養(yǎng)基評估趨化性。通過趨化因子/趨化因子受體相互作用誘 導(dǎo)趨化性，并且通過趨化因子受體拮抗劑阻礙這種相互作用干擾血細(xì)胞的 趨化性。實驗包括用抗EGFR物質(zhì)處理腫瘤攜帶小鼠的體內(nèi)研究。在用抗 EGFR物質(zhì)處理后的第 一個星期內(nèi)分析腫瘤中趨化因子水平的調(diào)控。趨化 因子水平以與體外觀察到的相同的方式被調(diào)控。此外，分析腫瘤中的白細(xì) 胞浸潤，抗EGFR物質(zhì)誘導(dǎo)白細(xì)胞向腫瘤的浸潤以及它們的活性/分化狀 態(tài)?？梢杂眉?xì)胞活化/分化標(biāo)記的IHC來監(jiān)測后者。由于皮滲和響應(yīng)治療 間的關(guān)系，其提示趨化因子的調(diào)控發(fā)生于皮膚和癌癥周圍，并且這促成抗 EGFR物質(zhì)的作用機(jī)制。根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為在腫瘤+Z-EGFR抑制中趨化因子表達(dá)模式的改變的 廣泛監(jiān)測和將這些變化與免疫系統(tǒng)中趨化因子已知的細(xì)胞特異性相匹配提 供了關(guān)于腫瘤內(nèi)的趨化因子和白細(xì)胞可能有助于免疫控制腫瘤生長的第一 線索?；谶@一信息，可能在控制趨化因子表達(dá)通路的上游鑒定出除EGFR之外能誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的抗腫瘤功效而不依賴于EGFR阻斷的新的治療靼 點，或者4吏提高抗EGFR治療方法的抗腫瘤效果的目標(biāo)成為可能。因此， 闡明腫瘤中在EGFR信號抑制之后發(fā)生的趨化因子表達(dá)模式的變化成為 可能。在抗EGFR治療中觀察到的變化的趨化因子表達(dá)才莫式有一定的肺瘤 特異性。附圖簡述 圖1.角質(zhì)細(xì)胞中EGFR依賴的信號通路的抑制。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質(zhì)細(xì)胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFoc)刺激。24小時后，裂解 細(xì)胞并用蛋白質(zhì)印跡分析。分析表明用EGFR抑制劑處理導(dǎo)致以劑量依賴 的方式阻礙EGFR驅(qū)動的信號級聯(lián)。用EGFR抑制劑處理阻礙EGFR (Tyr 1068)和ERK1/2 (Thr 202/204)的磷酸化。圖2.角質(zhì)細(xì)胞中EGFR依賴的信號通路的抑制。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質(zhì)細(xì)胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFot或TNFa)刺激。24小時后，裂解 細(xì)胞并用蛋白質(zhì)印跡分析。分析表明EGFR抑制劑處理導(dǎo)致以劑量依賴的 方式阻礙EGFR驅(qū)動的信號級聯(lián)。用EGFR抑制劑處理誘導(dǎo)COX-2的表 達(dá)并阻礙STAT3的磷酸化。圖3,角質(zhì)細(xì)胞中分泌的IL-$水平的調(diào)控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質(zhì)細(xì)胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFa)刺激。24小時后，收集 細(xì)月包上清并且用Luminex技術(shù)定量IL-8的水平。分析表明用EGFR抑制 劑處理以劑量依賴的方式下調(diào)IL-8。圖4.角質(zhì)細(xì)胞中分泌的RANTES水平的調(diào)控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質(zhì)細(xì)胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFa)刺激。24小時后，收集 細(xì)胞上清并且用Luminex技術(shù)定量RANTES的水平。分析表明用EGFR 抑制劑處理以劑量依賴的方式上調(diào)RANTES。圖5.角質(zhì)細(xì)胞中分泌的IP-10水平的調(diào)控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質(zhì)細(xì)胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFa或TNFa)刺激。24小時后，收集 細(xì)胞上清并且用Luminex技術(shù)定量IP-10的水平。分析表明EGFR抑制劑 處理以劑量依賴的方式上調(diào)IP-IO。圖6.A431中分泌的IL-8水平的調(diào)控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理A431，并且 用或者不用不同的生長因子(TGFot或TNFoc)刺激。24小時后，收集細(xì)胞 上清并且用Luminex技術(shù)定量IL-8的水平。分析表明EGFR抑制劑處理 以劑量依賴的方式下調(diào)IL-8。圖7.A431中分泌的RANTES水平的調(diào)控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗，馬妥珠單抗或易瑞沙)處理A431，然 后用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFa)刺激。24小時后，收集細(xì) 胞上清并且用Luminex技術(shù)定量RANTES的水平。分析表明用EGFR抑 制劑處理以劑量依賴的方式上調(diào)RANTES。圖8.A431中分泌的IP-10水平的調(diào)控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗，馬妥珠單抗或易瑞沙)處理A431，然 后用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFoc)刺激。24小時后，收集細(xì) 胞上清并且用Luminex技術(shù)定量IP-10的水平。分析表明EGFR抑制劑處理以劑量依賴的方式上調(diào)IP-IO。 圖9.在不同腫瘤細(xì)胞系中分泌的IL-8水平的調(diào)控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗或馬妥珠單抗)處理不同的腫瘤細(xì)胞系 (DiFi、 HT29、 A431、 MCF-7、 PC-3和U87MG)，并且用TGFoc刺激。 24小時后，收集細(xì)胞上清并且用Luminex技術(shù)定量IL-8的水平。分析表 明EGFR抑制劑處理在研究的所有腫瘤細(xì)胞系中以劑量依賴的方式下調(diào) IL-8。腫瘤細(xì)胞Cmab％對照MmabV。對照DiFi1628HT292430A4311315MDA MB 468tbdtbdMCF-73149PC-35376U87MG6358應(yīng)答西妥昔(Cmab)或馬妥珠單抗(Mmab)的IL-8水平。 用100 ng/ml Cmab或Mmab處理細(xì)胞并且用100 ng/ml TGF oc刺激; 實驗次數(shù)=權(quán)利要求
1.預(yù)測在患者中與癌癥治療相關(guān)聯(lián)或有關(guān)的皮膚刺激的發(fā)作和強(qiáng)度的方法，該方法包括(i)用標(biāo)準(zhǔn)方法確定第一皮膚組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該探針取自使用抗癌物質(zhì)開始治療之前的患者，所述抗癌物質(zhì)直接針對利用表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細(xì)胞，(ii)確定源于所述患者的第二皮膚探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該探針從使用所述抗癌物質(zhì)治療開始之后的時間獲取，(iii)任選的確定第三和更多的皮膚探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該探針在比步驟(ii)的各個前驅(qū)探針更晚的時間從患者獲取，(iv)將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的皮膚探針的各個趨化因子表達(dá)模式與步驟(i)的皮膚探針表達(dá)模式比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中哪些趨化因子在性質(zhì)和/或數(shù)量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅(qū)探針中的趨化因子模式已經(jīng)發(fā)生了變化；(v)從趨化因子模式的變化預(yù)測由使用所述抗癌物質(zhì)治療引發(fā)的在其后時間的皮膚疾病的強(qiáng)度和發(fā)生。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述皮膚刺激是皮滲。
3. 預(yù)測患癌癥患者對使用抗癌物質(zhì)治療的腫瘤應(yīng)答的方法，該方法包 括..(i) 用標(biāo)準(zhǔn)方法確定第一組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該探針采 集自使用抗癌物質(zhì)治療開始之前的患者，所述抗癌物質(zhì)直接針對利用 表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細(xì)胞，(ii) 確定源于所述患者的第二組織探針的趨化因子表達(dá)^^式，其中該 探針在開始使用所述抗癌物質(zhì)治療后的時間獲取，(iii) 任選的確定第三和更多的組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該 探針在比步驟(ii)的各個前驅(qū)探針更晚的時間從患者獲取，(iv) 將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的組織探針的各個趨化因子表達(dá)模式與步驟(i)的組織探針的表達(dá)模式比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中哪 些趨化因子在性質(zhì)和/或數(shù)量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅(qū)探針的趨化因子模式已經(jīng)發(fā)生了變化；(v)從所述組織探針的趨化因子模式的變化預(yù)測患者對使用所迷抗癌 物質(zhì)治療的腫瘤應(yīng)答的可能性和強(qiáng)度。
4. 確定用于治療癌癥的抗癌物質(zhì)在患者中的最適劑量的方法，該方法 包括(i) 用標(biāo)準(zhǔn)方法確定第一組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中該探針采 集自使用抗癌物質(zhì)治療開始之前的患者，所述抗癌物質(zhì)直接針對利用 表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細(xì)胞，(ii) 確定源于所述患者的第二組織探針的趨化因子表達(dá)模式，其中在 開始使用所述抗癌物質(zhì)治療后的時間獲取該探針，(iii) 任選的確定第三和更多的組織探針的趨化因子表^^莫式，其中在 比步驟(ii)的各個前驅(qū)探針更晚的時間從患者獲取該探針，(iv) 將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的組織探針的各個趨化因子表達(dá)模式 與步驟(i)的組織探針表達(dá)模式比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中哪些 趨化子在性質(zhì)和/或數(shù)量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅(qū)探針 中的趨化因子模式已經(jīng)發(fā)生了變化；(v) 根據(jù)所述組織探針的趨化因子模式的變化確定向患者施用的抗癌 物質(zhì)的劑量，和任選的(vi) 重復(fù)步驟(i)-(v)以優(yōu)化向患者施用的抗癌物質(zhì)的劑量。
5. 權(quán)利要求3或4的方法，其中所述探針衍生自腫瘤組織。
6. 權(quán)利要求3或4的方法，其中所述探針衍生自皮膚組織。
7. 權(quán)利要求l-6的任一項的方法，其中步驟(ii)的探針在開始使用所述 抗癌物質(zhì)治療后l-10天內(nèi)獲取。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中步驟(ii)的探針在開始使用所述抗癌物質(zhì)治 療后5-7天內(nèi)獲取。
9. 權(quán)利要求1-8的任一項的方法，其中抗癌物質(zhì)是EGFR抑制劑。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中EGFR抑制劑是抗EGFR抗體。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中抗EGFR抗體是Mab c225 (西妥昔單抗) 或Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l-ll的任一項的方法，其中與未治療的患者相比使 用抗癌物質(zhì)治療引起趨化因子的表達(dá)增加。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l-ll的任一項的方法，其中與未治療的患者相比使 用抗癌物質(zhì)治療引起趨化因子的表達(dá)減少。
14. 權(quán)利要求1-13的任一項的方法，其中涉及下列趨化因子的至少一 種IL-8、 MCP-1、 RANTES和IP-IO。
15. 對患者中利用EGFR的癌癥的治療有效性進(jìn)行體外早期監(jiān)測的方 法，所述方法在用抗癌物質(zhì)治療開始前和治療期間的最初1-10天通過 確定腫瘤患者的皮膚組織和/或腫瘤組織和/或血清的探針中趨化因子 模式進(jìn)行。
16. 對患者中與利用EGFR癌癥的治療有關(guān)的皮膚刺激發(fā)生進(jìn)行體外 早期監(jiān)測的方法，所述方法通過在用抗癌物質(zhì)治療開始前和治療期間 的最初1-7天內(nèi)確定腫瘤患者的皮膚組織探針的趨化因子模式進(jìn)行。
17. 權(quán)利要求15或16的方法，其中抗癌物質(zhì)是EGFR抑制劑。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中EGFR抑制劑是抗EGFR抗體。
19. 權(quán)利要求1S的方法，其中抗EGFR抗體是Mab c225 (西妥昔單 抗)或Mab h425 (EMD72000，馬妥珠單抗)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求15-19的任一項的方法，其中與未治療的患者相比 使用抗癌物質(zhì)治療？ 1起趨化因子的表達(dá)增加。
21. 根據(jù)權(quán)利要求15-19的任一項的方法，其中與未治療的患者相比 使用抗癌物質(zhì)治療引起趨化因子的表達(dá)減少。
22. 根據(jù)權(quán)利要求15-21的任一項的方法，其中涉及下列趨化因子中 的至少一種IL-8、 MCP-1、 RANTES和IP-IO。
23. 趨化因子用作確定所述治療的有效性、和/或伴隨所述治療的皮膚 刺激發(fā)生的可能性的體外診斷標(biāo)記的用途，所述趨化因子在用抗癌物質(zhì)治療癌癥期間是體內(nèi)上調(diào)或下調(diào)的，其中所述癌癥利用EGFR并且所述抗癌 物質(zhì)是EGFR抑制劑。
24. 趨化因子用于鑒定所述趨化因子表達(dá)的上游耙標(biāo)的用途，所述趨 化因子在用抗癌物質(zhì)治療癌癥期間是體內(nèi)上調(diào)或下調(diào)的，所述靶標(biāo)適用于 開發(fā)和制備靶向所述靶標(biāo)的藥物用于單獨的或與所述抗癌物質(zhì)組合的治療 利用EGFR的癌癥，其中所述抗癌物質(zhì)是EGFR抑制劑。
25. 權(quán)利要求23或24的用途，其中所述抗癌物質(zhì)是Mab c225 (西妥 昔單抗)或Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗)。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過化學(xué)抑制劑或單克隆抗體對利用表皮生長因子(EGFR)的腫瘤的診斷和治療。本發(fā)明還涉及與使用抗癌物質(zhì)治療利用EGF受體的腫瘤細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的皮膚刺激，優(yōu)選皮疹。本發(fā)明還涉及在基于使用EGFR抑制劑，尤其是抗EGFR抗體的治療中預(yù)測患者中腫瘤治療/腫瘤應(yīng)答的有效性的方法。本發(fā)明還涉及在EGFR相關(guān)腫瘤的治療中確定抗癌物質(zhì)最適劑量的方法。
文檔編號G01N33/50GK101283275SQ200680037726
公開日2008年10月8日 申請日期2006年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者A·蘇特, J·拜倫斯 申請人:默克專利有限公司