專利名稱：用于診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)檢測(cè)試劑，特別是一種以受檢者尿液為樣本，檢測(cè)受檢者是
否可能患有膀胱腫瘤的蛋白芯片，以及這種芯片的制備方法。更為確切講本發(fā)明是一種采
用免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng) 用于膀胱腫瘤的免疫標(biāo)記試劑。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)生是多個(gè)基因和蛋白發(fā)生改變的結(jié)果，多認(rèn)為多指標(biāo)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢 測(cè)可以彌補(bǔ)單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)的不足，從而提高診斷的準(zhǔn)確性。我國(guó)在1997年開(kāi)始立項(xiàng)對(duì)生 物芯片技術(shù)的研究，近年來(lái)發(fā)展十分迅猛，目前已取得巨大的進(jìn)展，且已在生命科學(xué)領(lǐng)域中 發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)芯片的出現(xiàn)為提高腫瘤的診斷水平提供了技術(shù)基礎(chǔ)，具有高通量、高靈敏 度、高特異性和微量化的優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外雖已投入了大量的資金進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但目前尚無(wú)膀胱癌 診斷相關(guān)蛋白芯片產(chǎn)品問(wèn)世。另?yè)?jù)報(bào)道，美國(guó)FDA至今尚未通過(guò)一項(xiàng)用于膀胱腫瘤的蛋白 芯片產(chǎn)品認(rèn)證許可。 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的20%。男女發(fā)病比例 約為4 : 1，60歲以后發(fā)病率增高，近年來(lái)發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，淺表性膀胱癌占70%以上，且 術(shù)后復(fù)發(fā)率高，初次治療后復(fù)發(fā)率高達(dá)50% 70%。因此要求患者定期隨訪，平均每1 3月需復(fù)查一次膀胱鏡，使患者非常痛苦。據(jù)測(cè)算平均每年每個(gè)膀胱癌患者的醫(yī)療費(fèi)高達(dá) 數(shù)萬(wàn)元，再加上患者喪失勞動(dòng)力，直接威脅著國(guó)民的健康，給經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展造成了嚴(yán)重的 損失。膀胱癌的分期分級(jí)不同其相應(yīng)的預(yù)后亦極不相同，若早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)予以治療，患者 可獲得很高的5年生存率，甚至完全得到治愈。在目前使用的診斷方法中，膀胱鏡檢查和尿 脫落細(xì)胞學(xué)檢查是膀胱癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是膀胱鏡畢竟是一種侵入性檢查，患者較為痛 苦，接受性差。同時(shí)對(duì)膀胱頂部及膀胱前壁的腫瘤有時(shí)不易發(fā)現(xiàn)，且尿道狹窄患者無(wú)法行膀 胱鏡檢查；尿脫落細(xì)胞學(xué)雖為無(wú)創(chuàng)的診斷方法，但陽(yáng)性率受多種因素的影響，其敏感性只有 18. 4% 62. 0%，其效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿意。目前尚無(wú)針對(duì)膀胱癌簡(jiǎn)便易行可靠的早期篩 查和診斷方法。因此，探索新的無(wú)創(chuàng)診斷方法，提高膀胱腫瘤的診斷水平、尤其是早期診斷 水平，顯得尤為迫切，而且具有良好的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益，并且有很好的市場(chǎng)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種受檢者尿液為樣本，檢測(cè)受檢者是否患有膀胱腫瘤的蛋白芯片。
本發(fā)明的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片由下述物質(zhì)組成a.在固相載體上包被有 Survivin抗原蛋白、纖維粘連抗原蛋白Fibronectin，以及基質(zhì)核金屬蛋白酶9即匪P9三 種腫瘤標(biāo)志物的單克隆抗體；b.在封閉容器內(nèi)貯藏的偶聯(lián)于膠體金上的Survivin抗體、 Fibronectin抗體及匪P9抗體。 本發(fā)明的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片中，在固相載體上包被以1% BSA稀釋的三種 腫瘤標(biāo)志物Survivin蛋白、纖維粘連蛋白、基質(zhì)核金屬蛋白酶9的單克隆抗體，三者之間按1:1: 2的比例包被，其相對(duì)量為分別為lOii g/ml、10ii g/ml、20ii g/ml。
本發(fā)明的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片的制備方法為
a.制備標(biāo)記抗體所用的膠體金；b.用已制備好的膠體金標(biāo)記Survivin抗體、Fibronectin抗體及匪P9抗原，并將 標(biāo)記后的膠體金溶于膠體金保存液中，再將其置于密封容器內(nèi)保存。
c.制備用于包被三種瘤標(biāo)的硝酸纖維素膜固相載體； d.將三種腫瘤標(biāo)志物分別包被于固相載體上。將Survivin蛋白、纖維粘連蛋白、 基質(zhì)核金屬蛋白酶9的單克隆抗體以1% BSA稀釋好，室溫平衡30min后，用微陣列打點(diǎn)機(jī) 點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上。 腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生，存在于組織或體液中，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的 一類物質(zhì)。膀胱與外界相通，檢測(cè)尿液中的腫瘤標(biāo)志，易于操作，患者容易接受，且方便進(jìn)行 大規(guī)模普查。雖然近年來(lái)，一些單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)被許多學(xué)者所重視并得到研究，已獲得 一些進(jìn)展，但因其單獨(dú)應(yīng)用受到假陽(yáng)性率或假陰性率較高的干擾，不能滿意地解決臨床診 斷中所要求較高的敏感度和高的特異度指標(biāo)，這限制了其應(yīng)用。因此聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)腫瘤標(biāo) 志物來(lái)提高診斷的準(zhǔn)確性則顯得尤為重要。 相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示尿液中Survivin蛋白診斷膀胱癌的敏感性為95X，特異性 為93% ;尿液中Fibronectin診斷浸潤(rùn)性膀胱移行上皮癌的靈敏度為76. 47% 100%， 特異度為87. 22%，診斷正確率僅為86. 96% ;E。雖然NUTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)匪P-9在高分期膀胱 癌中明顯增高，主要降解IV型膠原、明膠和纖維粘連蛋白，因此匪P9對(duì)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn) 移至關(guān)重要。臨床實(shí)驗(yàn)表明匪P9高表達(dá)患者的預(yù)后與低表達(dá)患者的預(yù)后有顯著的差異， 故匪P9更是判斷浸潤(rùn)性膀胱移行上皮癌預(yù)后的重要指標(biāo)。通過(guò)ELISA法分別檢測(cè)了以上 三種腫瘤標(biāo)志物在膀胱癌患者和健康人群尿液中的含量，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測(cè)三種腫瘤標(biāo)志 物進(jìn)行臨床診斷可使其檢測(cè)靈敏度顯著增高，而診斷的符合率可上升20%。這些結(jié)果為將 Survivin、 Fibronectin、和MMP-9聯(lián)合應(yīng)用研發(fā)診斷性蛋白芯片診斷膀胱癌提供了科學(xué)依 據(jù)。而且實(shí)驗(yàn)還表明將前述的三種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，其診斷準(zhǔn)確性明顯高于單獨(dú)一種 標(biāo)志物的檢測(cè)組合。
具體實(shí)施例方式以下提供
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的診斷性蛋白芯片的檢測(cè)原理為雙抗夾心法。具體操作過(guò)程為
1、制備膠體金。①用50ml量筒量取35ml的1X檸檬酸三鈉預(yù)熱至6(TC ;②用 1000ml量筒量取975ml去離子水，加入圓底燒瓶中；③用25ml量筒量取25ml的1%氯金 酸加入盛水的圓底燒瓶中并搖勻，加入時(shí)注意勿沾內(nèi)壁；④將燒瓶在電熱套中加熱，直到 沸騰并持續(xù)lmin ;⑤在搖晃燒瓶時(shí)將預(yù)熱的檸檬酸三鈉迅速加入燒瓶，加入時(shí)注意勿沾內(nèi) 壁；⑥加快搖晃的速度，使氯金酸與檸檬酸三鈉充分反應(yīng)，液體金黃色變?yōu)楹谏僮優(yōu)榫?紅色，持續(xù)加熱10min ;⑦10min后關(guān)閉電源，將燒瓶取出蓋上玻璃皿降溫；⑧直到溫度降至 室溫，測(cè)其0D值；⑨測(cè)的最大波長(zhǎng)必須在526士2nm。 2、包被抗體。硝酸纖維素膜上分區(qū)包被Survivin、Fibronectin、和匪P-9(用1% BSA稀釋)的單克隆抗體，其抗體相對(duì)量分別為10ii g/ml、10ii g/ml、20ii g/ml。
3、制作金標(biāo)抗體。①將制備的裸金分裝，200ml/瓶，放入冰水??；②調(diào)ffl值，每瓶 加入0. 1M K2C03約8ml，搖勻；③配制lmg/ml的抗體每瓶加1. 2ml，滴加二抗每次加0. 6ml， 邊加邊搖，搖動(dòng)時(shí)不要起泡，滴加速度約為5 10滴/分鐘，滴加完后放置30min ; 加入 已配好并過(guò)濾的10X的BSA 20ml/瓶，1滴/秒，邊加邊搖，放置5min ;⑤加入1X的PEG， 40ml/瓶，1滴/秒，邊加邊搖，放置5min，過(guò)夜。 4、點(diǎn)樣。將受檢者的尿液點(diǎn)樣，待完全滲入后；加1滴PBST洗滌液，使之與包被在 硝酸纖維素膜上的Survivin、 Fibronectin、和匪P-9單抗特異結(jié)合，形成抗原抗_體復(fù)合 物。 5、滴加金標(biāo)抗體。加入數(shù)滴經(jīng)膠體金標(biāo)記過(guò)的Survivin、 Fibronectin、和匪P-9
單克隆抗體，待滲完90秒后，加1滴PBST洗滌液，與以上抗原抗-體復(fù)合物特異結(jié)合，完成
對(duì)標(biāo)本中抗原_抗體復(fù)合物的金染色。 6、芯片閱讀儀掃描反應(yīng)后的芯片，記錄灰度值。 檢測(cè)實(shí)例 分別取正常人尿樣和已經(jīng)證實(shí)患有膀胱癌病人的尿樣各五份，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn) 組。嚴(yán)格按照上述步驟操作，進(jìn)行對(duì)比和驗(yàn)證本蛋白芯片的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在蛋白芯 片上，以正常人尿液為樣品檢測(cè)的反應(yīng)點(diǎn)，即對(duì)照點(diǎn)的色度沒(méi)有變化；而以膀胱癌患者尿液 為樣品檢測(cè)的反應(yīng)點(diǎn)，其色度明顯濃于對(duì)照點(diǎn)，參見(jiàn)表1 。
表1不同尿樣濃度的灰度值比較
對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組試樣編號(hào)檢測(cè)灰度值試樣編號(hào)檢測(cè)灰度值
17.30611.080
26.51321.051
36.49231.040
46.53341.018
57.72351.011 實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)之間的色度也因尿液中三種蛋白的含量高低不同而深淺 不同，且檢測(cè)樣品的灰度值隨著被檢樣品三種蛋白濃度的增加而呈現(xiàn)良好的遞增關(guān)系，表 現(xiàn)出樣品濃度對(duì)其相應(yīng)芯片閱讀儀掃描值的相關(guān)型曲線，說(shuō)明芯片閱讀儀掃描結(jié)果值隨著 不同濃度樣品的增加而增加，且有著良好的相關(guān)性。而且實(shí)驗(yàn)還表明將前述的三種腫瘤標(biāo) 志物聯(lián)合檢測(cè)，其診斷準(zhǔn)確性明顯高于單獨(dú)一種標(biāo)志物的檢測(cè)組合。
權(quán)利要求
診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片，其特征是該芯片至少由下述物質(zhì)組成a.在固相載體上包被有Survivin抗原蛋白、纖維粘連抗原蛋白Fibronectin，以及基質(zhì)核金屬蛋白酶9即MMP9三種腫瘤標(biāo)志物的單克隆抗體；b.在封閉容器內(nèi)貯藏的偶聯(lián)于膠體金上的Survivin抗體、Fibronectin抗體及MMP9抗體。
2. 權(quán)利要求1所述的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片，其特征是固相載體上包被以1% BSA 稀釋的三種腫瘤標(biāo)志物Survivin蛋白、纖維粘連蛋白、基質(zhì)核金屬蛋白酶9的單克隆抗體 的相對(duì)量為分別為1:1:2。
3. 權(quán)利要求1或2所述的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片的制備方法，其特征是a. 制備標(biāo)記抗體所用的膠體金；b. 用已制備好的膠體金標(biāo)記Survivin抗體、Fibronectin抗體及匪P9抗原，并將標(biāo)記 后的膠體金溶于膠體金保存液中，再將其置于密封容器內(nèi)保存。c. 制備用于包被三種瘤標(biāo)的硝酸纖維素膜固相載體；d. 將三種腫瘤標(biāo)志物包被于固相載體上。將Survivin蛋白、纖維粘連蛋白、基質(zhì)核金 屬蛋白酶9的單克隆抗體以1% BSA稀釋好，室溫平衡30min后，用微陣列打點(diǎn)機(jī)點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種以受檢者尿液為樣本，檢測(cè)受檢者是否可能患有膀胱腫瘤的蛋白芯片，以及這種芯片的制備方法。本發(fā)明的芯片至少由下述物質(zhì)組成a.在固相載體上包被有Survivin抗原蛋白、纖維粘連抗原蛋白Fibronectin，以及基質(zhì)核金屬蛋白酶9即MMP9三種腫瘤標(biāo)志物的單克隆抗體；b.在封閉容器內(nèi)貯藏的偶聯(lián)于膠體金上的Survivin抗體、Fibronectin抗體及MMP9抗體。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101718792SQ20091026055
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者王志平 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)