一組活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一組活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，被列為我國(guó)重大傳染病之一。目前 結(jié)核分枝桿菌感染人群基數(shù)大，發(fā)病率高，至今尚無(wú)有效的快速血清學(xué)診斷方法，給結(jié)核病 防治工作帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，在結(jié)核病疫情控制面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)的今天，篩選結(jié)核病新型 生物標(biāo)志候選物，尋求一種新的診斷技術(shù)、新藥和新疫苗的開發(fā)已迫在眉睫。
[0003] 結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療能夠提高患者治愈率，減少傳染源，較好地控制 結(jié)核分枝桿菌的傳播與擴(kuò)散，從而降低結(jié)核病對(duì)社會(huì)及國(guó)家產(chǎn)生的危害。目前診斷結(jié)核病 常用的方法有：1、痰涂片抗酸染色檢查:對(duì)診斷結(jié)核病具有重要臨床價(jià)值，但陽(yáng)性率僅達(dá) 30%左右，且不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌感染;2、傳統(tǒng)培養(yǎng)法:操作繁瑣且耗 時(shí)長(zhǎng)，從臨床標(biāo)本分離出結(jié)核分枝桿菌的時(shí)間通常2 6周，不利于疾病的早發(fā)現(xiàn)及診斷；3、 自動(dòng)化快速培養(yǎng)法:快速(1~2周）、可靠、安全，但是需要昂貴的儀器設(shè)備;4、聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)-單鏈構(gòu)想多態(tài)性分析法(PCR-SSCP法）：其影響因素較多(DNA片段長(zhǎng)度、凝膠濃度等），可 重復(fù)性較差，在臨床工作中未得到廣泛應(yīng)用;5、RT-PCR法:對(duì)檢測(cè)條件要求高，限制其推廣； 6、寡核苷酸探針雜交法:是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的一種快速方法，但存在一定假陰性率和假 陽(yáng)性率，且試劑價(jià)格相對(duì)昂貴，未得到臨床推廣;7、基因芯片法:具有時(shí)限短、所需樣本少、 熱循環(huán)和冷卻效率高等優(yōu)點(diǎn)，但因分析軟件要求高，芯片的制作成本高等缺點(diǎn)限制其應(yīng)用； 8、GeneXp ert MTB/RIF對(duì)肺結(jié)核痰涂陰病人及耐利福平結(jié)核菌的檢測(cè)可以在2小時(shí)內(nèi)完成， 為肺結(jié)核快速診斷提供便利，但在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，應(yīng)用仍受限制。肺外結(jié)核病的診 斷方法更為有限。早期檢測(cè)方法滯后阻礙活動(dòng)期結(jié)核病患者的及時(shí)診治，不利于挽救病人 的生命及結(jié)核病傳染源的控制。臨床上急需高效、價(jià)廉、易于推廣的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，以評(píng) 估疾病狀態(tài)是否活動(dòng)并可作為新型抗結(jié)核藥物試驗(yàn)終點(diǎn)參考。目前結(jié)核分枝桿菌感染宿主 后血液免疫學(xué)標(biāo)志物篩選國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了多方位研究，部分商業(yè)試劑已用于結(jié)核病檢測(cè)，但 均未獲得WHO結(jié)核專家組認(rèn)可大范圍運(yùn)用，關(guān)于活動(dòng)性結(jié)核病新型生物標(biāo)志候選物的篩選 與鑒定尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一組活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物 及其用途，該組結(jié)核病診斷標(biāo)志物來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的15個(gè)抗原，判斷被檢人是否為活動(dòng) 結(jié)核病，檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)組合診斷活動(dòng)性結(jié)核病的最佳工作點(diǎn)的特異 性為90.3 %，靈敏度為85.4%，均高于現(xiàn)有技術(shù)中活動(dòng)結(jié)核病診斷的指標(biāo)，且本技術(shù)為血清 學(xué)檢測(cè)，標(biāo)本容易獲取，適用于各種可疑活動(dòng)性結(jié)核病，包括活動(dòng)性肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診 斷。
[0005] 其具體技術(shù)方案為：
[0006] 一組活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物，包括抗MT1560IgG抗體、抗Rv0049IgM抗體、抗 Rv0270IgM 抗體、抗 Rv0350IgG 抗體、抗 Rv0350IgM 抗體、抗 Rv0494IgM 抗體、抗 Rvl597IgM 抗 體、抗Rv2450cIgM 抗體、抗Rv2511 IgG 抗體、抗Rv2688cIgM 抗體、抗Rv3480cIgM 抗體，抗 Rvl860IgG抗體、抗Rvl876IgM抗體、抗Rv2031cIgG抗體和抗Rv2352cIgM抗體，其序列對(duì)應(yīng) SEQ：ID：N0：l-SEQ：ID：N0：15〇
[0007] 本發(fā)明所述活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物在篩選活動(dòng)性結(jié)核病診斷產(chǎn)品中的用途。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0009] 本發(fā)明通過(guò)商品化MtbProtTM結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)組芯片篩選活動(dòng)性結(jié)核病診斷 分子標(biāo)志物，該芯片涵蓋>95%的編碼基因，包含4262個(gè)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白。臨床血清 樣本包括正常對(duì)照組、潛伏感染組以及活動(dòng)性肺結(jié)核組，分別獨(dú)立地與芯片反應(yīng)，以檢測(cè)實(shí) 驗(yàn)組中針對(duì)某一種或幾種抗原蛋白，具有普遍性的特異性的抗結(jié)核抗體（IgG或IgM)?；?初篩結(jié)果，選擇差異較為明顯的94個(gè)結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)及本研究團(tuán)隊(duì)既通過(guò)雙向凝膠電 泳技術(shù)分離獲得的6個(gè)結(jié)核分枝桿菌差異表達(dá)蛋白質(zhì)，自制含100個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)小芯 片，送公司點(diǎn)片，每個(gè)蛋白重復(fù)兩點(diǎn)點(diǎn)制，進(jìn)行200余份血清樣本的臨床驗(yàn)證，最終獲得15個(gè) 診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的候選標(biāo)志物（MT1560IgG，Rv0049IgM，Rv0270IgM，Rv0350IgG， Rv0350IgM，Rv0494IgM，Rvl597IgM，Rvl860IgG，Rvl876IgM，Rv2031cIgG，Rv2352cIgM， 1^2450(31 8]\1，1^2511186，1^2688(318]\1和1^3480(318]\〇。聯(lián)合分析這15個(gè)蛋白質(zhì)相應(yīng)抗體的檢 測(cè)結(jié)果，判斷被檢人是否為活動(dòng)性結(jié)核病，結(jié)果表明，本發(fā)明提供小芯片輔助診斷活動(dòng)性肺 結(jié)核的最佳工作點(diǎn)的特異性為90.3%，靈敏度為85.4%，均高于現(xiàn)有技術(shù)中活動(dòng)性結(jié)核病 診斷的指標(biāo)。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為基于MtbProtTM蛋白質(zhì)芯片的活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與篩選流程 示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。
[0012] 一、血清診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證
[0013 ]( - )基于MtbPr 01TM蛋白質(zhì)芯片的結(jié)核病診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與篩選：
[0014] 1.檢測(cè)原理:購(gòu)買博柳生物公司MtbProtTM結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)組芯片，該芯片包 含4262個(gè)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白，涵蓋>95%的編碼基因。臨床血清樣本包括正常對(duì)照組、 結(jié)核潛伏感染組、以及活動(dòng)性結(jié)核病組，分別獨(dú)立地與芯片反應(yīng)，以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組中針對(duì)某一 種或幾種抗原蛋白，具有普遍性的特異性的抗結(jié)核抗體（IgG或IgM)，這些抗原蛋白可以作 為診斷標(biāo)志物來(lái)表征疾病狀態(tài)。
[0015] 2.實(shí)驗(yàn)操作人：由芯片服務(wù)組生產(chǎn)人員執(zhí)行操作。
[0016] 3.流程圖如圖1所示。
[0017] 4.實(shí)驗(yàn)操作步驟：
[0018] 1)預(yù)封閉：使用芯片孵育盒(廣州柳博公司自制），加入5ml封閉液，將待質(zhì)控芯片 從-80°C取出，正面朝上置于孵育盒中；再橫向放在側(cè)擺搖床（國(guó)產(chǎn)）上，50-60rpm，室溫， 10min〇
[0019] 2)封閉：倒棄封閉液，迅速加入5ml新的封閉液，側(cè)擺搖床20-30rpm，室溫lh。
[0020] 3)血清樣本孵育：倒棄封閉液，迅速加入預(yù)先準(zhǔn)備好的蛋白樣本孵育液3ml，側(cè)擺 搖床20-30rpm，室溫3h。蛋白樣本孵育液:3ml孵育液加入30μ1血清(新鮮制備或凍存于-80 度，由專利申請(qǐng)人提供）。
[0021 ] 4)清洗:將芯片取出，置于加入有40ml清洗液的芯片清洗盒，劇烈晃動(dòng)10-15次，并 更換清洗液，再次劇烈晃動(dòng)10-15次，充分去除游離一抗;再次更換清洗液，至于水平搖床 上，60_70rpm，5min每次，清洗3次。
[0022] 5)二抗孵育：倒棄清洗液，迅速加入預(yù)先準(zhǔn)備好的二抗孵育液3ml，側(cè)擺搖床20- 30rpm，避光，室溫45min。二抗孵育液:使用anti-human IgG焚光二抗(549anti-人IgG，激發(fā) 光532nm，或635anti_人IgM，激發(fā)光635nm，Jackson ImmunoResearch)，孵育液稀釋抗體至 其工作液濃度，總體積為3ml。二抗孵育時(shí)避光。
[0023] 6)清洗:同步驟"4"。注意該過(guò)程應(yīng)避光操作。
[0024] 7)完成后用ddH20清洗5min X 2次，并沖洗10s。注意該過(guò)程應(yīng)避光操作。
[0025] 8)干燥